用于癌症、炎性病症和自身免疫性病症的治疗和诊断的制作方法

专利名称：：用于癌症、炎性病症和自身免疫性病症的治疗和诊断的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肿瘤生长领域。本发明涉及肿瘤相关巨噬细胞的活性和特征，及其用于癌症和肿瘤生长的诊断和治疗的用途。本发明还涉及免疫学领域及肿瘤相关巨噬细胞和脂肪组织巨噬细胞活性和特征用于治疗自身免疫性和炎性病症的用途。
背景技术：
：在美国，恶性肿瘤(癌症)是位居心脏病之后的一种主要死亡原因。癌症的特征为自正常组织衍生的异常或赘生性细胞的数目增加，所述细胞增殖形成肿瘤块；这些赘生性肿瘤细胞侵入邻近组织；及产生恶性细胞，所述恶性细胞最终经血液或淋巴系统扩散至局部淋巴结并经称为转移的过程扩散至远处。在癌性状态，细胞在正常细胞不会生长的条件下增殖。癌症自身表现为极其多种形式，特征为不同程度的侵袭力和进攻性。人类肿瘤由恶性和非恶性这两种细胞构成。后一类包括基质成纤维细胞、内皮细胞和白细胞。肿瘤相关巨噬细胞(“ΤΑΜ”)是大多数实体瘤中白细胞浸润物的主要组分。在有些情况中，TAM能占到总肿瘤块的50%(Kelly等1988;0，SullivanandLewis1994；Leek等1994；Bingle等2002)。已经将乳腺癌和其它人类肿瘤中高水平的巨噬细胞浸润物与差的预后联系起来。对乳腺癌鼠模型的分析支持TAM促进肿瘤生长和转移的观点。例如，在乳腺癌遗传模型中抑制TAM分化降低肿瘤进展的速率且显著减轻肺中的转移形成(Lin等2001)。TAM可促成人乳腺癌生长的一种建议机制是通过对血管发生性因子(诸如血管内皮生长因子)的诱导；已经将高水平的TAM与乳腺瘤内升高的血管密度联系起来(Leek等1996;Lin等2006)。已经显示了髓样谱系造血细胞(包括ΤΑΜ)刺激血管发生，或是直接通过分泌血管发生性因子或是间接通过生成胞外基质降解性蛋白酶，其继而释放被隔绝的血管发生性因子(综述见Lewis，C.Ε.&Pollard，Τ·W.Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.CancerResearch66:605-612(2006)；及Naldini，A.&Carraro，F.RoleofinflammatorymediatorsinanRioRenesis.CurrDrugTargetsInflammAllergy4:3-8(2005))。在髓样细胞谱系中，自荷瘤小鼠的脾分离的⑶Ilb+Grl+祖细胞在与肿瘤细胞共注射时促进血管发生(参见例如Yang，L.等ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr土CD1IbiCellsintumor-bearinRhostdirectlypromotestumorangiogenesis.CancerCell6409-21(2004)),而且肿瘤浸润巨噬细胞数目与一些人肿瘤中差的预后有关(综述见Balkwill等inBalkwill,F.，Charles,K.Α.&Mantovani，A.SmolderinRandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmaliRnantdisease.CancerCell7:211_7(2005))。然而，在另一项研究中，巨噬细胞抑制小鼠中实验型肿瘤的生长，提示它们作为抗癌疗法的潜力(参加例如Kohchi，C.等UtilizationofmacrophaResinanticancertherapy:themacrophaRenetworktheory.AnticancerRes24:3311-20(2004))。已经提示，在促进血管发生之外，TAM可能还通过促进炎症、基质重塑、肿瘤细胞侵入、内侵和远处播种而促成肿瘤生长(Lewis等2000;LewisandPoloard2006；Pollard2004；Hiratsuka等2002；Lin等2001；Sica等2006)。TAM是自循环中的单核细胞衍生的，后者被肿瘤衍生的趋化因子募集至恶性组织。单核细胞因其通用性和可塑性而与众不同，而且取决于它们的特定微环境，能分化成具有各种活化阶段的巨噬细胞。这些活化范围在操作上是在两个独特的极化状态(即Ml和M2)间定义的。虽然已经在体外定义了这些状态，但是认为组织巨噬细胞沿Ml和M2的连续谱存在。在促炎性刺激和I型细胞因子占优势的环境中，单核细胞分化成Ml巨噬细胞，其表达高水平促炎性细胞因子、促进Thl免疫应答和介导针对胞内寄生物的抗性。相反，II型细胞因子(即IL-4和IL-13)占优势的环境促进M2或“营养性”巨噬细胞的生成。M2巨噬细胞是免疫调控性的，而且促进组织修复和重塑。已经提出TAM作为“营养性”M2巨噬细胞在肿瘤中通过分泌被认为是抑制树突细胞(“DC”)成熟的某些细胞因子(诸如IL-6、CSF-1、IL-10和TGFi^)而在诱导耐受中具有间接作用(Mantovani等2002;PolIard2004)。DC是专门的抗原呈递细胞，有能力诱导和调节免疫应答，而且经常在组织中捕捉抗原之后经历成熟。它们上调MHCI表达和共刺激分子，而且迁移至引流淋巴结，在那里它们能诱导有力的T细胞应答。在非炎性条件下(即在肿瘤组织中)捕捉抗原的DC可能没有完全成熟，且如此在抗原呈递方面受损。这些不成熟的或半成熟的DC表达低水平的共刺激性蛋白质，而且潜在生成强化致耐受性应答的调节性T淋巴细胞(Steinman等2003)。基于起源部位、表型标志物表达和抑制机制，已经定义了数个调节性T细胞子集。一个得到特别好地表征的子集是天然发生的胸腺衍生⑶4+CD25+T调节性细胞。此类细胞表达高水平的FoxP3和GITR，而且经由细胞接触依赖性机制介导免疫抑制。第二个⑶4+子集(Trl细胞)是在外周组织中诱导的，而且经由IL-10和/或TGFii的分泌以不依赖接触的方式介导免疫抑制。越来越多的证据支持调节性T细胞在抑制针对肿瘤的免疫应答中的重要性。数份报告记录了实体瘤中数目升高的调节性FoxP3+⑶4+T细胞(Leong等2006;Liyanage等2002)和IL_10+CD4+Trl细胞(Marshall等2004；Seo等2001)的存在。此外，人类乳腺癌样品中水平升高的FoxP3+CD4+T细胞与降低的总体存活率有关(Curiel等2004；Bates等2006)。不管TAM在肿瘤浸润物中的存在及它们生成血管发生性因子的潜力，它们在肿瘤生长和形成中的作用仍然未明。需要发现和了解TAM的生物学功能及它们生成的因子。本发明解决了这些需要和其它需要，在阅读以下公开内容后，这会是显而易见的。发明概述在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定样品内的炎症相关组织巨噬细胞(IRTM)的方法，包括使所述样品接触IRTM结合剂，并测定一种或多种与所述IRTM结合剂结合的细胞的存在。在一个方面，所述样品是组织样品。在另一个方面，所述样品是人的。在另一个方面，所述IRTM结合剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个方面，所述IRTM是肿瘤相关巨噬细胞(ΤΑΜ)。在另一个方面，所述IRTM是脂肪组织巨噬细胞(ATM)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定样品内的炎症相关组织巨噬细胞(IRTM)的方法，包括使所述样品接触至少一种特异性识别巨噬细胞特异性细胞表面标志物的第一试剂和至少一种特异性识别树突细胞特异性细胞表面标志物的第二试剂，并测定受到所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂二者识别的细胞的存在。在一个方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂特异性结合所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物或所述树突细胞特异性细胞表面标志物。在另一个这样的方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个方面，所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂是同一分子。在另一个这样的方面，所述分子选自下组双特异性抗体、三特异性抗体、具有超过三种特异性的抗体和任何所述抗体的抗原结合片段。在另一个方面，所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物是F4/80。在另一个方面，所述树突细胞特异性细胞表面标志物是CDllc。在另一个方面，测定受到所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂二者识别的细胞的存在包括至少一种选自下组的方法免疫组织化学、荧光激活细胞分选、磁细胞分选、亲和层析、荧光原位杂交和免疫显微术。在另一个方面，所述细胞样品是肿瘤样品。在另一个方面，所述IRTM是ΤΑΜ。在另一个方面，所述IRTM是ATM。在另一个实施方案中，本发明提供了一种自细胞混合物分离TAM的方法，包括(a)使细胞样品接触至少一种特异性识别巨噬细胞特异性细胞表面标志物的第一试剂和至少一种特异性识别树突细胞特异性细胞表面标志物的第二试剂，并(b)分离受到所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂二者识别的细胞。在一个方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂特异性结合所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物或所述树突细胞特异性细胞表面标志物。在另一个方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个方面，所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂是同一分子。在另一个这样的方面，所述分子选自下组双特异性抗体、三特异性抗体、具有超过三种特异性的抗体和任何所述抗体的抗原结合片段。在另一个方面，所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物是F4/80。在另一个方面，所述树突细胞特异性细胞表面标志物是CDllc。在另一个方面，所述分离步骤包括荧光激活细胞分选、亲和层析和磁细胞分选中至少一项。在另一个实施方案中，本发明提供了一种诊断受试者中的增殖性病症的方法，包括测定所述受试者中TAM的存在和/或活性。在一个方面，所述测定步骤包括使来自所述受试者的细胞样品接触至少一种特异性识别巨噬细胞特异性细胞表面标志物的第一试剂和至少一种特异性识别树突细胞特异性细胞表面标志物的第二试剂，并鉴定受到所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂二者识别的细胞。在另一个方面，所述增殖性病症是乳腺癌。在另一个方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂特异性结合所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物或所述树突细胞特异性细胞表面标志物。在一个这样的方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个这样的方面，所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂是同一分子。在另一个这样的方面，所述分子选自下组双特异性抗体、三特异性抗体、具有超过三种特异性的抗体和任何所述抗体的抗原结合片段。在另一个这样的方面，所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物是F4/80。在另一个这样的方面，所述树突细胞特异性细胞表面标志物是⑶11c。在另一个这样的方面，所述鉴定步骤包括至少一种选自下组的方法免疫组织化学、荧光激活细胞分选、磁细胞分选、亲和层析、荧光原位杂交和免疫显微术。在另一个实施方案中，本发明提供了一种对受试者中的肿瘤分期的方法，包括测定所述受试者中TAM的存在和/或活性。在一个方面，所述测定步骤包括使来自所述受试者的细胞样品接触至少一种特异性识别巨噬细胞特异性细胞表面标志物的第一试剂和至少一种特异性识别树突细胞特异性细胞表面标志物的第二试剂，并鉴定受到所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂二者识别的细胞。在另一个方面，所述肿瘤是乳腺癌肿瘤。在另一个方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂特异性结合所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物或所述树突细胞特异性细胞表面标志物。在另一个这样的方面，所述至少一种第一试剂和/或所述至少一种第二试剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个这样的方面，所述至少一种第一试剂和所述至少一种第二试剂是同一分子。在另一个这样的方面，所述分子选自下组双特异性抗体、三特异性抗体、具有超过三种特异性的抗体和任何所述抗体的抗原结合片段。在另一个这样的方面，所述巨噬细胞特异性细胞表面标志物是F4/80。在另一个这样的方面，所述树突细胞特异性细胞表面标志物是CDllc。在另一个方面，所述鉴定步骤包括至少一种选自下组的方法免疫组织化学、荧光激活细胞分选、磁细胞分选、亲和层析、荧光原位杂交和免疫显微术。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的肿瘤的方法，包括调控TAM生存力或活性。在一个方面，调控TAM生存力或活性包括自肿瘤细胞群体或肿瘤样品选择性消除ΤΑΜ。在一个这样的方面，所述选择性消除TAM包括(a)使所述群体或样品接触TAM结合剂，并(b)自所述群体或样品选择性消除那些特异性结合所述TAM结合剂的细胞。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性消除步骤选自抗体介导的清除、蛋白A层析、亲和层析、荧光激活细胞分选和磁细胞分选。在另一个方面，调控TAM生存力或活性包括选择性杀死肿瘤细胞群体或肿瘤样品内的ΤΑΜ。在一个这样的方面，选择性杀死TAM包括(a)使所述群体或样品接触TAM结合剂，并(b)自所述群体或样品选择性杀死那些特异性结合所述TAM结合剂的细胞。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性杀死步骤是补体介导的细胞毒性。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性杀死步骤是由偶联至所述抗体的细胞毒性分子介导的。在另一个方面，调控TAM生存力或活性包括抑制肿瘤细胞群体或肿瘤样品内的TAM活性。在一个这样的方面，抑制TAM活性包括抑制所述群体或样品中一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性。在另一个这样的方面，所述TAM分泌细胞因子是TGFβ。在另一个这样的方面，抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。在另一个这样的方面，所述TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂选自对所述细胞因子或趋化因子特异性的抗体或抗原结合片段、对所述细胞因子或趋化因子特异性的受体或抑制所述细胞因子/趋化因子活性的小分子。在另一个方面，抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。在另一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一个方面，所述方法进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂化疗剂、细胞因子、趋化因子、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒剂、抗炎剂和生长抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，包括调控TAM生存力或活性。在一个方面，调控TAM生存力或活性包括刺激TAM活性。在一个这样的方面，刺激TAM活性包括施用一种或多种选自下组的化合物TAM激动剂和TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。在另一个这样的方面，刺激TAM活性导致对FoxP3+⑶4+T调节性细胞、IL-10+CD4+T调节性细胞和炎症TH17细胞中至少一项的诱导。在另一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一个方面，所述方法进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂和免疫抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抑制受试者中的耐受性形成的方法，包括调控TAM生存力或活性。在一个方面，调控TAM生存力或活性包括选择性消除ΤΑΜ。在一个这样的方面，所述选择性消除TAM包括(a)施用TAM结合剂，并(b)选择性消除那些特异性结合所述TAM结合剂的细胞。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性消除步骤是抗体介导的清除。在另一个方面，调控TAM生存力或活性包括选择性杀死ΤΑΜ。在一个这样的方面，选择性杀死TAM包括(a)施用TAM结合剂，并(b)选择性杀死那些特异性结合所述TAM结合剂的细胞。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述杀死步骤是补体介导的细胞毒性。在另一个这样的方面，所述TAM结合剂包括至少一种抗体或抗原结合片段且所述选择性杀死步骤是由偶联至所述抗体或抗原结合片段的细胞毒性分子介导的。在另一个方面，调控TAM生存力或活性包括抑制TAM活性。在一个这样的方面，抑制TAM活性包括抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性。在一个这样的方面，所述TAM分泌细胞因子是TGFβ。在另一个这样的方面，抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。在一个这样的方面，所述TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂选自对所述细胞因子或趋化因子特异性的抗体或抗原结合片段、受体或抑制所述细胞因子/趋化因子活性的小分子。在另一个方面，抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。在另一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一个方面，所述方法进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于选择性诱导FoxP3+⑶4+Τ调节性细胞、IL-IO+⑶4+Trl细胞或炎症TH17细胞生长和/或增殖的方法，包括在适于正常细胞生长的条件下给幼稚T细胞施用IRTM或使幼稚T细胞暴露于IRTM。在一个方面，所述IRTM是ΤΑΜ。在另一个方面，所述IRTM是ATM。在一个方面，所述方法进一步包括施用一种或多种选自下组的化合物TAM和/或ATM激动剂和TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。在另一个方面，所述方法进一步包括分离所述经过诱导的FoxP3+CD4+T调节性细胞、IL-10+CD4+Trl细胞或炎症TH17细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的炎性病症的方法，包括调控IRTM生存力或活性。在一个方面，调控IRTM生存力或活性包括刺激IRTM活性。在另一个方面，刺激IRTM活性包括施用一种或多种选自下组的化合物IRTM激动剂和IRTM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。在另一个方面，刺激IRTM活性导致对FoxP3+CD4+T调节性细胞、IL-10+CD4+Trl细胞或炎症TH17细胞中至少一项的诱导。在另一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一个方面，所述方法进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。在另一个方面，调控IRTM生存力或活性包括选择性消除IRTM。在另一个方面，所述选择性消除IRTM包括(a)施用IRTM结合剂，并(b)选择性消除那些特异性结合所述IRTM结合剂的细胞。在另一个方面，所述IRTM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性消除步骤是抗体介导的清除。在另一个方面，调控IRTM生存力或活性包括选择性杀死IRTM。在另一个方面，选择性杀死IRTM包括(a)施用IRTM结合剂，并(b)选择性杀死那些特异性结合所述IRTM结合剂的细胞。在另一个方面，所述IRTM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性杀死步骤是补体介导的细胞毒性。在另一个方面，所述IRTM结合剂包括至少一种抗体或抗原结合片段且所述选择性杀死步骤是由偶联至所述抗体或抗原结合片段的细胞毒性分子介导的。在另一个方面，调控IRTM生存力或活性包括抑制IRTM活性。在另一个方面，抑制IRTM活性包括抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性。在另一个方面，所述IRTM分泌细胞因子是TGFβ。在另一个方面，抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。在另一个方面，所述IRTM分泌细胞因子/趋化因子结合剂选自对所述细胞因子或趋化因子特异性的抗体或抗原结合片段、对所述细胞因子或趋化因子特异性的受体或抑制所述细胞因子/趋化因子活性的小分子。在另一个方面，抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。在另一个方面，所述IRTM选自TAM和ATM。在另一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一个方面，所述方法进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于选择性诱导FoxP3+⑶4+T调节性细胞、IL-IO+⑶4+Trl细胞和/或炎症TH17细胞生长和/或增殖的方法，包括在适于正常细胞生长的条件下使幼稚T细胞暴露于TAM和/或ATM。在一个方面，所述方法进一步包括施用一种或多种选自下组的化合物TAM激动剂、ATM激动剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂和ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。在另一个方面，所述方法进一步包括分离所述经过诱导的FoxP3+⑶4+T调节性细胞、IL-IO+⑶4+Trl细胞或炎症TH17细胞。附图简述图1A-1H描绘了对肿瘤样品的免疫组织化学分析的结果，如实施例1所述。图IA描绘了肿瘤组织的抗CD45抗体染色，显示显著的白细胞浸润物。图IB描绘了肿瘤组织的抗F4/80抗体染色，用以鉴定巨噬细胞。图IC描绘了肿瘤组织的抗CD3抗体染色，用以鉴定T细胞。图ID的图显示了CD45+淋巴样肿瘤浸润物中免疫细胞的相对比例。图IE的图显示了NKl.l_DX5_CDllb+肿瘤髓样浸润物中免疫细胞的相对比例。图IF描绘了用抗F4/80和抗CD31这两种抗体染色的肿瘤样品，用以显示肿瘤组织中TAM相对于内皮细胞的定位。图IG描绘了用抗Ly-6G和抗⑶31这两种抗体染色的肿瘤样品，用以显示肿瘤组织中嗜中性粒细胞相对于内皮细胞的定位。图IH描绘了用抗Ly-6C和抗CD31这两种抗体染色的肿瘤样品，用以显示肿瘤组织中炎症单核细胞(Moif)相对于内皮细胞的定位。图1F-1H中的数据代表2-3次重复和6-7份肿瘤个体。图2A-2C图解描绘了评估MMTV-PyMT肿瘤的白细胞组成的FACS分析的结果。在所有三幅图中，FVB对照样品以白色显示，而PyMTtg样品以条文显示。图2A显示了PyMT诱发的肿瘤中外周血单个核细胞(PBMC)总数与无瘤对照FVB小鼠样品相比的2.3倍增加。图2B显示了荷瘤小鼠中⑶Ilb+髓样PBMC(Nkl.1_DX5_)细胞与无瘤对照FVB小鼠相比的增力口。图2C显示了PyMT肿瘤小鼠中嗜中性粒细胞单核细胞比与对照小鼠相比的增加。符号“*”指示数据是显著的，ρ彡0.05；符号“**”指示数据是显著的，ρ彡0.01。图3A-3E描绘了实施例2A所述实验的结果，显示了TAM具有巨噬细胞和树突细胞二者的特征。图3A描绘了基因表达分析的结果，显示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬细胞(黑色柱)和PyMTtg衍生TAM(条纹柱)的⑶1IcmRNA表达水平(最左边的小图)。图3A还描绘了FACS分析的结果，显示了TAM表达高水平的⑶11c和F4/80，而bmDC或腹膜巨噬细胞表达⑶Ilc或F4/80(最右边的三幅小图)。图3B-3C描绘了免疫组织化学分析的结果，显示了PyMTtg衍生肿瘤的冷冻切片(图3B)或在体外培养了60个小时的分离的F4/80+TAM(图3C)表达树突细胞标志物CDllc。图3D描绘了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬细胞(条纹柱)和PyMTtg衍生TAM(斑点柱)的⑶207mRNA表达水平的基因表达水平(最左边的小图)。图3D还描绘了FACS分析的结果，显示了CDllb+F4/80+CDllc+TAM表达langerin(CD207)。图3D中的数据代表四次实验。图3E描绘了实时PCR实验的结果，显示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬细胞(条纹柱)和PyMTtg衍生TAM(斑点柱)中的TGF3RI、Runx3和IRF-8表达水平。图4A-4C描绘了实施例2A所述实验的结果，显示了与无瘤FVB小鼠相比PyMTtg小鼠肿瘤引流腋窝和臂淋巴结的免疫细胞组成。图4A图解显示了在来自含瘤小鼠的淋巴结中鉴定到升高数目的⑶Ilb+细胞。图4B显示了FACS结果，指示了在来自荷瘤小鼠的淋巴结中鉴定到升高数目的、共表达⑶Ilc和F4/80的⑶Ilb+细胞。图4C描绘了显微照相，显示了TAM的形态学更接近bmDC而非巨噬细胞。图5A-5C描绘了ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞和bmDC中表达的基因的微阵列分析的结果，如实施例2A所述。图5A显示了那三种细胞群体中表达的基因的热像(heatmapimage),其中白色着色指示最小限度水平的相对表达，而黑色着色指示最大限度水平的相对表达，灰色指示相对表达为1。图5B显示了ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞和bmDC的基因表达谱型分析的统计PC分析，显示了TAM与腹膜巨噬细胞之间的密切关系(左边的小图)和所分析的个别主要组分的重要性程度的图形显现(右边的小图)。图5C描绘了PyMTtg衍生TAM和Her2tgS生TAM的基因表达谱型分析的统计PC分析的结果，证明了与其它组织巨噬细胞(腹膜巨噬细胞和脾巨噬细胞及Kupffer细胞)相比TAM的独特基因谱型(左边的小图)和所分析的个别主要组分的重要性程度的图形显现(右边的小图)。图5B和5C中的数据是来自个别分离的群体的3-5份mRNA制备物的平均值。