专利名称：用作抗原载体的抗炎性脂肪醇和脂肪酸酯的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及治疗T细胞介导性疾病的治疗性制剂，具体地说，本发明涉及抗炎免疫调节剂作为抗原载体的用途，其中所述抗炎免疫调节剂选自脂肪醇、其与C1-C6链烷酸的酯或脂肪酸与链烷醇或多元醇的酯，而所述抗原由与所述T细胞介导性疾病相关的炎性T细胞识别。
简写AA佐剂关节炎；CFA完全弗氏佐剂；EAE实验性自身免疫性脑脊髓炎；IFA不完全弗氏佐剂；MBP髓鞘碱性蛋白；MOG髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白；OA油醇；PLP蛋白脂质蛋白；SC皮下；TCRT细胞受体。
本发明背景淋巴细胞是免疫系统的重要细胞，负责获得性免疫以及多样性、特异性、记忆和自我/非我识别的免疫特性。成熟B细胞与其它淋巴细胞的区别在于成熟B细胞合成和展示用作抗体受体的膜结合免疫球蛋白(抗体)分子。抗原和成熟原初B细胞上的膜结合抗体的相互作用导致相应特异性的B细胞克隆激活并分化，由此生产没有膜结合抗体但分泌具有相同抗原结合特异性的抗体分子的B细胞克隆。
和B淋巴细胞一样，T淋巴细胞也具有抗原膜受体。但是，与B细胞上的膜结合抗体不同，T细胞受体(TCR)不识别游离抗原。相反，TCR仅识别与主要组织相容性复合体(MHC)中的基因编码的自体分子结合的抗原。为使大部分T细胞能够识别，抗原必须和MHC分子一起展示在抗原提呈细胞(APC)或病毒感染细胞、癌细胞和移植物的表面。
和B细胞一样，T细胞表达不同膜分子。所有的T细胞亚群都表达TCR(一种包括CD3在内的多肽复合物)，大多数T细胞都可以根据存在两种膜分子(CD4和CD8)中的哪一种来区分。表达膜糖蛋白分子CD4的T细胞局限于识别结合MHC II类分子的抗原，而表达CD8(一种二聚体膜糖蛋白)的T细胞局限于识别结合MHC I类分子的抗原。
一般来说，表达CD4和表达CD8还定义了T淋巴细胞的两个主要亚群。CD4+T细胞一般起T辅助(TH)细胞的作用，是II类限制性的；CD8+T细胞一般起T细胞毒性(TC)细胞的作用，是I类限制性的。
TH细胞由抗原提呈细胞上的抗原-MHC II类复合体识别激活。激活后，TH细胞开始分裂，并产生效应细胞的克隆，每个克隆都是所述抗原-MHC II类复合体特异性的。这些TH细胞分泌各种各样的细胞因子，它们在B细胞、T细胞和其它参与免疫应答的细胞的活化中起决定性作用。
TH细胞产生的细胞因子模式的变化可以改变其它白细胞发生的免疫应答。因此，TH细胞依其活化时分泌的特征性细胞因子分为二类(Mosmann and Coffman，1989)。TH1应答产生支持炎症并主要活化某些T细胞和巨噬细胞的细胞因子模式，而TH2应答主要激活B细胞和依赖于抗体的免疫应答。因此，TH1细胞分泌可诱导T细胞增殖的IL-2和介导组织炎症的细胞因子(例如IFN-γ)。TH2细胞则不同，它分泌IL-4和IL-10，IL-4激活B细胞分泌某些类型的IgG同种型抗体，并且抑制TH