图6A-6C显示了数项FACS分析，评估MHCII和共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86的TAM表面表达，如实施例2B所述。图6A描绘了MHCII、⑶80、⑶83和⑶86的TAM表达的FACS结果。图6B描绘了MHCII、⑶80、⑶83和⑶86的腹膜巨噬细胞表达的FACS结果。图6C描绘了MHCII、CD80、CD83和CD86的bmDC表达的FACS结果。图7A-7B描绘了TAM对腹膜巨噬细胞中的趋化因子和细胞因子表达的微阵列分析的结果，如实施例3所述。图7A显示了两个细胞群体中趋化因子CCL2、CXCLlO、CCL3、CCL5和KC的表达水平。图7B显示了两个细胞群体中细胞因子IL-Iα、IL-Iβ、TNFα、IL_10和IL-6的表达水平。图7C描绘了实时RT-PCR实验的结果，显示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬细胞(斑点柱)、PyMTtg衍生TAM(疏条纹柱)和肿瘤细胞(密条纹柱)中的TGF^表达水平。所示数据是3-5次独立实验的平均值。图8A-8C描绘了FACS分析的结果，评估TAM对幼稚T细胞(nai'veTcell)的影响，如实施例4所述。图8A图解显示了由受ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞或bmDC刺激的幼稚T细胞培养物生成的细胞因子IL-10、IL-4、IL-2和IL-17的相对量。图8B描绘了FACS结果，显示了TAM活化的T细胞生成IL-10和IL-17。图8C图解描绘了免疫染色实验的结果，显示了来自TAM刺激的⑶4+T细胞的细胞因子分泌依赖于TAM的TGFβ分泌。图9A-9D描绘了实施例4所述FACS分析的结果，用以调查TAM对FoxP3+调节性T细胞的诱导。图9A描绘了FACS分析，显示用TAM或bmDC处理的培养物中FoxP3+T细胞诱导的差异。图9B描绘了FACS分析的结果，显示包括TGFi3RII对TAM诱导FoxP3+T细胞的影响。图9C描绘了FACS分析的结果，评估TAM诱导的FoxP3+T细胞上GITR的存在，作为调节性T细胞的标志物。图9D描绘了FACS分析的结果，评估TAM诱导的FoxP3+T细胞上的CD103表达，作为外周诱导的调节性T细胞的标志物。图10A-10D描绘了实验的结果，用以确认TAM诱导FoxP3+T细胞，而非刺激现有FoxP3+T细胞克隆扩增，如实施例4所述。图IOA描绘了FACS分析的结果，评估本文中所使用的幼稚⑶4+T细胞制备物中FoxP3+T细胞的量。图IOB显示了实验的结果，分析bmDC、TAM和腹膜巨噬细胞对CFSE标记的幼稚⑶4+T细胞的刺激能力。图IOC描绘了FACS分析的结果，评估全脾细胞中的FoxP3+T细胞集合(图10C)。图IOD描绘了FACS分析的结果，评估自纯化的CD103+CD25+CD69+T细胞分离(图10D)并用TAM再处理后的FoxP3+T细胞集合。图11A-11C描绘了实验的结果，评估PyMT小鼠(图11A)对对照小鼠(图11B)中IL-IO+和FoxP3+调节性T细胞的体内发生率，如实施例5所述。图IlC图解显示了在来自PyMT小鼠(条纹柱和黑色圆)对对照小鼠(白色柱和圆)的肿瘤引流淋巴结(最左边的两幅小图)、脾(中间的和中间靠右的小图)和肿瘤(最右边的小图)中找到的F0XP3+CD4+T细胞的相对量和/或绝对数。图12A-G描绘了在脂肪组织巨噬细胞(ATM)上实施的实验的结果，如实施例6所述。图12A描绘了FACS分析的结果，显示了⑶Ilb+细胞含量。数据代表20份独立的脂肪组织分离物。图12B描绘了FACS分析的结果，显示了F4/80+ATM中的⑶llc、MHCII和⑶86的表达。数据代表来自数个不同实验的14份(⑶lie)或5份(MHCII或⑶86)脂肪组织分离物。图12C描绘了FACS分析的结果，显示了自在HFD下饲养的雄性C57BI/6小鼠的附睾脂肪衍生的单细胞ATM悬浮液中⑶14、ICOSL和TIM3表达。数据代表来自数个不同实验的5份独立脂肪组织分离物。图12D描绘了FACS分析的结果，显示了TAM中的⑶14、ICOSL和TIM3表达的表达。数据代表来自数个不同实验的5份独立脂肪组织分离物。图12E描绘了自附睾脂肪组织(条纹柱)、C57BI/6野生型腹膜巨噬细胞(白色柱)或瘦脂肪巨噬细胞(leanfatmacrophage)(斑点柱)衍生的ATM的细胞因子谱型。数据代表来自两个实验的6只小鼠。图12F描绘了TAM(白色柱)和ATM(条纹柱)中TGFβi和TGFβRI表达水平的实时RT-PCR分析的结果。数据代表来自1-3个实验或4份各自分离的巨噬细胞集合的8种TAM和3种ATMRNA探针。图12G显示了用H&E染色的新鲜分离的ATM、TAM和腹膜巨噬细胞的形态。图13A-J显示了实验的结果，测试脂肪组织、淋巴结组织和纯化的ATM诱导FoxP3+调节性T细胞的能力，如实施例7所述。图13A描绘了被ATM(左边的小图)、瘦脂肪巨噬细胞(LTM)(中央的小图)或腹膜巨噬细胞(右边的小图)活化的CD4+T细胞中FoxP3表达的FACS分析的结果。所示数据代表单一实验中的两只独立小鼠。图13B描绘了TGF-β对补充有重组TGFi3RII-Fc的T细胞培养物中TAM对FoxP3诱导的影响的FACS分析的结果。所示数据代表单一实验中的两只独立小鼠。图13C和13D显示了FACS分析的结果，评估来自雄性Db/Db小鼠和年龄匹配的C57BI/6小鼠的CD4+T细胞中附睾脂肪(图13C)或脾组织(图13D)中FoxP3+T调节性细胞的相对量。所示数据代表单一实验中的四只独立小鼠。图13E描绘了实验的结果，评估ATM活化的T细胞的细胞因子生成。白色柱对应于用腹膜巨噬细胞处理的T细胞，而黑色柱对应于用ATM处理的T细胞。所示数据代表两次实验，每次使用两只小鼠。图13F描绘了FACS分析的结果，评估被TAM活化的T细胞群体中Trl和TH17细胞的存在。所示数据代表两次实验，每次使用两只小鼠。图13G-H描绘了实验的结果，评估来自用高脂肪食谱喂养的C57BI/6小鼠(图13G)或野生型C57BI/6小鼠(图13H)(都用PMA/伊屋诺霉素(ionomycin)再刺激)中的肿瘤引流淋巴结的CD4+T细胞群体，显示了肥胖小鼠中明显IL-IO+Trl和TH17T细胞群体的存在。图131和13J显示的柱形图描绘了实验的结果，评估年龄匹配的对照FVB小鼠(白色圆)或雄性HFD肥胖C57BI/6小鼠(黑色圆)的脂肪组织(图131)或引流淋巴结组织(图13J)中FoxP3+CD4+T细胞的百分比。#指示实验具有ρ<0.01。图14A-F描绘了选定的免疫细胞和肿瘤细胞群体中的基因表达谱型。图14A-C和E描绘了肿瘤细胞、PyMTtg衍生ΤΑΜ、来自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬细胞和bmDC中细胞因子(图14A)、细胞因子受体(图14B)、趋化因子(图14C)和趋化因子受体(图14E)的差异表达的热图谱型。图14D显示了实验的结果，用以确认腹膜巨噬细胞(白色柱)或PyMTtg衍生TAM(条纹柱)中的CCL2、CCL3、CCL5和CXCLlO的差异表达。**指示ρ<0.01。图14F描绘了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬细胞(条纹柱)和PyMTtg衍生TAM(斑点柱)中CCR6基因表达的实时RT-PCR分析的结果。在每幅图中，数据显示了来自3-5份独立样品的基因谱型分析或3-5次独立实验的平均值。在图14A-C和E中，最低表达水平以深灰色显示，而最高表达水平以浅灰色指示；白色正方形指示该特定分析的数据不可得。图15A-B描绘了来自肿瘤细胞、PyMTtg衍生ΤΑΜ、来自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬细胞和bmDC的Ml(图15A)和M2(图15B)标志物基因mRNA的差异表达的热图谱型。数据显示了来自3-5份独立样品的基因谱型分析结果。最低表达水平以深灰色显示，而最高表达水平以浅灰色指示；白色正方形指示该特定分析的数据不可得。图16A-B描绘了实验的结果，显示了被某些免疫细胞群体活化的幼稚T细胞的细胞因子和趋化因子谱型。图16A显示了受bmDC(白色柱)、来自FVB小鼠的腹膜巨噬细胞(条纹柱)或TAM(斑点柱)刺激的幼稚T细胞中的TNFα、IL_5、IL-13和CCL3表达。图16B显示了受来自C57BI/6小鼠的腹膜巨噬细胞(白色柱)或ATM(条纹柱)刺激的幼稚T细胞中的TNFa、IL-5和IL-13表达。图17描绘了某些免疫细胞群体的基因表达谱型分析的统计PC分析的结果。左边的小图显示的图证明了ATM、⑶11c_ATM和⑶11C+ATM具有相似的基因表达谱型，但是拥有与PyMTtgTAM、Her2tgTAM和腹膜巨噬细胞(“PF”)不同的基因表达谱型。图18描绘了⑶llc_ATM(白色柱)或⑶llc+ΑΤΜ(条纹柱)的细胞因子/趋化因子谱型，如实施例8所述。*指示实验具有ρ<0.05；**指示实验具有ρ<0.01。图19A和19B描绘了被⑶llc_ATM(白色柱)或⑶llc+ATM(条纹柱)活化的T细胞的细胞因子/趋化因子谱型，如实施例8所述。图20A显示的图证明了与⑶Ilc+ATM(条纹柱)相比，⑶llc_ATM具有显著更高的编码⑶209a、⑶209b和⑶209c的mRNA水平(白色柱)，如实施例9所述。图20B描绘了自不肥胖雄性C57BL/6小鼠(8周龄)或肥胖雄性C57BL/6小鼠(24周龄，在HFD上20周)附睾脂肪组织衍生的ATM上的⑶209b/SIGN-Rl和⑶Ilc的FACS分析，如实施例9所述。数据代表来自4-6份独立ATM分离物的各个分离群体的三个阵列的平均值。*指示ρ彡0.05；**指示P^0.Olo发明详述定义在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于具体的组合物或生物学系统，其当然可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并非意图限制。在用于本说明书和所附权利要求书时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数称谓，除非另有明确说明。如此，例如，“一个/一种分子”任选包括两个或多个/两种或多种所述分子的组合，诸如此类。术语“炎症相关组织巨噬细胞”或“IRTM”在用于本文时指自单核细胞衍生的、与炎症和一种或多种疾病状态有关的一类免疫细胞。IRTM的例子包括但不限于肿瘤相关巨噬细胞和脂肪组织巨噬细胞。在某些实施方案中，IRTM还可包括但不限于肺泡巨噬细胞和在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的中枢神经系统中找到的巨噬细胞。术语“IRTM结合蛋白”在用于本文时指特异性结合IRTM的分子。IRTM结合蛋白包括但不限于结合IRTM的抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、融合蛋白和受体分子。此类结合可以是例如针对IRTM细胞表面的蛋白质的或针对一些其它IRTM细胞表面分子的。术语“肿瘤相关巨噬细胞”或“ΤΑΜ”在用于本文时指自单核细胞衍生的、能在与肿瘤有关的免疫浸润物中找到的细胞。如本文中所示，TAM表达某些巨噬细胞细胞表面标志物和某些树突细胞表面标志物二者。术语“ΤΑΜ结合蛋白”在用于本文时指特异性结合TAM的分子。TAM结合蛋白包括但不限于结合TAM的抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、融合蛋白和受体分子。此类结合可以是例如针对TAM细胞表面处的蛋白质的或针对一些其它TAM细胞表面分子的。术语“脂肪组织巨噬细胞”或“ATM”在用于本文时指自单核细胞衍生的、能在肥胖受试者中与脂肪组织有关的免疫浸润物中找到的细胞。如本文中所示，ATM表达某些巨噬细胞细胞表面标志物和某些树突细胞表面标志物二者。术语“ATM结合蛋白”在用于本文时指特异性结合ATM的分子。ATM结合蛋白包括但不限于结合ATM的抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、融合蛋白和受体分子。此类结合可以是例如针对ATM细胞表面的蛋白质的或针对一些其它ATM细胞表面分子的。缩写“Mf”和“ΜΦ”在用于本文时指巨噬细胞。缩写“pMf”和“ρΜΦ”指腹膜巨噬细胞。术语“拮抗剂”在用于本文时指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰本发明蛋白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的结合(在受体的情况中)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。拮抗剂还包括本发明蛋白质的小分子抑制剂和融合蛋白、能特异性结合蛋白质由此使其隔绝与其靶物结合的受体分子及衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针对本发明蛋白质的反义分子、RNA适体和针对本发明蛋白质的核酶。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质上或完全抑制抗原的生物学活性。术语“IRTM拮抗剂”在用于本文时指能结合IRTM并抑制或实质性降低IRTM生物学活性的分子。IRTM拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，IRTM拮抗剂是抗体，尤其是能结合人IRTM的抗IRTM细胞表面标志物抗体。术语“ΤΑΜ拮抗剂”在用于本文时指能结合TAM并抑制或实质性降低TAM生物学活性的分子。TAM拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，TAM拮抗剂是抗体，尤其是能结合人TAM的抗TAM细胞表面标志物抗体。术语“ATM拮抗剂”在用于本文时指能结合ATM并抑制或实质性降低ATM生物学活性的分子。ATM拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，ATM拮抗剂是抗体，尤其是能结合人ATM的抗ATM细胞表面标志物抗体。术语“F4/80拮抗剂”在用于本文时指能结合F4/80并抑制或实质性降低F4/80生物学活性的分子。F4/80拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖月旨、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，F4/80拮抗剂是抗体，尤其是能结合人F4/80的抗F4/80抗体。术语“⑶IlC拮抗剂”在用于本文时指能结合⑶IlC并抑制或实质性降低⑶IlC生物学活性的分子。CDllC拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖月旨、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，CDllC拮抗剂是抗体，尤其是能结合人CDllC的抗CDllC抗体。术语“Iangerin拮抗剂”在用于本文时指能结合Iangerin(优选人langerin)并抑制或实质性降低Iangerin生物学活性的分子。langerin拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、小分子、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，Iangerin拮抗剂是抗体，尤其是能在胞内结合人Iangerin的抗Iangerin抗体。在本发明的另一个实施方案中，Iangerin拮抗剂是能结合人Iangerin的小分子。术语“激动剂”指能够刺激、活化或以其它方式增强本发明蛋白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的结合(在受体的情况中)的分子。激动剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。激动剂还包括本发明蛋白质的小分子活化剂和融合蛋白、能特异性结合蛋白质由此增强蛋白质的活性(例如与其靶物的结合)的受体分子及衍生物、蛋白质的激动性变体、针对本发明蛋白质的抑制剂的反义分子、对本发明蛋白质的抑制剂特异性的RNA适体和针对本发明蛋白质的抑制剂的核酶。术语“IRTM激动剂”指能够刺激、活化或以其它方式增强IRTM活性(例如通过与一种或多种IRTM受体结合并刺激IRTM活性或通过与一种或多种IRTM抑制剂结合并防止该抑制剂与IRTM相互作用)的分子。激动剂包括但不限于抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、小分子、融合蛋白、受体分子及其延伸物、以及针对IRTM抑制剂的反义分子、RNA适体和核酶。术语“ATM激动剂”指能够刺激、活化或以其它方式增强ATM活性(例如通过与一种或多种ATM受体结合并刺激ATM活性或通过与一种或多种ATM抑制剂结合并防止该抑制剂与ATM相互作用)的分子。激动剂包括但不限于抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药物学试剂及其代谢物、小分子、融合蛋白、受体分子及其延伸物、以及针对ATM抑制剂的反义分子、RNA适体和核酶。“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段来生产。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其它结构域相连的多肽。多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少约95%或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短物等)，它们通常是有生物学活性的。本文中的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2如下所述获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册，公众可通过Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)获取。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(优选数码UNIXV4.OD)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。为了本发明的目的，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数X/Y乘100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。术语“蛋白质变体”在用于本文时指上文所述变体和/或在天然蛋白质序列中包含一处或多处氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。用于本发明的蛋白质及其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。蛋白质的氨基酸序列变体可通过蛋白质DNA中的突变来制备。此类变体包括例如蛋白质氨基酸序列内的残基删除、插入或替代。可以进行删除、插入和替代的任何组合以获得具有期望活性的最终构建物。将在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。蛋白质变体的制备任选通过编码天然蛋白质的DNA中的核苷酸定点诱变或噬菌体展示技术，由此产生编码变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身不必预先决定。例如，为了优化给定位点处突变的后果，可以在目标密码子或区域进行随机诱变，并对所表达的蛋白质变体筛选期望活性的最佳组合。用于在具有已知序列的DNA中预先决定的位点进行替代突变的技术是众所周知的，诸如例如位点特异性诱变。本文所述蛋白质变体的制备可通过噬菌体展示技术来实现，诸如那些如PCT出版物WO00/63380所记载的。在选出这样的克隆后，可以取出突变后的蛋白质区并置入适用于蛋白质生产的载体，一般是可用于转化适宜宿主的那种类型的表达载体。氨基酸序列删除的范围一般是约1-30个残基，任选1-10个残基，任选1-5个残基或更少，而且通常是连续的。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，从一个残基至长度本质上不受限制的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即天然蛋白质序列内的插入)的范围一般可以是约1-10个残基，任选1-5个，或任选1-3个。末端插入的例子包括在N-末端融合信号序列(无论对宿主细胞是异源的或同源的)以便于由重组宿主分泌。别的蛋白质变体有那些其中天然蛋白质的至少一个氨基酸残基已经消除并在它的位置插入了不同残基的。此类替代可依照表1所示进行。蛋白质变体还可包含本文所述的非天然氨基酸。氨基酸可以根据其侧链特性的相似性如下分组(A.L.Lehninger,Biochemistry,第2版，pp.73-75，WorthPublishers,NewYork,(1975))非极性的=Ala(A),Val(V)、Leu(L)、lie(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)不带电荷的、极性的:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)酸性的Asp(D)、Glu(E)碱性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，天然存在残基可以基于共同的侧链特性如下分组疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie；中性的、亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；酸性的Asp、Glu;碱性的His、Lys、Arg；影响链取向的残基Gly、Pro；芳香族的Trp、Tyr、Phe。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码的氨基酸残基)可以选自丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gin)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(lie)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。“非天然存在的氨基酸残基”指上文所列天然存在氨基酸残基以外的，能够在多肽链中与邻近氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如那些Ellmanetal.,Meth.Enzym.202=301-336(1991)及美国专利申请出版物20030108885和20030082575中所记载的。简言之，这些规程牵涉用非天然存在氨基酸残基活化阻抑型tRNA，接着在体外或在体内转录并翻译RNA。参见例如美国专利申请出版物20030108885和20030082575；Norenetal.，Science244:182(1989)；及Ellmanetal.，见上文。“分离的”多肽指已经鉴定且与/由其天然环境的成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95%或重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。术语“抗体”以最广义使用，明确涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体通常改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，如此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab‘片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Wardetal.，Nature341:544_546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的⑶R区；(viii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区的二硫桥相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链FV;SCFV)(Birdetal.，Science242:423_426(1988)和Hustonetal.，PNAS(USA)85:5879_5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(参见例如EP404,097;W093/11161；和Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90=6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapataetal.，ProteinEng.8(10)1057-1062(1995)和美国专利5，641，870)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)夕卜。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原高度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型地包括包含能结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如KohlerandMilstein,Nature256:495—97(1975)；Hongoetal.,Hybridoma,14(3):253_260(1995)；Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988；Hammerlingetal.,于MonoclonalAntibodiesandT—CellHybridomas,563—681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Sidhuetal.,J.Mol.Biol.338(2):299_310(2004)；Leeetal.,J.Mol.Biol.340(5)1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34)12467-12472(2004)；及Leeetal.,J.Immunol.Methods284(1-2)119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；W01991/10741；Jakobovitsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovitsetal.,Nature362:255-258(1993)；Bruggemannetal.,Yearinlmmuno.7:33(1993)；美国专利No.5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；5，661，016；Marksetal.，Bio/Technology10:779_783(1992)；Lonbergetal.，Nature368:856_859(1994)；Morrison,Nature368812-813(1994)；Fishwildetal.,NatureBiotechnol.14845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；及LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4，816，567和Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851_6855(1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR0人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jonesetal.，Nature321:522_525(1986)；Riechmannetal.，Nature332:323_329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593_596(1992)。还可参见例如VaswaniandHamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions231035-1038(1995)；HurleandGross,Curr.Op.Biotech.5:428_433(1994)；及美国专利No.6，982，321和7，087，409。还可参见vanDijkandvandeWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5:368_74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原挑战生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利No.6，075，181和6，150，584，关于XEN0M0USE技术)。还可参见例如Lietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103=3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughanetal.，NatureBiotechnology14:309-314(1996)；Sheetsetal.，PNAS(USA)95:6157_6162(1998);Hoogenboomandffinter,J.Mol.Biol.227381(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5，545,807；5，545,806；5，569,825；5,625,126；5，633，425；5，661，016，及以下科学出版物Marksetal.,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonbergetal.,Nature368856-859(1994)；Morrison,Nature368812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnologyl4845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996)；LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65_93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体夕卜免疫)。参见例如Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.147(1):86_95(1991)；及美国专利No.5，750，373。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中较高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语高变区指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中011、112、113)，三个在乂1^中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xuetal.Immunity13:37-45(2000)JohnsonandWu于MethodsinMolecularBiology248:l-25(Lo,ed.,HumanPress，Totowa，NJ，2003)。实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Castermanetal.Nature363446-448(1993)；Sheriffetal.NatureStruct.Biol.3733-736(1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(⑶R)是以序列变异性为基石出的，而且是最常用的(Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196901-917(1987))。AbMHVR代表KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。环KabatAbMChothia接触LIL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96HIH31-H35BiH26-H35BH26-H32H30-H35B(Kabat编号方式)HIH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia编号方式)H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101HVR可包括如下“延伸的HVR”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-■97或89-96(L3)及VH中的26-35(HI),50-65或49-65(H2)和93-102,94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。“框架区”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基之外的那些残基。术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabatetal.，见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabatetal.，SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请No.60/640，323，EU编号方式的图)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGj包括非A和A同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4、她和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、S、￡、Y和y。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性记载于例如Abbasetal.,CellularandMol.Immunology,4thed.(ff.B.Saunders,Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的更大融合分子的一部分。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(入)。术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabatetal.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗体的残基编号方式。"Fc区链”在本文中指Fc区两条多肽链之一。人IgGFc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域_结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。"CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域；参见美国专利No.5，821，333，明确收入本文作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。“铰链区”通常定义为自人IgGl的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton,Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgGl序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgGl铰链区。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)结合，而且可使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的多种测定法来评估。“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGlFc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2Fc区、天然序列人IgG3Fc区、及天然序列人IgG4Fc区，及其天然存在变体。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc区在本文中将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%序列同一性，或至少约90%序列同一性，或至少约95%或更多序列同一性。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcYRII禾口FcYRIII0RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5，500,362或5，821，337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynesetal.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所披露的。“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcYRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源(例如从血液或PBMC)分离，如本文所述。“Fe受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA(“活化受体”)和FCYRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如DaSron,Annu.Rev.Immunol.15:203_234(1997))。FcR的综述参见例如RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capeletal.，Immunomethods4:25-34(1994)；及deHaasetal.，J.Lab.Clin.Med.126:330_41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。术语“Fe受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyeretal.，J.Immunol.117587(1976)和Kimetal.，J.Immunol.24249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie1997，Hinton2004)。测量对FeRn的结合的方法是已知的(参见例如GhetieandWard·,Immunol.Today18(12):592_598(1997)；Ghetieetal.,NatureBiotechnology,15(7)637-640(1997)；Hintonetal.,J.Biol.Chem.279(8)6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hintonetal·))。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shieldsetal.,J.Biol.Chem.9(2):6591_6604(2001)。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6，194，551B1和W01999/51642。还可参见例如Idusogieetal.,J.Immunol.1644178-4184(2000)。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marksetal.,Bio/Technology10:779_783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱^=Barbasetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA913809-3813(1994)；Schieretal.，Gene169147-155(1995)；Yeltonetal.，J.Immunol.1551994-2004(1995)Jacksonetal.，J.Immunol.154(7):3310_9(1995)；及Hawkinsetal.，J.Mol.Biol.226:889_896(1992)。“柔性接头”在本文中指包含两个或更多通过肽键相连的氨基酸残基且为由其连接的两段多肽(诸如两个Fd区)提供更多旋转自由的肽。所述旋转自由容许由柔性接头连接的两个或更多抗原结合位点各自更高效的接近靶抗原。合适的柔性接头肽序列的例子包括gly_ser、gly-ser—gly—ser、ala-ser禾口gly-gly-gly—ser。“二聚化结构域”是由至少两个氨基酸残基(一般是半胱氨酸残基)或者至少两个肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)结合形成的。所述肽或多肽可以经由共价和/或非共价结合而彼此相互作用。本文中的二聚化结构域的例子包括Fc区；铰链区；CH3结构域；CH4结构域；CHl-CL对；具有“结节”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”，如美国专利No.5，821，333中所记载的，明确收入本文作为参考；亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，参见Kostelneyetal.，J.Immunol.,1481547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉链)；异亮氨酸拉链；受体二聚体对(例如白介素_8受体(IL-8R)；和整联蛋白异二聚体，诸如LFA-I和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区；二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员和脑衍生神经营养性因子(BDNF)；参见Arakawaetal.J.Biol.Chem.269(45):27833_27839(1994)及Radziejewskietal.Biochem.32(48)1350(1993))或其二聚化区；一对能够形成二硫键的半胱氨酸残基；一对肽或多肽，各自包含至少一个半胱氨酸残基(例如约1个、2个或3个到约10个半胱氨酸残基)使得可以在所述肽或多肽之间形成二硫键(下文的“合成铰链”)；及抗体可变域。在一个实施方案中，本文中的二聚化结构域是Fc区或铰链区。抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选能结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所记载的。与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(共同)施用和/或任何次序的序贯施用。为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、绵羊、猪等。典型的是，哺乳动物指人。“病症”指任何会受益于使用本发明分子的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。病症包括细胞增殖性病症、血管发生性病症、及炎性、血管发生性和免疫学病症(包括但不限于自身免疫性病症)。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖和/或肥大有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。术语“炎性病症”和“免疫性病症”指向或描述由异常免疫学机制和/或异常细胞因子信号传导(例如异常干扰素信号传导)引起的病症。炎性和免疫性病症的例子包括但不限于自身免疫性疾病、免疫学缺陷综合征和超敏反应。术语“炎性病症”指以炎性状况为基础的或与炎性状况有关的疾病或病症。炎性病症包括但不限于自身免疫性病症、高血糖性病症和与胰岛素耐受性有关的病症。术语“自身免疫性病症”指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫性病症典型的是特征为自身反应性免疫细胞不能被免疫系统破坏；自身反应性淋巴细胞已经鉴定为过表达或以其它方式提高促存活凋亡因子的活性，或者降低促凋亡因子的表达或活性。自身免疫性病症在本文中明确排除恶性或癌性疾病或疾患，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于炎性应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化；与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合症(ARDS))；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮肾炎、皮肤狼疮)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化；雷诺氏(Reynaud)综合征；自身免疫性甲状腺炎；桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjogren)综合征；幼发型糖尿病；通常在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏(Addison)病)；牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯氏(Coombs)阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多种内分泌腺病；莱特氏(Reiter)病；僵人综合症；贝切特氏(Behcet)病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。术语“高血糖性病症”包括但不限于糖尿病及相关疾病/病症，包括但不限于高脂血症和由高血糖性病症弓I起的肥胖症。术语“与胰岛素耐受性有关的病症”包括但不限于胰岛素耐受性、多囊性卵巢综合征、冠心病和外周血管病。术语“有效量”或“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；容许治疗肿瘤；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间和/或生活质量来测量。“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有病症的以及要预防病症的。在本发明的某些实施方案中，治疗可以指抑制肿瘤生长，或者抑制自身免疫性病症。术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就本发明的多肽而言指分子特异性结合靶物并调节细胞应答(例如增殖、迁移等)的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。在此语境中，术语“调控”包括促进和抑制二者。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括肾癌(kidneyorrenalcancer)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(GIST))、胰腺癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、肝肉瘤(h印atoma)、血液学恶性肿瘤(包括非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液学恶性肿瘤)、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌(h印aticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、许旺氏细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、维尔姆斯(Wilm)氏肿瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulkydisease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(Phakomatoses)JKW(诸如与脑瘤有关的水肿)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素(诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、TAXOL和拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类，诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5_氟尿嘧唆(5-fluorouracil)禾口ara_C。更多信息可参见TheMolecularBasisofCancer,MendelsohnandIsrael编，第1章，题^J"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakamietal.，WBSaunders,Philadelphia(1995),jtMMM13页。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和乌瑞替派(ured印a)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞T^M(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；'M^^iJ]M(spongistatin)；氣芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)>美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素YII和加利车霉素ωIl(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicinA；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)>carabicin>ψ(carminomycin)^^^ΜΜ(carzinophilin)>色霉素(chromomycin)、方文线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL)和脱氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(str印tonigrin)、链佐星(Sti^ptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA)、埃坡霉素(印othilone)和5_氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6_巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酉先月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)；elfornithine；Hc利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明(Ionidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)禾口安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)；2-乙■酉先月井(ethylhydrazide)；丙卡EL月井(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2‘，2〃-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二漠卫矛酉享(mitolactol)；喊泊漠烧(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C")；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、帕利他塞的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANE)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；钼(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；奥沙利钼(oxaliplatin)；亚叶酸(Ieucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利钼(EL0XATIN)组合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。该定义还包括作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX·他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR)、来曲唑(Ietrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETA)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL);以及曲沙他滨(tr0XaCitabine)(l，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID.疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；C0X-2抑制剂，诸如塞来考昔(CELEBREX;4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(例如VEGF、VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E)；胎盘衍生生长因子(PlGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB,PDGFC,PDGFD)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-UIL-Iα、IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宫珠蛋白；制瘤素M(OSM)；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parentdrug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman,"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)禾口Stellaetal.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardtetal.,ed.,pp.247-267,HumanaPress(1985)本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、P1GF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如KlagsbrunandD'Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217_39(1991)；StreitandDetmar,0ncogene223172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo,NatureMedicine5(12)1359-1364(1999)；Toninietal.,Oncogene22:6549_6556(2003)(例如列举血管发生因子的表1)；和Sato，Int.J.Clin.Oncol.8200-206(2003)。“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如KlagsbrunandD'AmoreAnnu.Rev.Physiol.53217-39(1991)；StreitandDetmarOncogene22:3172_3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara&AlitaloNatureMedicine5(12)1359-1364(1999)；Tonini等Oncogene226549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2)；及Sato,Int.J.Clin.Oncol.8=200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。术语“免疫抑制剂”在用于本文时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统(包括调控炎症)的物质。这包括但不限于抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利No.4，665，077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素诸如皮质醇(Cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麦考酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil,MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩盖MHC抗原，如美国专利No.4，120,649中所记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(Ieflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普(etanerc印t))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素_2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-I抗体，包括抗⑶Ila和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体(pan-Tantibody)，优选抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA;Π(506;RS_61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohenetal.，美国专利No.5，114，721)；T细胞受体片段(Offneretal.，Science251:430-432(1991);WO1990/11294；Ianeway,Nature341482(1989)；及WO1991/01133)；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子有乙酰水杨酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物，等。术语“标记物”在用于本文时指与多肽直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与多肽核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。本发明的方法本发明鉴定了出于治疗目的使用本发明方法时可利用的IRTM(特别是TAM和ATM)的某些新特性和活性。慢性炎症是具有独特病因起源的许多疾病(诸如癌症、II型糖尿病和动脉粥样硬化)的共同特征。最近，巨噬细胞直接参与这些病症的发病机制(Mantovani等，Immunol.Today13:265_70，1992；Pollard,Nat.Rev.Cancer4:71_8，2004；Arkan等，Nat.Med.11:191_8，2005；Lumeng等，J.ClinInvest.117175-84,2007；Liang等，Circ.Res.1001546-55,2007；Choudhury,NatClinPractCardiovascMed2(6)309-15,2005)。为了了解它们在肿瘤中的功能，在重演人类乳腺浸润性导管癌的许多方面的PyMTtg模型中实施实验来表征TAM(Lin等，AmJ.Pathol163:2113_26，2003)。为了了解它们在其它炎性病症(包括但不限于II型糖尿病和胰岛素耐受性)中的功能，实施实验来表征来自用长期高脂肪食谱喂养的小鼠的ATM。如本文所示和如本领域所知，TAM常见于肿瘤免疫细胞浸润物中。已经将高水平的TAM与人类肿瘤中差的预后关联起来，而且在乳腺癌的遗传模型中抑制TAM分化显示出降低肿瘤进展和转移的速率(Lin等，2001)。有人提出，TAM通过生成血管发生性因子(诸如VEGF)，如此提高肿瘤的血管形成来促成肿瘤生长(Leek等1996；Lin等2006)。其他人提出，通过分泌抑制肿瘤中专职抗原呈递细胞(例如树突细胞)成熟的某些细胞因子，由此削弱此类细胞将异常肿瘤细胞呈递给免疫系统的能力，使得不发生针对肿瘤的有效免疫应答，TAM可在诱导耐受中具有间接作用(Mantovanti等2002；Pollard等，2003)。在此，显示出在上述活性之外，TAM还诱导两种特定⑶4+T调节性细胞子集FoxP3+T调节性细胞和IL-IO+Trl细胞。将TAM与幼稚T细胞一起温育则诱导IL-IO+Trl和FoxP3+T调节性细胞二者增殖及预期自那些细胞类型生成的细胞因子(IL-10和IL-17，以及极少至没有的IL-2或IL-4)生成，而将bmDC与幼稚T细胞一起温育则不具有相同效果。在培养物至包括TGFβRII则抑制TAM的这种诱导作用，提示TGFβ对于TAM诱导的对那些细胞类型的诱导是重要的。先前已经将升高水平的这些调节性T细胞子集与实体瘤和降低的整体乳腺癌存活率关联起来(Leong等，2006；Liyanage等，2002；Marshall等，2004；Seo等，2001；Curiel等，2004；及Bates等，2006)。TAM还显示出在体外诱导炎症TH17细胞，与PyMTtg荷瘤小鼠的引流淋巴结中观察到的TH17细胞数目升高有关联。虽然TAM与bmDC或腹膜巨噬细胞在它们诱导IL-17+T细胞的能力方面相似，但是那些其它类型的巨噬细胞无一能够诱导调节性和促炎性T细胞子集二者。TAM在体外诱导的T细胞谱型与乳腺荷瘤动物中增多的T细胞类型相同。本发明提供了在体外和在体内调控TAM介导的对IL-IO+Trl和FoxP3+T调节性细胞和炎症TH17细胞的诱导的方法，用于调控肿瘤生长和活性的启动、进展或严重程度。本发明还提供了通过检测TAM的存在、量和/或活性来检测肿瘤形成、进展和/或对肿瘤分期的方法。在人类及啮齿类中，肥胖与升高的脂肪组织巨噬细胞(ATM)浸润有关联。已经将肥胖与心血管疾病、糖尿病、肾病和一些类型的癌症关联起来(Flegal等，JAMA298(17)2028-37,2007)。肥胖还与使受试者偏向于胰岛素耐受性和发生II型糖尿病的慢性炎症有关联。数项最近的研究证明了ATM生成炎性细胞因子，它们能阻断脂肪细胞中的胰岛素作用且有助于系统性胰岛素耐受性(Weisberg等，J.Clin.Invest.1121796-808，2003；Arkan等，Nat.Med.11:191_8，2005；Neels和Olefsky,J.Clin·Invest.116:33_5，2006；Lumeng等，J.Clin.Invest.117175-84，2007)。在此，显示出ATM(像TAM—样)诱导两种特定⑶4+T调节性细胞子集F0XP3+T调节性细胞和IL-IO+Trl细胞，而且诱导炎症TH17细胞。在正常系统中，通过抑制常规T细胞和下调其活性，T调节性细胞在诱导耐受性形成中发挥关键作用。T调节性细胞已经显示出在多种实验性自身免疫性病症状况中是治疗性的(参见Suri-Payer和Fritzsching，SpringerSemin.Immun.(2006)28:3_16)。在此类细胞有治疗价值的某些疾病状态(诸如免疫性病症，特别是炎性和自身免疫性病症)中选择性诱导T调节性细胞的能力显然是有治疗价值的。本发明还提供了通过调控TAM或ATM存在或活性来启动和/或刺激IL-IO+Trl和FoxP3+T调节性细胞诱导的方法，该方法可用于调控炎性和自身免疫性病症的启动、进展或严重程度。TH17细胞在来自肿瘤和脂肪组织的引流淋巴结中也以升高的水平存在。TH17细胞在癌症或II型糖尿病的病理学中的作用尚不清楚。通过诱导其它促炎介导物(诸如TNFa、IL-Iβ和IL-6)的表达，IL-17可间接促进肿瘤生长。IL-17(像TNFα那样活化NF-κB)也可作为肿瘤的促存活和血管发生性因子直接起作用(Lin，和Karin，JClinInvest117(5)1175-83，2007;Takahashi，等，ImmunolLett98(2)189-93，2005;Numasaki等，JImmunol175(9)=6177-89,2005)有趣的是，ATM和TAM(对照巨噬细胞不行)在体外诱导T调节性细胞和TH17细胞二者，而且这两种群体在荷瘤和肥胖小鼠中都升高。这些数据再次强调促炎性和抗炎性机制共存，如此导致慢性炎症的状态。此类慢性炎症可以通过调控TAM或ATM存在或活性来调控。本文所述工作提供了对TAM和ATM的进一步表征。例如，TAM显示出具有腹膜巨噬细胞和bmDC在细胞因子/趋化因子生成和细胞表面标志物方面的某些特性。如本文所示，TAM表达巨噬细胞标志物F4/80和树突细胞标志物Iangerin和⑶Ilc二者。ATM表达巨噬细胞标志物F4/80和树突细胞标志物⑶Ilc二者。此外，TAM和ATM均表达趋化因子、细胞因子、趋化因子受体和细胞因子受体的不同子集(见图14A-C和E)，它们可独立地或集体地用作TAM或ATM存在和/或活性的标志物。本发明提供了自细胞群体或含有细胞的样品鉴定/检测和分离TAM和/或ATM的方法，其通过使所述群体或样品接触一种或多种试剂以检测TAM和/或ATM标志物，并任选将TAM和/或ATM与所述群体或样品的其余部分分开。本发明还提供了调控TAM和/或ATM的方法。例如，通过选择性消除或杀死TAM和/或ATM，可以阻断TAM和/或ATM活性或功能。一种用于实现此目的的方法是用TAM和/或ATM结合剂特异性靶向TAM和/或ATM(即通过只靶向同时携带巨噬细胞特异性和DC特异性两者细胞表面标志物的细胞)，并自群体中选择性消除所述被特异性靶向的细胞。例如，可以使用特异性识别F4/80和CDllc二者的双特异性抗体或其片段来特异性结合TAM和/或ATM，然而通过例如蛋白A层析或本领域公知的抗体捕捉和分离的任何其它方法，包括但不限于FACS、亲和层析和磁细胞分选，将TAM和/或ATM与剩余细胞群体/样品分开。在另一种方法中，可以特异性靶向TAM和/或ATM(即通过只靶向同时携带巨噬细胞特异性和DC特异性两者细胞表面标志物的细胞)，并自群体中选择性杀死所述被特异性靶向的细胞。例如，可以采用上文所述同一双特异性抗体(或其片段)方案，但是该抗体可另外偶联有细胞毒性分子，或者该抗体自身的效应器功能可足以触发对结合至该抗体的TAM和/或ATM的清除和破坏。使用双特异性或其它多特异性抗体不是必须的；本领域普通技术人员会认识到，用两种或更多种分开的抗体或其片段或其它结合分子来提供自细胞混合物中选择性拉出同时仍然保持结合TAM和/或ATM的一些手段，可以实现同一目的。对此类选择适宜的TAM和/或ATM细胞表面标志物可见于例如图14B和14E，而且包括但不限于I型IL-1R、IL4Ra、IL-13Ra；IL_17Ra；TGFβRII；CCR6；和CX3CRl,每一种都在TAM对ATM上展示差异表达。本发明还提供了通过特异性抑制TAM和/或ATM功能来调控TAM和/或ATM的方法。例如，TAM和/或ATM可经由一种或多种细胞信使(诸如细胞因子或趋化因子，即TAM介导的对需要TGFii活性的某些T调节性细胞或炎症T细胞的诱导，如本文所示)的分泌来介导其某些效应和活性。特异性抑制或阻断一种或多种此类通常由TAM和/或ATM分泌的细胞信使的分泌和/或自环境中消除一种或多种此类通常由TAM和/或ATM分泌的细胞信使可具有阻断TAM和/或ATM效应和活性的效果。此类抑制可以通过例如施用TAM和/或ATM细胞因子/趋化因子结合剂(包括但不限于抗细胞信使抗体或其片段(诸如抗TGFβ抗体)和小分子)来实现。由TAM或ATM表达的趋化因子和细胞因子包括但不限于图14A和14C所示细胞因子和趋化因子。本发明还提供了用于选择性生成和/或分离某些免疫细胞的方法。如本文所示，TAM和ATM都是具有巨噬细胞和树突细胞二者某些特性的专门化免疫细胞。TAM代表肿瘤中免疫浸润物的一小部分，而且难以获得。本发明基于其某些树突细胞和某些巨噬细胞二者细胞表面标志物的表达分离TAM的方法提供了自混合细胞群体获得TAM供研究或治疗用的一种有效方式。类似地，本发明基于其某些树突细胞和某些巨噬细胞二者细胞表面标志物的表达分离ATM的方法提供了自混合细胞群体获得ATM供研究或治疗用的一种有效方式。本领域普通技术人员会领会，通过使分离或纯化以在各细胞类型间不同的细胞表面标志物组合为基础，可以分开分离或纯化TAM和ATM。作为一个非限制性例子，TAM表达IL-4Rα，而ATM不然。其它例子包括但不限于那些在TAM和ATM中差异表达的细胞因子受体和趋化因子受体(见图14B和14E)。本发明还提供了通过用TAM或ATM刺激培养物自幼稚T细胞培养物选择性诱导IL-10+CD4+Trl细胞、FoxP3+⑶4+T调节性细胞和/或TH17细胞的方法。能够可再现地大量生成这三种T细胞类型对于治疗和研究是有用的。提供了包含一种或多种上文所述药剂(即IRTM靶向剂(即TAM靶向剂或ATM靶向齐IJ)和/或IRTM细胞信使靶向剂(即TAM细胞信使靶向剂或ATM细胞信使靶向剂))的组合物。本发明还提供了组合治疗方法和组合物，其中不仅掺有一种或多种特异性靶向IRTM的药剂(即TAM或ATM靶向剂和/或由TAM或ATM分泌的细胞信使)，而且掺有一种或多种化疗剂、细胞因子、趋化因子、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒剂或生长抑制剂。这些组合治疗能抑制肿瘤血管发生和生长和/或治疗炎性或自身免疫性病症。可以同时或序贯施用组合治疗。另外，提供了试剂盒。此类试剂盒可包括本文所述一种或多种组合物或组合治疗，而且可另外包括用于对需要此类治疗的受试者测量和/或施用适宜剂量的手段，而且任选进一步包括使用说明书。诊断本发明还提供了用于诊断细胞增殖性病症、血管发生性病症、及炎性、血管发生性和免疫学病症(包括但不限于自身免疫性病症)的方法和组合物。在本发明的某些实施方案中，本发明的方法比较测试和参考细胞群体中存在的TAM或ATM的水平。本文公开的、关于自巨噬细胞和树突细胞二者区分TAM和/或ATM的TAM和ATM细胞表面标志物的信息，与本领域已知的蛋白质和核酸检测系统一起，容许检测不同细胞群体/样品中的存在和比较不同细胞群体/样品中存在的相对量。测试细胞群体可以是任何数目的细胞，即一个或多个细胞，而且可以是体外、体内或离体提供的。在某些实施方案中，参考细胞群体中的细胞衍生自与测试样品(例如肿瘤细胞群体)尽可能相似的组织类型。在一些实施方案中，参考细胞群体衍生自与测试细胞群体相同的受试者，例如衍生自测试细胞群体的来源区域邻近的区域。在一些实施方案中，参考细胞群体衍生自与测试细胞群体相同的组织类型，但是是在不同时间(例如早于测试细胞群体的时间)自受试者收集的。在一些实施方案中，以规则的时间间隔(例如每天一次、每周一次、每月一次或每年一次)自受试者收集一系列参考细胞群体样品。在本发明的一个实施方案中，参考细胞群体衍生自多种细胞。例如，参考细胞群体可以是来自早先测试的细胞的TAM和/或ATM表达样式的数据库。蛋白质和核酸检测方法检测本发明蛋白质的存在、活性或量可容易地使用本领域已知方法来实施。可以在蛋白质水平测量表达，即通过测量多肽的水平。此类方法是本领域公知的，而且包括例如基于针对蛋白质的抗体的免疫测定法。可以比较测试细胞群体中一种或多种蛋白质序列的表达水平与来自参考细胞群体的一种或多种细胞中该序列的表达水平。可以使用本领域公认的、用于比较核酸序列表达的任何方法来比较测试与对照细胞群体中序列的表达。例如，可以使用GENECALLING方法来比较表达，如美国专利No.5，871，697及Shimkets等，Nat.Biotechnol.17798-803中所记载的。在本发明的某些实施方案中，测量一种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、20种或更多种、25种或更多种蛋白质序列的表达。也可采用本领域已知的多种测定法技术，诸如竞争性结合测定法、直接或间接三明治式/夹心式测定法和免疫沉淀测定法(以异相或均相进行)(Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158)。测定法中使用的抗体或其抗原结合片段可以用可检测模块标记。可检测模块应当能够直接或间接生成可检测信号。例如，可检测模块可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光化合物，诸如荧光素异硫氰酸、罗丹明或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以采用本领域已知的、用于偶联抗体至可检测模块的任何方法，包括Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.,40219(1981)；及Nygren,J.Histochem.禾口Cytochem.,30407(1982)记载的那些方法。核酸检测技术也是本领域公知的，而且在一个实施方案中可以用来评估一种或多种TAM和/或ATM细胞表面标志物或其它TAM和/或ATM特异性分子的mRNA的存在，并如此测定吸取细胞样品的细胞群体中TAM和/或ATM的存在或量。在某些实施方案中，评估编码至少两种不同TAM和/或ATM细胞表面标志物的mRNA的存在或量。重组DNA
技术领域：
中普遍知道的、可用于评估核酸的存在、量或活性的方法记载于例如Ausubel等eds.(1993)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY及Kriegler(1990)GeneTransfer和Expression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY。任选的是，测试细胞群体与参考细胞群体之间差异表达序列的比较可以相对于对照核酸来进行，所述对照核酸的表达不依赖所测量的参数或条件。可以使用测试和参考核酸中对照核酸的表达水平来标准化所比较群体中的信号水平。本领域普通技术人员能容易地确定合适的对照核酸。诊断或标志物集合本发明还提供了标志物集合(markerset)来鉴定TAM和/或ATM。在某些实施方案中，这些标志物集合在试剂盒中提供，用于评估TAM和/或ATM的存在。例如，标志物集合可以包括两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多、十二种或更多、十三种或更多、十四种或更多、十五或更多、二十种或更多或整个集合的分子。所述分子是编码TAM和/或ATM的胞内蛋白质、分泌蛋白质或细胞表面标志物(包括但不限于F4/80、⑶Ilc和langerin)的核酸。在本发明的一个实施方案中，提供了检测一种或多种此类蛋白质的抗体。如本文所示，TAM和ATM表达巨噬细胞和树突细胞二者的细胞表面标志物，而且如此用于检测TAM和/或ATM的标志物集合可包含巨噬细胞标志物和树突细胞标志物二者。应当认识到，一般可以单独使用树突细胞标志物来检测ΤΑΜ、ATM和树突细胞，而且一般可以单独使用巨噬细胞标志物来检测ΤΑΜ、ATM和巨噬细胞。治疗用途根据本发明期待的是，单独的或彼此组合的或与其它治疗剂(包括但不限于化疗齐U、细胞因子、趋化因子和抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒剂和生长抑制剂)组合的调控物组合(包括TAM和/或ATM激动剂、TAM和/或ATM拮抗剂、TAM结合剂、ATM结合剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂、ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂、ATM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂和ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂)可以用于治疗多种疾患，诸如细胞增殖性病症、血管发生性病症、及炎性、血管发生性和免疫学病症(包括但不限于自身免疫性病症)。在一个实施方案中，TAM生存力、存在或活性的调控物用于抑制癌细胞或肿瘤生长。在本发明的某些实施方案中，TAM结合剂、TAM拮抗剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂和/或TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂用于治疗例如增殖性病症、抑制癌细胞或肿瘤生长或抑制肿瘤转移。还参见本文中标题为组合疗法的小节。待治疗的赘生性病症的例子包括但不限于本文中术语“癌症”和“癌性”下所记载的那些。在另一个实施方案中，TAM生存力、存在或活性的调控物用于治疗免疫性病症，包括但不限于自身免疫性病症。在本发明的某些实施方案中，TAM激动剂、TAM结合剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂和/或TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂用于刺激TAM存在、生长和/或活性，用于治疗自身免疫性病症，例如通过刺激TAM诱导的来自幼稚T细胞群体的IL-10+CD4+Trl细胞和FoxP3+CD4+T调节性细胞生长和分化。要治疗的自身免疫性病症的例子包括但不限于本文中术语“自身免疫性病症”下所记载的那些。在另一个实施方案中，ATM生存力、存在或活性的调控物用于抑制炎性病症，包括但不限于高血糖性病症和胰岛素耐受性病症。在本发明的某些实施方案中，ATM结合剂、ATM拮抗剂、ATM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂用于抑制炎性病症，包括但不限于高血糖性病症和胰岛素耐受性病症。组合疗法如上所述，本发明提供了组合疗法，其中TAM结合剂、ATM结合剂、TAM激动剂、ATM激动剂、TAM拮抗剂、ATM拮抗剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂、ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂、ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂或ATM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂与另外的疗法组合施用。例如，TAM结合剂可以与本发明的不同药剂、激动剂或拮抗剂组合施用来治疗例如增殖性病症或自身免疫性病症。又例如，ATM结合剂可以与本发明的不同药剂、激动剂或拮抗剂组合施用来治疗例如炎性病症，包括但不限于高血糖性病症或胰岛素耐受性病症。在某些实施方案中，可以采用别的药剂，例如化疗剂、细胞因子、趋化因子、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒剂、抗炎剂和生长抑制剂。本发明的药剂、激动剂和拮抗剂可以与对那些目的有效的另一种药剂连续地或组合地施用，或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。或者/另外，可以施用本发明的多种拮抗剂、药剂和/或激动剂。本发明的激动剂、拮抗剂和/或药剂的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或作为使用相同或不同施用路径的两种或多种不同组合物。或者/另外，施用可以连续地、按任何次序进行。在某些实施方案中，范围从数分钟到数天、到数周、到数月的间隔可以存在于两个或多个组合物的施用之间。然而，还涵盖同时施用或先施用本发明的不同的激动齐U、拮抗剂或药剂。与本发明的激动剂、拮抗剂或药剂组合施用的治疗剂的有效量将处于医师或兽医的判断之内。进行剂量施用和调整来实现待治疗疾患的最大管理。剂量将另外取决于这些因素，诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定的患者。在某些实施方案中，数种相似分子(例如数种拮抗剂)的组合强化了单一分子的效力。术语“强化”是指在其常用的或批准的剂量下治疗剂的效力方面的改善。还参见本文中标题为药物组合物的小节。在本发明的某些方面，可用于使用本发明TAM和/或ATM结合剂、TAM和/或ATM拮抗剂、TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂和TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂的组合肿瘤治疗的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射治疗(例如照射或施用放射性物质)、化学疗法、使用本文所列的和本领域已知的抗癌剂的治疗或其组合)。或者/另外，结合本文公开的相同的或两种或更多不同的抗原的两种或更多抗体可以共施用给患者。有时，可能有益的是还向患者施用一种或多种细胞因子。化疗剂在某些方面，本发明提供了阻断或降低肿瘤生长或癌细胞生长的方法，其通过向易患癌症或诊断有癌症的患者施用有效量的本发明的TAM拮抗剂、TAM结合剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂和/或TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂以及一种或多种化疗剂。多种化疗剂可以在本发明的组合治疗方法中使用。所涵盖的化疗剂的例示性的和非限制性的列表在本文术语“化疗剂”下提供。本领域普通技术人员将理解的是，适合剂量的化疗剂一般将接近临床疗法中所早就采用的那些，在所述临床疗法中化疗剂被单独地或与其它化疗剂组合地施用。剂量的变异将有可能存在，这取决于所治疗的疾患。施行治疗的医师将能够确定各个受试者的适合剂量。抗体本发明的抗体包括特异性结合本发明蛋白质的抗体和此类抗体的抗体片段。本发明的多肽或蛋白质包括但不限于TAM细胞表面标志物(包括但不限于F4/80、⑶Ilc和例如图14B和14E所列的、由TAM表达的细胞因子和趋化因子受体)和TAM细胞因子或趋化因子(包括但不限于TGFii和例如图14A和14C所列的、由TAM表达的细胞因子和趋化因子)。在某些方面，本发明的多肽或蛋白质是特异性结合TAM细胞表面标志物(包括但不限于F4/80、CDllc和例如图14Β和14Ε所列的、由TAM表达的细胞因子和趋化因子受体)和TAM细胞因子或趋化因子(包括但不限于TGFii和例如图14Α和14C所列的、由TAM表达的细胞因子和趋化因子)的抗体。本发明的抗体进一步包括作为抗血管发生剂或血管发生抑制剂的抗体，作为髓样细胞减少剂的抗体，作为抗癌剂的抗体，或本文所述其它抗体。例示性的抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、双特异性抗体、多特异性抗体、异源偶联抗体、多价抗体、含效应器功能的抗体等。多克降抗体本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员知道的。例如，本发明的多克隆抗体通过在动物中一次或多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化药剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烃基))将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质(例如匙孔i威血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制齐U)偶联可能是有用的。在一个实施方案中，通过将例如IOOyg或5yg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对本发明的分子、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。典型的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。单克降抗体针对本文所述抗原的单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature256495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参加例如美国专利No.4,816,567)来制备。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠或短尾猴(macaquemonkey))以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基典型的含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。典型的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠_人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对感兴趣靶物的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域知道的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如MunsonandPollard,Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析来测定。在鉴定到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。通过常规免疫球蛋白纯化规程(诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。单克隆抗体还可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利No.4，816，567中所记载的。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更详细的描述。在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等，Nature348:552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581_597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.AcidsRes.21:2265_2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换同源鼠序列(美国专利No.4，816，567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851(1984)),或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。人源化抗体和人抗体本发明的抗体可以包括人源化抗体或人抗体。人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature321522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323_327(1988)；Verhoeyen等，Science2391534-1536(1988))，通过用啮齿类⑶R序列替代人抗体的相应序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4，816，567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。用于构建人源化抗体的人可变域(包括轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89=4285(1992)；Presta等，J.Immunol.1512623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种典型的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质性地涉及对抗原结合的影响。或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551(1993)Jakobovits等，Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等，YearinImmuno.733(1993)；及Duchosal等Nature355:258(1992)。人抗体也可以衍生自噬菌体展示库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227=381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)；Vaughan等NatureBiotech14:309(1996))。人抗体还可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括噬菌体展示库(HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种格式进行，综述参见例如Johnson，KS.andChiswell,DJ.，CurOpininStructBiol3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。例如，Clackson等，Nature352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。例如通过基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMBOJ.12:725_734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5，565，332和5，573，905。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)及Boerner等，J.Immunol.147(1):86_95(1991))。还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5，567，610和5，229，275)。抗体片段本发明还包括抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107—117(1992)；Brennan等，Science229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/TechnologylO:163_167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于本领域普通技术人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见W093/16185；美国专禾IjNo.5，571，894；及美国专利No.5，587，458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见AntibodyEngineering,Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5，641，870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。多特异性抗体(例如双特异性的)本发明的抗体还包括例如多特异性抗体，其具有对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体(诸如三特异性抗体或其它特异性(即一种分子中涵盖四种或更多种特异性)抗体)。本领域已知的BsAb的例子包括一个臂针对肿瘤细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗FcyRI/抗⑶15、抗pl85HEK2/FCyRIII(⑶16)、抗CD3/抗恶性B细胞(IDlO)、抗CD3/抗ρ185·2、抗CD3/抗ρ97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗0VCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AM0C-31)/抗CD3；一个臂特异性结合肿瘤抗原而一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗皂草素/抗Id-Ι、抗⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-a(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作纤溶剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcyRIII)；用于传染病治疗的BsAb，诸如抗⑶3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体⑶3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗ρ185ΗΕΚ2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗⑶3/抗⑶8/抗⑶37。在本发明的某些方面，双特异性抗体中的一抗体可偶联至巨噬细胞特异性细胞标志物，而另一抗体可偶联至树突细胞特异性细胞标志物。在某些实施方案中，这样的抗体会更紧密地结合携带给定的巨噬细胞特异性细胞标志物和给定的树突细胞特异性细胞标志物二者的细胞，超过只携带一种或另一种标志物的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于W093/08829及Traunecker等，EMBOJ.10:3655_3659(1991)。依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体_抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于W094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。依照例如WOgeATOii中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物(诸如同二聚体)提高异二聚体产量的机制。本领域还知道自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brerman等，Science229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'_SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175:217_225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达VEGF受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(\)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的Vh和\结构域与另一个片段上的互补八和Vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152=5368(1994)。还涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。异源偶联抗体双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体，它们是本发明的抗体。例如，此类双特异性抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4，676，980)，及用于治疗HIV感染(W091/00360,WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来生成异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于例如美国专利No.4，676，980。多价抗体本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是O或1。例如，多肽链可包含VH-CH1-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CHl-VH-CHI-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。多价抗体可具有针对同一抗原的多个结合位点，或针对两种或更多种不同抗原的结合位点。效应器功能工稈改造可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强抗体在治疗特定病症或疾病中的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176:1191_1195(1992)和Shopes,B.，J.Immunol.148=2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，CancerResearch53=2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-CancerDrugDesign3:219_230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5，739，277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1JgG2JgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。免疫偶联物本发明还涵盖包含本文所述抗体且其偶联至细胞毒剂的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括但不限于例如212Bi、131I、mIn、9°Y和186Re。可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂上文已有描述。例如，BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱、5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的药剂家族(美国专利5，053，394，5，770，710)、埃斯波霉素类(美国专利5，877，296)等(还可见本文中化疗剂的定义)可以偶联至本发明的抗体或其片段。为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗体或其片段。例子包括但不限于例如211At、131I、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、mIn、Lu的放射性同位素等。在将偶联物用于诊断时，它可包含放射性原子以用于闪烁照相研究，例如"mtc或1231，或自旋标记物以用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像(MRI))，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，肽可以生物合成，或者可以通过化学氨基酸合成法合成，其中使用牵涉例如以氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如"mtc或123I、186Re、188Re和mIn。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。I0D0GEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978))可用于掺入碘-123。参见例如Chatal,MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy,CRCPress，1989，其详细记载了其它方法。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、炭疽毒素保护性抗原、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚^MM(sarcin)(Aleutitesfordii)(dianthinprotein)>美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酷霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)、依诺霉素(enomycin)禾口单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science238=1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，CancerResearch52127-131(1992)；美国专利No.5，208，020)。或者，可通过例如重组技术或肽合成来生成包含抗VEGF和/或抗本发明蛋白质抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物两部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏偶联物的期望特性。在某些实施方案中，将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联以用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。在某些实施方案中，在抗体与具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成免疫偶联物。m^mm^^.mm本发明进一步提供了偶联至一个或多个美登木素生物碱类分子的本发明抗体。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)分离到(美国专利No.3，896，111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4，151，042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利No.4，137，230；4,248，870；4，256，746；4，260，608；4，265，814；4，294，757；4，307，016；4，308，268；4，308，269；4，309，428；4，313，946；4，315，929；4，317，821；4，322，348；4，331，598；4，361，650；4，364，866；4，424，219；4，450，254；4，362，663；及4，371，533。本发明的抗体可以偶联至美登木素生物碱类分子且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示出功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5，208，020及上文提及的其它专利和非专利出版物中披露了合适的美登木素生物碱类。在一个实施方案中，美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。本领域知道许多连接基团可用于生成抗体_美登木素生物碱类偶联物，包括例如美国专利No.5，208，020或欧洲专利0425235Bl及Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)中所披露的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的，优选二硫化物和硫醚基团。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与美登木素生物碱类的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。典型的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723_737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫化物连接。根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。加利车霉素另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739，116；5,767，285；5，770，701；5,770，710；5,773，001；5，877，296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于ΥΛα2\α/、N-乙酰基-γΛPSAG和θ1JHinman等，CancerResearch53:3336-3342(1993)；Lode等，CancerResearch58:2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。其它抗体修饰本文还涵盖本发明抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液。此类技术披露于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,Α.编，1980。脂质体和纳米颗粒本发明的多肽可以配制成脂质体。例如，本发明的抗体可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774030(1980)；及美国专利No.4，485，045和4，544，545中所记载的。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5，013，556。一般而言，脂质体的配制和使用是本领域技术人员所知道的。可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.257:286_288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂(诸如多柔比星)。参见Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19)1484(1989)。对本发明多肽的共价修饰本发明多肽(例如本发明的蛋白质、本发明蛋白质的抗体、多肽拮抗剂或激动剂片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割所述多肽来生成。多肽的其它类型共价修饰如下引入分子，即通过将多肽的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂起反应，或者通过将经修饰的氨基酸或非天然的氨基酸掺入正在增长的多肽链，例如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991)；Noren等，Science244182(1989)；及美国专利申请出版物20030108885和20030082575。半胱氨酰残基最常见的是与α-卤代乙酸(盐/酯)(和相应的胺)起反应，诸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-i3-(5-imidOZOyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(盐/酯)、N_烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸(盐/酯)、2_氯汞基-4-硝基酚或(4_)氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑起反应而衍生化。组氨酰残基通过与二乙基焦碳酸(盐/酯)在pH5.5-7.0起反应而衍生化，因为此试剂相对特异于组氨酰侧链。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；此反应通常在PH6.0的0.IM二甲胂酸钠中进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐起反应。用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。适于衍生化含α-氨基的残基的其它试剂包括亚氨基酯，诸如皮考啉亚氨酸甲酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4_戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸(glyoxylate)的反应。精氨酰残基通过与一种或数种常规试剂起反应来修饰，其中有苯甲酰甲醛(phenylglyOXal)、2，3-丁二酮、1，2_环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能基的高PKa所以需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基起反应。酪氨酰残基可以进行特异性修饰，对在酪氨酰残基中引入光谱标记物特别感兴趣，其通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷起反应。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成邻乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备带标记物的蛋白质以用于放射免疫测定法。羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N=C=N-R')起反应而进行选择性修饰，碳二亚胺中的R和R’是不同的烃基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3_(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子起反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷酰胺酰残基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(Τ.Ε.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。另一类共价修饰牵涉向本发明的多肽化学或酶促偶联糖苷。这些规程的优点在于它们不需要在具有N-或0-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中生成多肽根据所使用的偶联模式，可以将糖附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法记载于1987年9月11日公布的WO87/05330和Aplinandffriston,CRCCrit.Rev.Biochem.pp.259-306(1981)。本发明多肽上存在的任何碳水化合物模块的消除可通过化学或酶促方法实现。化学的脱糖基化作用需要将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(linkingsugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化学的脱糖基化作用记载于Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118131(1981)。碳水化合物模块(例如抗体上的)的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，记载于Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)。本发明多肽的另一类共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利No.4，640,835；4,496，689；4,301，144；4，670，417；4，791，192或4，179，337所列方式。载体、宿主细胞和重组方法本发明的多肽可以使用易于获得的技术和材料而重组生产。为了重组生产本发明的多肽，例如本发明的蛋白质，例如本发明的抗体，分离编码它的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码本发明多肽的DNA易于使用常规规程分离和测序。例如，对编码单克隆抗体的DNA分离和测序，例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。信号序列构件本发明的多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽典型的是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列典型的是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自下组的原核信号序列替代碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中记载的信号替代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。将此类前体区(precursorregion)的DNA以符合读码框的方式与编码本发明多肽的DNA连接。复制起点构件表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒PBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。诜择基因构件表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(典型的是灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂(诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的生长来选择经编码本发明多肽、野生型DHFR蛋白质和另一种选择标志(诸如氨基糖苷3‘-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4，965，199。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒Yrp7中的trpl基因(Stinchcomb等，Nature282:39(1979))。trpl基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones,Genetics85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trpl损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)。此外，衍生自1.6μπι环状质粒pKDl的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。VandenBerg,Bio/Technology8:135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology9968-975(1991)。启动子构件表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码本发明多肽的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码本发明多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP73，657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录本发明多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4，419，446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4，601，978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β“干扰素cDNA还可参见Reyes等，Nature297:598_601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。增强子元件构件常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。典型的是，使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297:17-18(1982)。可以将增强子剪接入载体，位于多肽编码序列的5'或3'位置，但是典型的位于启动子的5'位点。转录终Ih构件用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码本发明多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中披露的表达载体。宿主细胞的诜择和转化适于克隆或表达本文载体中的编码本发明多肽的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266，710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Str印tomyces)。典型的是，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294仏了031，446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌8、大肠杆菌乂1776仏1031,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码本发明多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.Iactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36，906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183，070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomycesoccidentalis；禾口丝状真菌，i者如例如脉抱菌属(Neurospora)>(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)禾口黑曲霄(A.niger)。适于表达糖基化本发明多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖AutographacalifornicaNPV的L-1变体禾口家香BombyxmoriNPV的Bm_5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243_251(1980))；猴肾细胞(CVLATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442)；人肺细胞(Wl38,ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44_68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝肉瘤系(HepG2)。用上文所述用于生产本发明多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。培养宿主细胞可以在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等，Meth.Enz.5844(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)；美国专利No.4，767，704；4，657，866；4，927，762；4，560，655；或5，122，469；W090/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、PH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。多肽纯化本发明的多肽或蛋白质可以是纯化的。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成本发明的多肽，或者直接分泌入培养基。可以从培养物的培养液或者从宿主细胞溶胞液回收本发明的多肽。如果是膜结合的，那么可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促切割从膜上释放它。本发明多肽的表达中所采用的细胞可通过各种物理或化学手段破碎，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。以下规程是合适的蛋白质纯化规程的例子通过离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的层析，肝素SEPHAR0SE上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如S印hadexG-75的凝胶过滤；用蛋白ASiipharose柱去除杂质诸如IgG；及用金属螯合柱结合带表位标签形式的本发明多肽。可以采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，而且记载于例如Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990)；Scopes,ProteinPurificationPrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)。所选择的纯化步骤取决于例如所用纯化方法的本质和所生成的具体本发明多肽。例如，可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，典型的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人Yl、Y2或重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人Y3(Guss等，EMBOJ.51567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质(诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含Ch3结构域，则可使用BakerbondABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如上文所述的。还可参见Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)，其记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。药用配制剂通过将具有期望纯度的分子(例如多肽)与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第I6版，0sol，A.编，I98O)混合来制备本文所述和依照本发明使用的本发明药剂(例如TAM和/或ATM结合剂或TAM和/或ATM分泌细胞信使结合剂)及其组合的治疗用配制剂，以冻干剂型或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液。此类技术披露于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.编，1980。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过例如使用无菌滤膜过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3，773，919)、L_谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(_)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇_二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。还可参见例如美国专利No.6，699，501，其记载了具有聚电解质覆盖物的胶囊。还涵盖可以通过基因疗法将本发明的药剂(例如TAM激动剂、TAM拮抗剂或TAM细胞因子/趋化因子分泌的激动剂或拮抗剂)导入受试者。基因疗法指通过给受试者施用核酸进行的疗法。在基因疗法的应用中，为了实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如为了替换缺陷基因，将基因引入细胞。“基因疗法”包括通过单次处理实现持久效果的传统基因疗法及牵涉一次或重复施用治疗上有效的DNA或mRNA的基因治疗剂施用二者。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于阻断某些基因的体内表达。早已显示可以将短反义寡核苷酸输入细胞，在那里它们起抑制剂的作用，尽管由于细胞膜对它们的摄取受限制因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143_4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以增强它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。关于基因疗法的方法的一般性综述参阅例如Goldspiel等，ClinicalPharmacy12:488-505(1993)；Wuandffu,Biotherapy3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science260:926-932(1993)；MorganandAnderson,Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；及May，TIBTECH11:155-215(1993)。重组DNA
技术领域：
普遍知道的、可以使用的方法记载于Ausubel等人编(1993)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY禾口Kriegler(1990)GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress，NY。有多种技术可用于将核酸引入活细胞。所述技术可根据核酸是在体外转移入培养的细胞还是在体内转移入预期宿主的细胞而变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒(典型的是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，TrendsinBiotechnologyll:205_210(1993))。例如，体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂类有例如DOTMA,DOPE和DC-Chol)进行的转染。在基因疗法中使用病毒载体的例子可参阅Clowes等，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等，Blood831467-1473(1994)；SalmonsandGunzberg,HumanGeneTherapy4129-141(1993)；GrossmanandWilson,Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3110-114(1993)；BoutHumanGeneTherapy5:3—10(1994)；Rosenfeld等，Science252:431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell68143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91:225_234(1993)；及Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289_300(1993)。在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂(诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等)一起提供核酸来源。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu等，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)禾ΠWagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414(1990)。关于基因标记和基因疗法方案的综述参阅Anderson等，Science256808-813(1992)。剂量和施用依照已知方法将本发明的药剂(ΤΑΜ和/或ATM结合剂、TAM和/或ATM激动剂、TAM和/或ATM拮抗剂、TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂、TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂和/或TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗齐U)施用于哺乳动物患者(即人类患者)，诸如静脉内施用(像推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入路径，和/或皮下施用。在某些实施方案中，本发明的治疗牵涉组合施用本发明的组合物和一种或多种别的治疗剂(例如化疗剂、细胞因子、趋化因子、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂和生长抑制剂)。本发明还涵盖施用针对同一抗原的多种抗体或针对本发明不同蛋白质的多种抗体。在一个实施方案中，与本发明的组合物一起施用不同化疗剂的混合物。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和/或任一次序的顺次施用。在一个实施方案中，有一段时间所有(两种或更多)活性剂同时发挥其生物学活性。对于疾病的预防或治疗，本发明药剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抑制剂的响应、及主治医师的判断。将抑制剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在组合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的本发明组合物的施用量和/或本发明组合物和一种或多种其它治疗剂的共施用量。药剂组合的施用效果可以是叠加的。在一个实施方案中，施用的效果是协同效应。治疗协同量指协同的或显著的减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的本发明组合物和一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂或抗癌剂)的量。根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.l_20mg/kg)本发明药剂、激动剂或拮抗剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约lyg/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型的是，临床医师将会施用本发明的分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易的监测本发明疗法的进展。例如，血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体，诸如AVASTIN(Genentech))的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。在另一个例子中，此类化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。化疗的准备和剂量给药方案还记载于ChemotherapyServiceEd.，Μ.C.Perry,Williams&ffilkins,Baltimore,MD(1992)。治疗功效在一些实施方案中，本发明治疗的功效可以通过本领域已知的各种终点来测量。在一个实施方案周，基于TAM的治疗的功效可以通过评估赘生性或非赘生性病症中常用的多种终点(endpoint)来测量。例如，癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。因为本文所述药剂靶向并渗透肿瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它们代表了一类不同的抗癌药，并因此可以要求与标准抗赘生性细胞疗法不同的对药物的临床应答的测量和定义。例如，二维分析中大于50%的肿瘤收缩是宣告响应的标准截留。然而，本发明的抑制剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发瘤的收缩，或者可以仅仅发挥抑制肿瘤效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物和通过放射学成像测量响应。在一个实施方案中，本发明治疗的功效可以通过评估自身免疫性病症中常用的多种终点来测量。例如，自身免疫性病症治疗可以通过以下方法来评估，包括但不限于疾病原发性或继发性特征的减轻或停止、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性。相同的逻辑可应用于使用本领域普通技术人员常用来评估本发明治疗要解决的特定病症的终点测量本发明治疗的功效。制品在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗或诊断上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器、标签和包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。在一个实施方案中，所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。在一个实施方案中，所述组合物中的至少一种活性药剂是TAM和/或ATM结合剂或TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。在另一个实施方案中，所述组合物中的至少一种活性药剂是TAM和/或ATM激动剂或至少一种TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。在另一个实施方案中，所述组合物中的至少一种活性药剂是TAM和/或ATM拮抗剂或至少一种TAM和/或ATM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。在某些实施方案中，所述组合物进一步包括至少一种第二活性分子，包括但不限于化疗剂、细胞因子、趋化因子、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞毒剂和生长抑制剂。容器上或与容器相连的标签指明该组合物用于治疗所选择的疾患。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。本发明的制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括别的活性剂、其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。应当理解，在此描述的实施例和实施方案仅用于例示目的，根据这些将为本领域技术人员提供各种修改或变化，它们包括在本申请的精神和范围、以及所附权利要求的范围内。认为本说明书足以使本领域技术人员能实施本发明。通过述及，将本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请完整收入本文用于艘游目的。实施例实施例1髓样浸润物的组成和定位通过免疫组织化学评估了MMTV-PyMT诱导的乳腺肿瘤中的免疫浸润物的组成和定位。购买对Friend白血病病毒B株(“FVB”)敏感的野生型小鼠(CharlesRiver)，并且在无病原体的设施中饲养在FVB背景中包含MMTV.PyMTtg或匪17.Her2tg肿瘤的小鼠。将来自MMTV.PyMTtg小鼠的肿瘤在OCT溶液中包埋和冷冻。使用标准规程，将冷冻切片切成5微米薄切片，于室温干燥，并用冰冷的丙酮固定。将内源过氧化物酶用葡萄糖氧化酶于37°C淬灭60分钟。用PBS漂洗切片，并用亲合素生物素封闭试剂盒(Vector)依照制造商的指令封闭内源亲合素和生物素。将切片用含10%家兔血清的3%BSA/PBS于室温封闭30分钟，然后与在封闭血清中稀释的适宜抗体一起于室温温育60分钟，以大鼠IgG2b作为阴性对照。将切片用TBST漂洗，并与适宜的生物素化二抗一起于室温温育30分钟。依照标准规程对切片显色。大鼠抗⑶45(LCA)抗体得自Pharmingen，家兔抗⑶3抗体得自DAK0，生物素化山羊抗家兔IgG和生物素化家兔抗大鼠IgG得自Vector，大鼠抗F4/80抗体得自Serotec。将肿瘤样品首先用抗CD45抗体处理以检测白细胞。如图IA所示，在肿瘤和基质中鉴定出显著的白细胞浸润物。为了进一步阐明浸润物的组成，用抗F4/80抗体或抗CD3抗体(分别作为巨噬细胞和T细胞的标志物)处理样品。在抗F4/80抗体处理后观察到的染色样式与用抗CD45抗体处理后观察到的相似，指示大部分CD45+白细胞是巨噬细胞(比较图IB与图1A)。虽然在肿瘤浸润物内观察到CD3+细胞，但是它们不如F4/80巨噬细胞普遍(比较图IC与图1B)。通过流式细胞术证实和扩充了结果。简言之，将肿瘤切成碎块，并用胶原酶II、IV和DNA酶(Gibco和Sigma)于37°C消化15分钟。将准备好的肿瘤细胞样品用荧光标记的、对不同髓样子集特异性的抗体处理，包括抗⑶lib、抗GR-1、抗Nkl.1、抗DX5、抗MHCII、抗CDllc、抗F4/80和抗PD-Ll(Pharmingen、Serotec和eBioscience)。将所有细胞在染色之前用适宜的血清或纯化的IgG封闭，并且还使用标准规程用碘化丙啶对细胞染色以排除死细胞。使用FACSCalibur或LSRII(都是BectonDickinson)实施分析。淋巴样肿瘤浸润物中的主要细胞类型是⑶Ilb+细胞(见图1D)。观察到8.4士1.8%的NKl.l_DX5TDllb+髓样浸润物。大多数那些髓样细胞是Gr_rF4/80s巨噬细胞(77.9士11.3%)。在剩余的CDllb+细胞中，11.5士4.3%是Gr_rF4/80低定居组织单核细胞(Mokt)，1.1士0.5%是Gr-Γ炎症单核细胞(Moif)，而9.5士4.3%是Gr-Γ嗜中性粒细胞(见图1E)。已经报告了荷瘤宿主通常展现白细胞增多(Serafini等，2004)。因而，还通过FACS分析评估了MMTV-PyMT小鼠外周的白细胞组成，如上所述。与无瘤对照FVB小鼠(4.2士1.IxlO6)相比，在携带MMTV-PyMT诱导的肿瘤的小鼠中观察到外周血单个核细胞(“PBMC”)总数2.3倍的增加(9.7士3.2xl06)(图2A)。在荷瘤小鼠中观察到的这种总白细胞增加伴随有CDllb+髓样细胞频率的升高(70.1士15.)，与它们在无瘤对照小鼠中的发生率(19.1士5.5%)相比(图2B)。总之，总PBMC的增加加上⑶Ilb+细胞频率的升高导致荷瘤小鼠中外周髓样细胞8.5倍的增加。这种增加主要是由于嗜中性粒细胞12.5倍的扩增(6.0士1.5x106/mL比对照小鼠中的0.5士0.2xl06/mL)，而Moif和Moet分别只增加了5倍(0.5士0.2xl06/mL比0.1士0.04xl06/mL)和2.5倍(0.5士0.2xl06/mL比0.2士0.IxlO6/mL)。与在对照动物中观察到的相比，血液中嗜中性粒细胞对单核细胞的比例也略有升高(图2C)。在正在生长的肿瘤内，血管形成程度是异质的，而且低氧张力的区域是常见的，且常常与坏死有关。为了进一步了解髓样细胞在肿瘤中的作用，使用免疫荧光染色来关于PyMTtg肿瘤的血管系统定位Moif、嗜中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞(“ΤΑΜ”)。将来自10-14周龄MMTV.PyMTtg小鼠的肿瘤包埋在OCT溶液中并骤冻。使用标准规程将OCT冷冻肿瘤组织用分别对F4/80(Serotec)、Ly_6C(Pharmingen)或Ly_6G(Pharmingen)(分别用于鉴定1々1^0"或嗜中性粒细胞)，以及内皮标志物⑶31(Pharmingen)(用于显现组织中的任何血管)特异性的抗体染色(见例如实施例1)。结果显示于图1F-H。图像图示了F4/80+TAM的定位非常接近内皮细胞和肿瘤的坏死区域(见图1F)。类似的，检测到嗜中性粒细胞接近内皮细胞，而且也在肿瘤的坏死区域中(见图1G)。相反，Moif的定位几乎完全在肿瘤的坏死区域内或附近(见图1H)。先前提出单核细胞迁移至肿瘤的低氧区域并分化成巨噬细胞(Yamashire等，1994；Murdoch等，2004)。已知，应答低氧，TAM上调低氧诱导的因子HIF-Ia和HIF_2a的表达，它们继而改变TAM血管发生、代谢和吞噬活性(Mantovani等，2006；Lewis和Murdoch，2005)。值得注意的是，在体外在低氧条件下培养的Moif和MOif衍生巨噬细胞分泌水平比Moet和Mokt衍生巨噬细胞高得多的VEGF-A(数据未显示)。实施例2=TAM的表征A.TAM表达⑶Ilc和Langerin且展示专职抗原呈递细胞的特征巨噬细胞和树突细胞(“DC”)都有能力捕获抗原并将它们呈递给T细胞。为了更好地了解TAM在T细胞应答调控中的作用，评估肿瘤内常常与抗原呈递有关的基因的表达。依照实施例1中描述的方法对TAM实施针对通常在髓样或DC细胞上表达的标志物的免疫组织化学分析。大鼠抗？4/80抗体得自561~(^6(3，大鼠抗0)1113抗体得自68108(^61^，而大鼠抗CDllc抗体得自Pharmingen。一般如实施例1中所述实施针对抗人langerin(CD207)的免疫组织化学，但是将组织切片脱蜡并使用LabVision的PT模块在靶物恢复缓冲液(pH6.0，DakoCytomation)中于99°C进行抗原恢复20分钟，随后冷却20分钟。山羊抗langerin得自R&DSystems,而生物素化家兔抗山羊IgG得自VectorLabs。有少数例外，大多数组织定居巨噬细胞(例如腹膜巨噬细胞)是⑶llb+F4/80+⑶llc_细胞，而髓样DC(例如骨髓衍生DC)是⑶llb+CDlIc+细胞且缺乏F4/80表达。令人惊讶的是，观察到来自PyMT衍生肿瘤的⑶llb+ΤΑΜ不仅在细胞表面处表达F4/80,而且还表达高水平的⑶Ilc(图3A)。在自匪TV_HER2tg小鼠分离的TAM中观察到相似的结果(数据未显示)。来自PyMTtg小鼠的OCT冷冻肿瘤的组织学显示TAM共表达F4/80和CDllc(图3B)，这得到了对在体外培养60小时的分离的TAM的免疫荧光研究的进一步证实(图3C)。同样令人惊讶的是，来自PyMTtg小鼠的TAM还表达C型凝集素langerin，一种迄今已知主要由LangerhansDC(LhDC)表达的蛋白质(Kissenpfennig和Milissen，TrendsImmunol27132-9，2006；Kaplan等，Immunity23:611-20，2005)(图3D)。由于鼠和人LangerhansDC(LhDC)的发育依赖TGFβ1信号传导(Borkowski等，JExpMed184:2417-22，1996Jaksits等，JImmunol163:4869-77,1999)，因此在TAM中调查此细胞因子的表达。事实上，与在bmDC(AAct=1.0士0.06)和腹膜巨噬细胞(ΔAct=39.9士1.6)中观察到的量相比，TAM表达更高水平的编码TGFβRl的mRNA(ΔAct=707.3士47.3)。进一步观察到TAM表达相对较高水平的编码Runx3(ΤΑΜΔAct=9.8士1.1；bmDCΔAct=1.0士0.06；腹膜巨噬细胞ΔAct=1.02士0.05)和IRF_8(TAMΔAct=7.9士0.6；bmDCΔAct=1.0士0.06；腹膜巨噬细胞ΔΔct=0.98士0.05)的mRNA(图3E)，这是涉及LhDC发育和TGFi^信号传导级联的两种转录因子(Woolf等，DevBiol303:703_14，2007;Schiavoni等，Blood103:2221-8,2004)。Runx3已经显示出调控⑶lie的表达，而且Runx3.K0和IRF-8.KO这两种小鼠都是在LhDC生成方面缺陷的(Borkowski等，JExpMed184:2417-22,1996)。总之，这些数据提示TGFβ是对所观察到的TAM生物学重要的一种因子。已知专职抗原呈递细胞迁移至引流淋巴结以启动免疫反应。因而，如实施例1所述使用FACS分析与来自无瘤FVB小鼠比较地评估PyMTtg小鼠的肿瘤引流腋窝和臂淋巴结的免疫细胞组成。在来自含瘤小鼠的淋巴结中鉴定出升高数目的CDllb+细胞(图4Α)以及升高数目的表达F4/80和⑶Ilc的⑶Ilb+细胞(图4Β)。对此数据的一种非限制性解释是TAM可能迁移至引流淋巴结以将肿瘤抗原呈递给其它免疫细胞。实施了比较全基因组微阵列分析来进一步调查TAM和腹膜巨噬细胞与来自FVB对照小鼠的骨髓衍生树突细胞(“bmDC”)之间的差异。简言之，使用低RNA输入荧光线性扩增试剂盒(Agilent)将1微克总RNA转变成双链cDNA。使用T7RNA聚合酶自cDNA合成cRNA，同时掺入花青3或花青5标记的CTP。将经过标记的cRNA在亲和树脂柱(RNeasyMiniKit，Qiagen)上纯化，并通过测量260nm吸光度来定量。通过使用NanoDropND-1000分光光度计(NanoDropTechnologies)测量花青3和花青5标记的CTP的吸光度来测定染料的掺入。通过在断裂缓冲液(InsituHybridizationKit-Plus；Agilent)中于60°C温育30分钟，使750ng花青3标记的cRNA和750ng花青5标记的cRNA断裂。通过添加含有LiCl和十二烷基硫酸锂的杂交缓冲液来终止断裂。将样品与微阵列于60°C杂交17小时。将阵列用SSC缓冲液清洗并用乙腈干燥。使用微阵列扫描仪(Agilent)扫描阵列。自经红血球消减的骨髓细胞生成未成熟bmDC，在补充有150ng/mL鼠IL-4和20ng/mL鼠GM-CSF(R&DBiosystems)的RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich)中以5xl05细胞/mL于37°C和5%CO2培养6天。隔天取出一半培养基并用新鲜的补充有GM-CSF和IL-4的RPMI1640更换。在第6天，通过FACS分选来分离⑶llb+CDlIc+细胞。自获自腹膜PBS/EDTA灌洗的单细胞溶液FACS分选F4/80腹膜巨噬细胞。将来自10-14周龄MMTV.PyMTtg小鼠的肿瘤用胶原酶II、IV和DNA酶(Gibco和Sigma)于37°C处理15分钟。使用抗F4/80PE和抗PEMicroBeads(MiltenyiBiotech)通过磁细胞分选来富集肿瘤相关F4/80^巨噬细胞(ΤΑΜ)。通过流式细胞术验证了所分选细胞的纯度，而且根据磁细胞分选，细胞纯度的范围为大于95%，而根据流式细胞术，细胞纯度的范围为大于98%。在染色之前，将所有细胞用10-20%的适宜血清或纯化的IgG封闭。在Vantage或Aria分选仪(BectonDickinson)上用PI排除来进行FACS分选。通过使用Partek基因组套组软件第6.3版(PartekInc.，St.Louis,MO)在Agilent完整小鼠基因组(WMG)或M1A(巨噬细胞子集的比较)寡聚物微阵列log2比数据(AgilentTechnologiesInc.，SantaClara,CA)上，实施分级聚族(hierarchicalclustering)禾口分分t/(principalcomponentanalysis,PCA)。使用Euclidean距离来测量行或列之间的相异性、使用平均连锁法(averagelinkagemethod)来计算各簇间的距离，而在分级聚簇中使用“2-Pass”聚簇法。在PCA中，分散矩阵是协方差，而本征矢量是标准化的。使用PartekBatchRemover来消除小鼠株系差异对PCA中数据显现的影响。在强度图上，Agilentlog2比的表达值被换算成ζ得分。在那三种细胞类型中表达的基因的热像显示了TAM不同于腹膜巨噬细胞和bmDC(图5A)。还通过三维主成分分析(“PCA”)在统计学上检查数据以评估三种不同基因表达序型之间的相关性。群体的聚簇显示了TAM不同于那两种对照群体，尽管TAM似乎与腹膜巨噬细胞更加相关，胜过与bmDC(图5B)。图5C显示了TAM能与其它巨噬细胞区分开，诸如腹膜巨噬细胞、脾巨噬细胞和KupfTer细胞。还将TAM的形态学与腹膜巨噬细胞和bmDC的比较(图4C)。TAM和bmDC是具有小细胞核和大细胞质(其中散布有许多液泡)的大细胞。相反，腹膜巨噬细胞在大小方面小得多，而且具有大细胞核和缺乏液泡的均质细胞质。如此，TAM看上去显著不同于腹膜巨噬细胞，但是类似bmDC。B=TAM展示致耐受性抗原呈递细胞的特征鉴于上文所述自PyMTtg小鼠分离的TAM与bmDC的形态学相似性及与腹膜巨噬细胞的相异性，实施了这些细胞类型间分子相似性和差异的进一步分析，特别是评估自PyMT肿瘤分离的TAM是否可能充当抗原呈递细胞。如上所述通过FACS分析测量ΤΑΜ、bmDC和腹膜巨噬细胞中MHCII、共刺激分子⑶80和⑶86、及⑶83(成熟DC的一种标志物)的表达。值得注意的是，TAM以高水平表达MHCII，与在半成熟bmDC上观察到的相似，而腹膜巨噬细胞只表达中等水平的MHCIK比较图6A-C中最左边的小图)。TAM表达少许至不表达⑶80或⑶83，及中等量的⑶86。静止的腹膜巨噬细胞表达低水平的⑶80和⑶83，但高水平的⑶86，而bmDC(未成熟与半成熟DC的异质群体)表达低至中等水平的⑶80、⑶83和CD86(图6A-C)。实施例3=TAM趋化因子和细胞因子谱型为了进一步了解TAM如何影响肿瘤生长和进展以及抗肿瘤免疫应答，评估TAM的细胞因子和趋化因子谱型。如实施例2所述对选定的基因集合实施微阵列分析趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL17、CXCLl、CXCL9、CXCL10,CXCL16和KC及细胞因子IL-Iα、IL-Iβ、IL1RA、TNFα、TGFβ和LTβ。腹膜巨噬细胞和TAM展示不同的趋化因子和细胞因子谱型(见表2和图7Α)。与bmDC相比，TAM生成更大量的编码某些趋化因子的mRNA，例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL17、CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL16禾口KC(见表2和图7A)。此类趋化因子表达应当吸引多种淋巴细胞，包括那些通常在肿瘤中找到的，诸如单核细胞、未成熟DC、NK细胞和T细胞。与bmDC相比，在TAM中检测到水平增强的编码IL-Iα、IL-Iβ、IL-1RA、TNFα和LTβ的mRNA(数据未显示)。表2与bmDC相比，TAM中的趋化因子mRNA表达趋化因子表达靶细胞CCL2/MCP-112.4单核细胞，记忆T细胞(CD8)，未成熟DCCCL3/MIP-la37.9单核细胞，NK细胞，记忆T细胞(THl)，未成熟DCCCL4/MIP-lb183.3THlCCL5/RANTES5.0THl，NK细胞，未成熟DCCCL7/MCP-315.2单核细胞CCL8/MCP-25.1单核细胞CCL17/TARC4.0TH2，调节性T细胞CXCL1/MIP-2*5.5单核细胞，NK细胞CXCL9/MIG5.6THlCXCL10/IP-10103.0THl，单核细胞，活化的T细胞(THl，TH2)KC6.2嗜中性粒细胞CXCL16*13.3T细胞*跨膜蛋白；脱落形式起清除受体的作用还实施了与肿瘤细胞、腹膜巨噬细胞和bmDC相比，TAM中基因表达的热图分析。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)依照制造商的指令纯化总RNA。使用总RNAPico测定法在Agilent2100Bioanalyzer上评估RNA质量，并使用低RNA输入荧光线性扩增试剂盒来制备荧光cRNA探针(Agilent)。使用Agilent小鼠MlA微阵列来评估基因表达。用Cy5标记每种细胞类型的6份重复样品，并用Cy3标记通用小鼠参照(Stratagene)。将750ng经过标记的Cy5和Cy3探针断裂30分钟，并将这两种探针都加载到每个芯片上。于60°C实施过夜杂交，随后在6xSSC和0.IxSSC中清洗载玻片，接着是乙腈干燥步骤。用设成100的扫描仪灵敏度扫描微阵列。结果显示了TAM表达水平升高的编码许多炎性细胞因子(IL-1α、IL-Iβ、TNFα和LTβ)以及抗炎细胞因子(IL-1RA、IL-10和TGFβ1)的mRNA，但低水平的编码IL-6、TGFii2或TGFii3的mRNA(图14A)。这些分析还发现TAM展现独特的细胞因子受体表达样式，其中IL-4Ra、IL-IORa、IL-IOR^、IL-13Ra、IL-17Ra、TGFβRl禾PTGFβR2/K平升高(图14B)。TAM还表达水平升高的编码许多炎症趋化因子(CCL2、CCL12、CCL3、CCL4、CCL7、CCLl2、CXCLl、CXCL2、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCL14和CXCL16)的mRNA(图14C)。纯化的TAM分泌高水平的CCL3(1.1士0.3ng/ml比腹膜巨噬细胞中检测不到的量)、CCL5(1.8士0.6ng/ml比腹膜巨噬细胞中检测不到的量)和CXCLlO(5.5士1.3ng/ml比腹膜巨噬细胞中的1.3士0.3ng/ml)，而CCL2的表达与腹膜巨噬细胞的相似(2.7士1.Ong/ml比3.9士0.9ng/ml)(图14D)。这种独特的趋化因子谱型提示TAM活跃地募集淋巴细胞至肿瘤。TAM还表达水平升高的编码CCR6、CXCR4和CX3CR1(已知由TGFβ1诱导的趋化因子受体)的mRNA(Chen、S.等，Immunology114:565_74，2005;Yang，D.，等，JImmunol1631737-41，1999；Chen,S.，JNeuroimmunol133:46_55，2002)，以及水平升高的CCR2、CCR12和CCR5(图14E)。实时RT-PCR证实了TAM中存在升高的CCR6mRNA水平(ΤΑΜΔΔct=467.8士332.0；bmDCΔAct=1.0士0·6；腹膜巨噬细胞ΔΔct=6.4士6·1)(图14F)。为了测试在TAM中观察到的这种独特的趋化因子和细胞因子mRNA谱型是否也存在于表达的蛋白质水平，如上所述自PyMTtg小鼠纯化TAM，并在培养21小时后评估某些细胞因子和趋化因子蛋白质的生成，与腹膜巨噬细胞中的蛋白质表达比较。如实施例1所述实施FACS分析。将TAM和腹膜巨噬细胞在纤连蛋白包被的圆底96孔板中以2xl06/mL的浓度在RPMI1640培养基中于37°C和5%CO2培养21小时。通过Luminex分析来检测上清液中分泌的细胞因子。还实施实时RT-PCR分析。用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离所分选的免疫细胞的RNA，并用DNA酶I(Sigma)消化。将总细胞RNA逆转录并用7700序列检测系统(AppliedBiosystems)依照制造商的指令通过实时TaqManPCR—式三份地分析。给出所表达基因的任意表达单位，即相对于持家基因GAPDH的表达倍数。针对各种基因的引物是依照标准方案在外显子/内含子边界上设计的且自AppliedBiosystems获得的。结果显示于图7B。虽然TAM和腹膜巨噬细胞都分泌中等水平的IL_10(TAM中的0.81士0.13ng/mL比腹膜巨噬细胞中的0.69士0.19ng/mL)，但是TAM生成相对较高水平的TNFa(ΤΑΜ中的0.57士0.12ng/mL比腹膜巨噬细胞中的0.08士0.01)和很低水平的IL-6(TAM中的3.5士0.5ng/mL比腹膜巨噬细胞中的48.5士12.7ng/mL)。另外，TAM分泌低水平的IL-Iα(ΤΑΜ中的0.05士0.01ng/mL比腹膜巨噬细胞中的0.05士0.02ng/mL)，及略微但水平显著升高的IL-Iβ(0.12士0.04ng/mL比0.05士0.02ng/mL)。趋化因子分析在极大程度上证实了通过上述微阵列分析获得的独特的TAM谱型。TAM表达高水平的CCL3(TAM中1.1士0.3ng/mL，腹膜巨噬细胞中检测不到)；CCL5(TAM中1.8士0.6ng/mL，腹膜巨噬细胞中检测不到)；和CXCLlO(ΤΑΜ中的5.5士1.3ng/mL比腹膜巨噬细胞中的1.3士0.3ng/mL)的mRNA(图7B)。TAM中的CCL2mRNA表达与腹膜巨噬细胞的相似(ΤΑΜ中的2.7士1.Ong/mL比腹膜巨噬细胞中的3.7士1.Ong/mL)，而KCmRNA表达是降低的(ΤΑΜ中的6.4士0.7ng/mL比腹膜巨噬细胞中的18.6士6.9ng/mL)(图7B)。PyMTtg衍生ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞、bmDC和肿瘤细胞中TGFi31表达实时PCR分析显示了TAM具有该细胞因子的最高表达(图7C)。TGF^、IL-10和TNFa中等表达与非常低水平IL-6的组合提示TAM可能具有免疫抑制特性。此外，观察到的TAM趋化因子谱型提示TAM可能能够通过分泌极其多种趋化因子来调控在肿瘤中观察到的白细胞浸润物。文献中认可的M1/M2范例(见Mantovani等，TrendsImmunol25(12):677_86，2004；Gordon,NatRevImmunol3(1):23_35，2003)提示经典炎症条件下(IFNγ/LPS)或可变(alternatively)活化条件(IL-4/IL-13)下的巨噬细胞分化成具有独特功能特性的专门化子集(subset)(Ml或M2)。已经提出经典Ml巨噬细胞支持炎症反应，而M2巨噬细胞刺激富含抑制性IL-10和TGFii的微环境的形成。文献中将TAM分类成“可变活化的(alternativelyactivated)"M2giliffllfi(MantovaniTrendsImmunol23:549-55,2002;Sica等，EurJCancer42:717_27，2006)。对与Ml或M2表型有关的分子的mRNA表达谱型的热图分析发现TAM表达与中性腹膜巨噬细胞相比mRNA水平升高的某些M2相关分子(ScaRB、MRl、CD14、CD163、Fizzl、IL-IRII和IL-1RA)，但缺乏其它M2相关分子的表达(Mgl1、Mgl2、ScaRA、MR2、FceRII、Argl、Yml、CCL17、CCL22和CCL24)，而且还表达mRNA水平升高的Ml相关分子(IL-Ιβ、FcRIa、FcRIIb、FcRIIIa、CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10、CXCLll和CXCL16)(图15A-B)。这些观察到的细胞因子和趋化因子谱型证明了TAM(虽然分泌抑制性细胞因子)不同于M2巨噬细胞。TAM显示许多炎症Ml特征，诸如TNFa和IL-Iβ的生成及FcRl、FCRIIb和FcRIIIa的表达。TAM分泌许多对例如NK细胞有趋化性的炎症“Ml”CC和CXC趋化因子，但是没有吸引TH2或T调节性细胞的经典M2趋化因子CCL17、CCL22和CCL24。实施例4=TAM在体外对T细胞的影响为了调查上文所述TAM特性是否反映TAM与T细胞的相互作用，评估了TAM诱导幼稚T细胞增殖和细胞因子分泌的能力，与腹膜巨噬细胞和bmDC的T细胞诱导活性比较。虽然PyMTtg肿瘤模型模拟人转移性乳腺癌形成的许多方面，但是它也需要FVB背景，使之难以实施抗原特异性T细胞研究。事实上，采用了与选定免疫细胞和CFSE标记的CD4+T细胞的体外共培养。自FVB小鼠的脾和外周淋巴结制备幼稚CD4+T细胞。将单细胞悬浮液MACS消减CD25+、CD69+和CD103+细胞(eBioscience和MiltenyiBiotech)。用CD4-MicroBeads(MiltenyiBiotech)富集阴性级分中的CD4+T细胞，并通过FACS分选来分离CD62L+CD45RbhighCD25XD69XD103"幼稚CD4+T细胞(所有抗体均来自eBioscience或Pharmingen)。如下研究由ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞或bmDC诱导的T细胞增殖，即与IxlO5个幼稚T细胞和0.5μg/mL抗⑶3抗体一起培养2xl04个ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞或bmDC。在纤连蛋白包被的圆底96孔板中于37°C5%CO2培养细胞。培养5天后，将细胞上清液冷冻于_80°C，供使用标准规程通过ELISA测定法进行的细胞因子分析用。用Lincoplex试剂盒(Linco)遵循制造商的指令在培养物上清液中检测到GM-CSF、G-CSF、MIP-Iα、MCP-I、RANTES、ΙΡ-10、KC、IL-Iα、IL-Iβ、IL—2、IL—4、IL—5、IL—6、IL—10、IL—13、IL—17、IFNy禾口TNFα。通过FACS检查到T细胞增殖。CSFE稀释度的测量显示TAM以与专职抗原呈递细胞腹膜巨噬细胞和bmDC所诱导的相当的水平诱导T细胞增殖(数据未显示)。与bmDC相反，TAM引发的T细胞分泌高水平的IL-IO(ΤΑΜ引发的细胞中的2.5士0.4ng/mL比bmDC引发的细胞中检测不到)和IFNy(ΤΑΜ引发的细胞中的5.6士1.2ng/mL比bmDC引发的细胞中的0.2士0.Ing/mL),以及很低水平的IL-2(TAM引发的细胞中的0.3士0.Ing/mL比bmDC引发的细胞中的5.4士0.6ng/mL)，且不表达IL_4(ΤΑΜ引发的细胞中检测不到比bmDC引发的细胞中的0.2士0.Ing/mL)(图8A)。与bmDC的非常高的IL-4诱导(2.7士0.2ng/mL)相比，TAM不能在幼稚⑶4+T细胞中诱导IL-4，该无能在11的比例时更加显著，显示由TAM引发引起的IL-4诱导的几乎完全缺失(0.2士0.02ng/mL)(图8A)。用TAM或bmDC刺激的T细胞表达可比水平的IL-5、IL-13和TNFα(数据未显示)。这种来自被TAM活化的⑶4+Τ细胞的细胞因子分泌样式提示TAM诱导IL-IO+TrlT细胞。TAM还诱导高水平的IL_17(TAM引发的T细胞中的1.6士0.6ng/mL比bmDC引发的T细胞中的0.7士0.Ing/mL)(图8A，右边的小图)。为了证实那些T细胞细胞因子是由T细胞分泌的，将TAM和其它免疫细胞活化的CD4+T细胞培养物(如上所述)固定并针对每种主要细胞因子胞内染色。简言之，将与ΤΑΜ、腹膜巨噬细胞或bmDC—起培养5天的T细胞用50ng/mLPMA和750ng/mL伊屋诺霉素再刺激6小时，最后4小时添加5μg/mL布雷菲德菌素A(BrefeldinΑ)，然后用封闭剂处理并针对⑶4表面染色。然后将细胞固定并使用FastlmmuneCD4胞内细胞因子检测试剂盒(BD)依照制造商的指令针对IL-4、IL-10和IL-17的胞内表达染色。如实施例1所述实施FACS分析。如图8B所示，TAM引发的⑶4+T细胞分泌高水平的IL-10和IL-17及水平降低的IL-2，而且这种分泌依赖于TAM的TGFii分泌。通过重组TGFi3RII来中和TGF^导致IL-10(27.4士22.)和IL-17(79.4士9.9%)表达的降低及IL-2分泌的升高(259.9士68.0%)(图8C)。此数据与上述发现一起证实了TAM有可能在那些培养物中诱导IL-IO+Trl和IL-17+CD4+T细胞。显示了TAM有可能诱导至少一种某些调节性T细胞子集后，实施实验来确定TAM是否能够诱导FoxP3+调节性T细胞。为了评估FoxP3诱导，在纤连蛋白包被的圆底96孔板中于37°C和5%CO2与IxlO5个幼稚CDSE+T细胞(CD25XD69TD103XD45Rb高CD62L高和FoxP3几乎阴性(0.3%FoxP3+))和0.002yg/mL抗CD3抗体一起培养2xl04个TAM或bmDC。5天后，使用对小鼠和大鼠FoxP3特异性的偶联抗体(eBioscience)遵循制造商的指令分析⑶4+T细胞的胞内FoxP3表达。结果显示于图9。与bmDC活化的⑶4+T细胞相反，TAM活化有利于调节性T细胞的诱导，正如TAM处理的培养物中3.3士0.9%FoxP3+T细胞的存在所证明的，而bmDC处理的培养物只显示0.8士0.5%的FoxP3+T细胞(见图9A)。用TAM活化的T细胞中的FoxP3诱导也依赖于TAM的TGFβ生成，因为用重组TGFβRII中和TGFβ将TAM处理的T细胞中的FoxP3表达降低几乎80%，至FoxP3+T细胞的0.7士0.2%(图9B)。为了证实TAM诱导的FoxP3+T细胞具有调控能力，将细胞针对已知在天然存在的FoxP3+调节性T细胞上表达的蛋白质染色。已知与其它⑶4+T细胞相比，GITR在FoxP3+调节性T细胞以更高水平表达(McHugh等，Immunity16=311-23,2002)TAM诱导的T细胞还具有高水平的GITR表达(图9C)，提示那些细胞是具有调控能力的FoxP3+T细胞。而且，有些TAM诱导的FoxP3+T细胞(大约6.3%，见图9D)表达低水平的⑶103(—种已知在体内在外周诱导的调节性T细胞上表达的标志物)，进一步提示TAM诱导的FoxP3+T细胞是具有调控特性的调节性T细胞。为了阐明TAM不仅在分离后刺激幼稚T细胞集合中剩余的少数FoxP3+T细胞(0.3%，见图10Α)扩增，而且还诱导FoxP3+T细胞，在相同条件下刺激脾细胞，其含有⑶4+Τ细胞集合中8.7士0.2%FoxP3+细胞。如图IOC所示，FoxP3+T细胞集合为2.2士1.5%，提示TAM能够直接诱导FoxP3+调节性CD4+T细胞。使用T调节性细胞代替脾细胞来重复实验，而且结果是相同的(比较图IOD和10C)。还评估了不同抗原呈递细胞对幼稚⑶4+T细胞的刺激能力。如图IOB所示，bmDC、TAM和腹膜巨噬细胞中每一项都能够以相似程度刺激CFSE标记的幼稚⑶4+T细胞。如此，TAM对FoxP3+T细胞的诱导不是由于TAM相对于其它抗原呈递细胞在T细胞诱导方面的一般性升高。实施例5=TAM在体内对T细胞的影响组合来自前述实施例的数据提示TAM在体外诱导IL-IO+和FoxP3+调节性T细胞以及IL-17+THiw7⑶4+T细胞。为了评估诱导此类细胞群体的体内关联性，测定了那些细胞子集在体内的存在和定位。使用标准技术自PyMTtg小鼠制备腋窝和臂淋巴结的单细胞悬浮液。如先前所述，将细胞悬浮液再刺激6小时，然后用对⑶4、IL-4、IL-10和IL-17特异性的抗体染色。与体外数据很好的一致，在体内检测到IL-4-和IL-10+CD4+Trl细胞以及IL-17+CD4+T细胞(图11A)。在来自年龄匹配的对照FVB小鼠衍生的腋窝和臂淋巴结的CD4+T细胞中没有检测到这些细胞因子的显著表达(图11B)。有趣的是，所有生成细胞因子的⑶4+T细胞只表达一种所调查的细胞因子(即或是IL-10或是IL-17，而非两者)。还调查了肿瘤模型小鼠对FVB小鼠中调节性FoxP3+⑶4+T细胞的体内发生频率。与FVB对照相比，在PyMTtg小鼠的肿瘤引流腋窝和臂淋巴结中观察到FoxP3+CD4+T细胞的显著增加(8.6士0.9%比6.3士1.2%，p=0.033)(图11C)。与FVB对照相比，在PyMTtg小鼠的脾中观察到FoxP3+CD4+T细胞的显著增加(12.3士5.4%比7.6士0.5%，ρ=0.027)(图lie)。在PyMTtg小鼠的肿瘤中观察到很高频率的FoxP3+⑶4+Treg细胞(19.O士7.8%)(图11C)。实施例6=TAM展示与脂肪组织巨噬细胞的类似性最近报告了F4/80+脂肪组织巨噬细胞(ATM)能在有些情况中获得⑶lie表达(Lumeng等，JClinInvest117:175_84，2007)，非常像上文证明TAM如此的研究。由于某些疾病(诸如糖尿病)与轻度但慢性炎症有关(Neels和01efsky，JClinInvest11633-5，2006)，进行TAM与ATM细胞群体的比较以更好地了解ATM是否促成此慢性炎症，非常像上文提示TAM促成肿瘤生物学的结果。通过自6周龄开始用由60kcal%脂肪组成的高脂肪食谱(HFD)喂养20周，使得饮食诱发的肥胖C57BI/6雄性小鼠(JacksonLaboratory)对胰岛素耐受。还获得了Db/db小鼠以及年轻的或年龄匹配的对照小鼠(喂养由IOkcal%脂肪组成的标准食谱)。使用来自腋窝和臂肿瘤引流和腹股沟脂肪引流淋巴结的RBC溶解的单细胞悬浮液进行FACS分析。简言之，自来自FVB或C57BI/6对照小鼠脾、外周和肠系膜淋巴结的RBC溶解的单细胞悬浮液制备幼稚⑶4+T细胞。将细胞首先MACS消减⑶25+、⑶69+和⑶103+细胞，然后用CDOicrobeads(MiltenyiBiotech)富集。最后，通过FACS分选来分离CD62L+CD45Rbhigh⑶25XD69TD103-幼稚⑶4+T细胞。如前述实施例所述实施FACS和RT-PCR实验。对通过离心自组织样品收集的新鲜分离的ATM、TAM和腹膜巨噬细胞实施显微术研究，并使用标准技术用苏木精和曙红染色剂染色。结果显示于图12。喂养高脂肪食谱5个月的雄性C57BI/6小鼠在它们的附睾脂肪组织中展示高比例的髓样细胞，正如年龄匹配的对照小鼠(HFD:35.9±6.7%(图12A)；年龄匹配的对照小鼠32.9士7.(数据未显示))。然而，2月龄雄性C57BI/6小鼠在它们的附睾脂肪组织中展示显著更低比例的⑶Ilb+细胞(15.5士11.0%，η=4(数据未显示))。验证较早的发现(Lumeng等，JClinInvest117:175_84，2007)，发现脂肪组织中32.9士6.7%的F4/80+ATM还共表达⑶1Ic(图12Β)，而自喂养正常食谱的年龄匹配的或2月龄的小鼠的附睾脂肪组织分离的巨噬细胞显示很少的CDllc表达(数据未显示)。另外，发现ATM还表达高水平的MHCII和低水平的⑶86，与上文对TAM的发现相似(图12B)。也在ATM群体中检查在上述研究中鉴定的别的TAM表面标志物。发现ATM和TAM具有相似的⑶14表达水平，但是ATM缺少ICOSL和TIM3表达，二者都在TAM上显示中等至强的表达(比较图12C和12D)。值得注意的是，自喂养高脂肪食谱20周的雄性C57BI/6小鼠纯化的ATM的细胞因子和趋化因子谱型与TAM的相似。这些特定ATM表达高水平的IL-IO(0.84士0.01ng/ml比腹膜巨噬细胞中观察到的0.47士0.18ng/ml)、中等水平的IL_6(10.9士7.9ng/ml比腹膜巨噬细胞中观察到的38.1士30.6ng/ml)和低水平的TNFa(0.13士0.04ng/ml比腹膜巨噬细胞中的0.13士0.06ng/ml)(图12E)。还发现ATM分泌高水平的CCL2(5.9士1.8ng/ml比腹膜巨噬细胞中观察到的4.3士2.7ng/ml)和CXCL10(23.5士8.lng/ml比腹膜巨噬细胞中观察到的28.7士16.5ng/ml)、但低水平的CCL3(0.97士0.57ng/ml比腹膜巨噬细胞中检测不到的量)和CCL5(0.2士0.2ng/ml比腹膜巨噬细胞中检测不到的量)(见图12E)。此外，ATM表达相似水平的TGFβ！和略微更低水平的TGFβRl(比TAM低3.6倍，但比腹膜巨噬细胞高4.9倍(图12F)。然而，与TAM形成鲜明对比，ATM不表达Runx3或IRF-8(数据未显示)，这与ATM中Iangerin表达的缺失相关。显微术研究进一步提示ATM和TAM的形态学彼此相似，但是不同于腹膜巨噬细胞形态学(图12G)。TAM和ATM的大小都是大的，具有小的细胞核和大的具液泡的细胞质(见图12G)。结果指明了F4/80+CDllc+巨噬细胞不是限于特殊微环境的独特免疫细胞子集，而是表征了炎症组织中存在的巨噬细胞新子群。另外，此巨噬细胞子群自身由至少两种具有不同细胞因子表达和细胞表面标志物表达的亚型组成。实施例7=ATM对CD4+T细胞的影响上述实施例证明了TAM能够诱导FoxP3+调节性T细胞(见图10A)。进行相似的实验来测定肥胖高脂肪食谱(HFD)喂养的小鼠中FOXP3+CD4+T细胞的呈现是否升高及ATM是否类似地能够诱导FoxP3+调节性T细胞。用相应的组织和抗⑶3活化幼稚FoxP3TD4+T细胞。将IxlO4个来自肥胖小鼠的脂肪组织巨噬细胞(ATM)与0.002μg/mL抗CD3(BDBioscience)和5xl04个幼稚CD4+T细胞一起分配入圆底96孔板并以200μL终体积(完全RPMI1640，于37°C，5%CO2)培养。5天后，收获⑶4+T细胞并分析FoxP3表达。为了确定ATM是否诱导FoxP3+调节性T细胞，将2xl04个CDllc+ATM、腹膜巨噬细胞或瘦脂肪组织巨噬细胞(leanfattissuemacrophage,LTM)与IxlO5个幼稚FoxP3+CD4+T细胞和0.002μg/ml抗⑶3—起培养5天。随后将细胞固定并对FoxP3染色，或者收获培养物上清液并测试IL-2、IL-4、IL-10和IL-17的存在。如实施例3所述实施热图分析。为了证实CCL2、CCL3、CCL5和CXCLlO的差异表达，在没有进一步刺激的情况中以2xl06/ml浓度培养来自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬细胞或PyMTtg衍生ΤΑΜ。21小时后分析分泌入上清液中的趋化因子。如实施例3所述实施实时RT-PCR。如实施例4所述实施白介素测量。与肿瘤中的免疫浸润物相似，与年龄匹配的对照相比，来自肥胖HFD小鼠的附睾脂肪组织含有显著更高百分比的FoxP3+⑶4+Τ细胞(18.5士6.2%比对照中的7.9士3.7%；见图131)。此外，与年龄匹配的对照相比，来自肥胖HFD小鼠的脂肪引流淋巴结也含有显著更高水平的FoxP3+CD4+T细胞(17.2士3.3%比对照中的13.4士0.6%；见图13J)。如图13A所示，⑶Ilc+ATM能够诱导FoxP3+调节性T细胞，但腹膜巨噬细胞或瘦脂肪组织巨噬细胞不行(8.3士1.7%的活化的幼稚T细胞；比较左边的小图与中央的和右边的小图)。此体外数据得到了体内数据的进一步支持。如在荷瘤小鼠中观察到的，在肥胖Db/Db小鼠的脾(23.6士1.6%比对照中的14.4士1.6%)以及附睾脂肪组织(24.9士6.2%比对照中的8.5士1.3%)(已知ATM普遍升高的组织)⑶4+T细胞中检测到水平升高的FoxP3+T调节性细胞(图13C和13D)。由于已知ATM表达TGFi3i(—种先前已经显示对于调节性T细胞分化重要的细胞因子)，因此评估了此细胞因子对FoxP3+细胞的ATM诱导的影响。通过将TGFβRII-Fc掺入测定法中来阻断TGFβ几乎完全抑制⑶llc+ΑΤΜ对FoxP3+T细胞的诱导(2.2士0.的活化的幼稚T细胞)(图13B)。还评估了⑶Ilc+ATM诱导其它类型T细胞的能力。如图13E所示，⑶llc+ΑΤΜ活化幼稚T细胞，不仅包括FoxP3+调节性T细胞群体，而且它们还展示Trl和TH17细胞因子谱型。具体而言，⑶Ilc+ATM活化幼稚T细胞，分泌高水平的IL-10(0.5士0.lng/ml比用腹膜巨噬细胞活化的T细胞中的0.6士0.15ng/ml)及很低水平的IL-2(0.02士0.0lng/ml比用腹膜巨噬细胞活化的T细胞中的0.1士0.04ng/ml)和IL_4(0.1士0.03ng/ml比用腹膜巨噬细胞活化的T细胞中的0.1士0.03ng/ml)。另外，ATM诱导T细胞中表达的高水平的IL-17(1.6士0.6ng/ml比用腹膜巨噬细胞活化的T细胞中的3.4士0.2ng/ml)。对ATM诱导的T细胞培养物样品的FACS分析证实了ATM刺激自幼稚T细胞培养物诱导Trl和TH17T细胞(图13F)。另外，用⑶Ilc+ATM刺激的幼稚T细胞分泌显著量的TNFα、IL-5和IL-13(图16Β)。与上文在PyMTtg小鼠上进行的实验的结果类似，与对照小鼠相比，在喂养高脂肪食谱的肥胖小鼠的脂肪引流淋巴结中检测到升高水平的生成IL-10(1.0士0.2%比对照中的0.3士0.1%)和IL-17(0.6士0.2%比对照中的0.3士0.1%)的细胞(图13G和13H)。虽然CDllc+ATM和CDllc+TAM在炎症条件下的表现似乎相似，但是PCA分析揭示了ATM和TAM是组织巨噬细胞中不同的细胞群体(图17)。上述实施例中显示了TAM不适合规范的Ml或M2巨噬细胞范畴，尽管文献中有相反的报告(见实施例3)。文献中提示ATM展示Ml表型(Lumeng等，JClinInvest117175-84,2007)。事实上，本文所示结果提示ATM分泌IL-10、TGFβ和IL-1RA，而且表达Mgll、Mgl2、⑶14和⑶163(M2表型的典型特征)。这些结果还清楚地显示ATM诱导抑制性调节性T细胞以及炎症TH17细胞的生成，如此，ATM跨越Ml和M2两类巨噬细胞的特性，与TAM非常相似。实施例8CD11c+ATM与CDlIcTATM之间的功能差异如实施例3所示，TAM展示特征性细胞因子表达谱型。检查了⑶llc_和⑶Ilc+ATM的细胞因子表达谱型。如上所述，自饮食诱发的肥胖C57BI/6雄性小鼠纯化⑶Ilc+和CDllc_ATM，并在培养21小时后评估每种细胞群体中某些细胞因子和趋化因子蛋白质的生成。如实施例1所述实施FACS分析。将ATM在纤连蛋白包被的圆底96孔板中以2xl06/mL浓度在RPMI1640培养基中于37°C和5%CO2培养21小时。通过Luminex分析来检测上清液中分泌的细胞因子。结果显示于图18。与⑶Ilc+ATM相比，⑶llc_ATM显示更高的CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、IL-6、IL-10、TNFα和G-CSF表达水平。然而，CD11c+ATM显示比CD11(ΓΑΤΜ更高的VEGF表达水平。M-CSF、IL-Ib、MIG/CXCL9、MIP-2/CXCL2、RANTES和KC/CXCL1水平在CDIIcTATM与CDllc+ATM之间是相似的，而且CDlIcTATM和CDllc+ATM都不表达IL-Ia或eotaxin(数据未显示)。此数据进一步指明了基于它们不同的细胞因子表达谱型，⑶1ΓΑΤΜ和CDll+ATM是不同的细胞群体，有可能具有不同的生理学功能。如实施例4所述，TAM自幼稚T细胞群体诱导FoxP3+T细胞。为了调查CDllc—ATM和CDllc+ATM的T细胞引发潜力，在圆底96孔板中以0.5μg/mL抗CD3和5x104个幼稚CD4+T细胞培养IxlO4个⑶llc_或CDllc+ATM，终体积200μL。为了促进ATM和幼稚T细胞的存活，可以事先用重组鼠纤连蛋白包被96孔板，或者向培养物添加重组人IL-2。5天后，收获上清液并在分析前保存于-80°C。稍后通过细胞因子ELISA(Lincoplexkits(Linco)，依照制造商的指令)在融化的上清液中检测到上清液中的细胞因子和趋化因子。为了评估CD4+T细胞中的细胞因子生成，将引流淋巴结或培养细胞的单细胞悬浮液用PMA/伊屋诺霉素再刺激6小时，最后4小时添加布雷菲德菌素A。在对细胞染色之前，用适宜的血清或纯化的IgG封闭细胞。获取包括PI排除(表面染色)且是在FACSCalibur或LSRII(BectonDickinson)上实施的，并用JoFlo软件(TreeStar)分析。结果描绘于图19A和19B。⑶llc—ATM诱导T细胞，相对于未刺激的T细胞，IL-4、TNFa、CCL5、IFNy和IL-17表达略微升高，而IL-13、IL-10和IL-5表达升高大得多(IL-6表达升高超过25倍)。CDllc+ATM诱导T细胞，相对于未刺激的T细胞，IL-4、IL-13、IL10、TNFα、CCL5和IFNγ表达有轻微至中等升高，而IL-17和IL-6表达升高大得多(IL-6表达升高超过30倍)。⑶llc_ATM诱导的T细胞与⑶Ilc+ATM诱导的T细胞之间细胞因子/趋化因子表达水平样式的比较证明了，与⑶Ilc+ATM诱导的细胞相比，⑶llc_ATM诱导的细胞展示实质性更高的IL-10和IL-13表达，相似的IL-4、TNFα、CCL5和IFNγ表达，及实质性降低的IL-17和IL-6表达(见图19Α禾口19Β)。此结果进一步证明了⑶llc_ATM和CDllc+ATM是两种不同的细胞群体，具有不同的生理学功能。实施例9=ATM对Thl比Th2细胞的诱导树突细胞活化⑶4+T细胞以分化成Thl或Th2细胞的一种方法是通过它们表面上C型凝集素分子与幼稚CD4+T细胞的相互作用。某些C型凝集素可偏向于诱导Th2细胞，例如SIGN-Rl和DC-SIGN(Wieland等，MicrobesInfect.(2007)9134-41；Soilleux等，J.Pathol.(2006)209182-9；Bergman等，J.Exp.Med.(2004)200979~90；Ryan等，J.Immunol.(2002)1695638-48；及Hart禾口vanKooyk,TrendsImmunol.(2004)7353-359)。因为ATM具有巨噬细胞和树突细胞二者的特征，所以调查了ATM中这些C型凝集素中某些的表达。简言之，如实施例2所述使用微阵列分析实施⑶Ilc+ATM和⑶llc_ATM细胞群体中DC-SIGN(CD209a)、SIGN-Rl(CD209b)和SIGN-R2(CD209c)mRNA表达的微阵列分析。依照实施例1所列方案实施ATM细胞混合群体中SIGN-Rl蛋白质表达的FACS分析。⑶11(ΓΑΤΜ和⑶11C+ATM中各种C型凝集素的mRNA表达的微阵列分析揭示了CDllc_ATM表达显著比CDlIc+ATM更大量的、DC-SIGN，SIGN-Rl和SIGN-R2每一种的mRNA(见图20A)。所表达蛋白质的FACS研究显示了取自用正常食谱喂养的正常8周龄BI6小鼠(即非肥胖小鼠)淋巴结的免疫细胞含有显著数目的表达SIGN-Rl的⑶11_细胞(图20B，左小图)。然而，来自用高脂肪食谱喂养24周的BI6小鼠(即肥胖小鼠)的样品含有显著更大数目的⑶Ilc+细胞，其中少于10%表达SIGN-Rl(图20B，右小图)。总之，此数据提示用HFD喂养的小鼠中炎性ATM(CDlIc+DC-SIGN-)细胞群体增加，而抗炎ATM(CDllc_DC_SIGN+)细胞群体减少。实施例10不同ATM群体对T细胞的引发如下调查了⑶llc_和⑶Ilc+ATM的T细胞引发潜力，即在圆底96孔板中以mL抗⑶3和5x104个幼稚⑶4+T细胞培养IxlO4个⑶IlcT和⑶llc+ATM，终体积200μL。为了促进ATM和幼稚T细胞的存活，可以用重组鼠纤连蛋白包被96孔板，或者可以向培养物添加重组人IL-2。通过添加10μg/mL抗SIGN-Rl或10μg/mL重组人ICAM-3来阻断SIGN-Rl信号传导。生长5天后，收获培养物上清液并在分析前保存于-80°C。在融化的上清液中通过前述实施例所述细胞因子ELISA(即使用Lincoplex试剂盒依照制造商的指令)能检测到上清液中的细胞因子和趋化因子。总之这些实验显示了TAM展示专职致耐受性APC的表型且能诱导IL_10+Trl、FoxP3+T调节性细胞和TH17T细胞。TAM与ATM共享某些表型和功能类似，提示组织巨噬细胞在各式各样的炎症条件下获得一些与TAM相似的特征(且仍保留一些区别特征)。ATM与TAM之间的共性可能有助于解释在小鼠和人中观察到的肥胖与致癌作用之间相关性(Yakar等，Endocrinologyl47(12):5826_34，2006；Calle等，NEnglJMed348(17)1625-38,2003)，及2型糖尿病与升高10-20%的乳腺癌风险的相关性(Wolf等，LancetOncol.6(2)103-11，2005)。在这两种疾病中，轻度但慢性的炎症伴随有患病组织中巨噬细胞的显著积累(Balkwill和Mantovani，Lancet,357(9255):539_45，2001；Neels禾口Olefsky,JClinInvest116:33_5，2006)，而且研究已经将数目增加的组织巨噬细胞和慢性炎症与肿瘤进展(Mantovani等，ImmunolToday13265-70,1992；Pollard,NatRevCancer471-8,2004)或胰岛素耐受性(Kamei等，JBiolChem281:26602_14，2006；Weisberg等，JClinInvest116(1):115_24，2006；；Arkan等，NatMed11:191_8，2005)联系起来。类似的，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(另一种慢性炎症模型)中已经记载了CDllc+F4/80+髓样DC的存在(Ponomarev等，JNeurosciRes81:374_89，2005；Fischer和Reichmann,JImmunol166:2717_26，2001；Miller等，AnnNYAcadSci1103179-91,2007)。虽然作者陈述了所指明的免疫细胞是树突细胞，鉴于来自上述实施例的结果，它们可能是活化的巨噬细胞。另外，发现肺泡巨噬细胞(在患有轻度但持久炎症的肺组织中找到的一个定居组织巨噬细胞子集)也表达⑶lie(Padilla等，JImmunol174(12)8097-105，2005;Fulton等，InfectImmun72(4):2101_10，2004)。虽然尚未证明那些肺泡巨噬细胞上的F4/80表达，但是肺泡微环境富含促炎和抗炎细胞因子，鉴于前述实验的结果，它们可能诱导此专门的组织定居巨噬细胞子集的分化。部分参考文献列表Arkan,M.C.,Hevener,A.L.,Greten,F.R.,Maeda,S.,Li,Z.W.,Long,J.Μ.,Wynshaw-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种抗体且所述选择性消除步骤是抗体介导的清除。67.权利要求63的方法，其中调控TAM生存力或活性包括选择性杀死ΤΑΜ。68.权利要求67的方法，其中选择性杀死TAM包括(a)施用TAM结合剂，并(b)选择性杀死那些特异性结合所述TAM结合剂的细胞。69.权利要求68的方法，其中所述TAM结合剂包括至少一种抗体且所述杀死步骤是补体介导的细胞毒性。70.权利要求68的方法，其中所述TAM结合剂包括至少一种抗体或抗原结合片段且所述选择性杀死步骤是由偶联至所述抗体或抗原结合片段的细胞毒性分子介导的。71.权利要求63的方法，其中调控TAM生存力或活性包括抑制TAM活性。72.权利要求71的方法，其中抑制TAM活性包括抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性。73.权利要求72的方法，其中所述TAM分泌细胞因子是TGFβ。74.权利要求72的方法，其中抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。75.权利要求74的方法，其中所述TAM分泌细胞因子/趋化因子结合剂选自对所述细胞因子或趋化因子特异性的抗体或抗原结合片段、对所述细胞因子或趋化因子特异性的受体或抑制所述细胞因子/趋化因子活性的小分子。76.权利要求72的方法，其中抑制一种或多种TAM分泌细胞因子或TAM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。77.权利要求63-76任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。78.权利要求63-77任一项的方法，进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。79.一种用于选择性诱导FoxP3+⑶4+Τ调节性细胞、IL-IO+⑶4+Trl细胞和炎症TH17细胞中至少一项生长和/或增殖的方法，包括在适于正常细胞生长的条件下给幼稚T细胞施用TAM或使幼稚T细胞暴露于ΤΑΜ。80.权利要求79的方法，进一步包括施用一种或多种选自下组的化合物ΤΑΜ激动剂和TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。81.权利要求79的方法，进一步包括分离所述经过诱导的FOXP3+CD4+T调节性细胞、IL-10+CD4+Trl细胞和/或炎症TH17细胞。82.—种治疗受试者中的炎性病症的方法，包括调控IRTM生存力或活性。83.权利要求82的方法，其中调控IRTM生存力或活性包括刺激IRTM活性。84.权利要求83的方法，其中刺激IRTM活性包括施用一种或多种选自下组的化合物IRTM激动剂和IRTM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。85.权利要求83的方法，其中刺激IRTM活性导致对FoxP3+⑶4+T调节性细胞、IL-10+CD4+T调节性细胞和炎症TH17细胞中至少一项的诱导。86.权利要求82-85任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。87.权利要求83-85任一项的方法，进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。88.权利要求82的方法，其中调控IRTM生存力或活性包括选择性消除IRTM。89.权利要求88的方法，其中所述选择性消除IRTM包括(a)施用IRTM结合剂，并(b)选择性消除那些特异性结合所述IRTM结合剂的细胞。90.权利要求89的方法，其中所述IRTM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性消除步骤是抗体介导的清除。91.权利要求82的方法，其中调控IRTM生存力或活性包括选择性杀死IRTM。92.权利要求91的方法，其中选择性杀死IRTM包括(a)施用IRTM结合剂，并(b)选择性杀死那些特异性结合所述IRTM结合剂的细胞。93.权利要求92的方法，其中所述IRTM结合剂包括至少一种抗体且所述选择性杀死步骤是补体介导的细胞毒性。94.权利要求92的方法，其中所述IRTM结合剂包括至少一种抗体或抗原结合片段且所述选择性杀死步骤是由偶联至所述抗体或抗原结合片段的细胞毒性分子介导的。95.权利要求82的方法，其中调控IRTM生存力或活性包括抑制IRTM活性。96.权利要求95的方法，其中抑制IRTM活性包括抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性。97.权利要求96的方法，其中所述IRTM分泌细胞因子是TGFβ。98.权利要求96的方法，其中抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌细胞因子/趋化因子结合剂。99.权利要求98的方法，其中所述IRTM分泌细胞因子/趋化因子结合剂选自对所述细胞因子或趋化因子特异性的抗体或抗原结合片段、对所述细胞因子或趋化因子特异性的受体或抑制所述细胞因子/趋化因子活性的小分子。100.权利要求96的方法，其中抑制一种或多种IRTM分泌细胞因子或IRTM分泌趋化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌细胞因子/趋化因子的拮抗剂。101.权利要求82的方法，其中所述IRTM选自TAM和ATM。102.权利要求82-101任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。103.权利要求82-101任一项的方法，进一步包括共施用或序贯施用一种或多种选自下组的别的治疗剂细胞因子、趋化因子、细胞毒剂、抗炎剂和免疫抑制剂。104.一种用于选择性诱导FoxP3+CD4+T调节性细胞、IL-10+CD4+Trl细胞和/或炎症TH17细胞生长和/或增殖的方法，包括在适于正常细胞生长的条件下使幼稚T细胞暴露于TAM和/或ATM。105.权利要求104的方法，进一步包括施用一种或多种选自下组的化合物TAM激动剂、ATM激动剂、TAM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂和ATM分泌细胞因子/趋化因子的激动剂。106.权利要求104的方法，进一步包括分离所述经过诱导的FOXP3+CD4+T调节性细胞、IL-10+CD4+Trl细胞或TH17细胞。全文摘要提供了以靶向肿瘤相关巨噬细胞活性的疗法治疗癌症的方法。还提供了以使用肿瘤相关巨噬细胞和脂肪组织巨噬细胞的疗法治疗癌症、炎性和自身免疫性病症的方法。文档编号G01N33/574GK101801462SQ200880105878公开日2010年8月11日申请日期2008年7月11日优先权日2007年7月13日发明者乔基姆·莱曼,保罗·J·戈多斯基,加尼什·A·科卢马姆申请人:健泰科生物技术公司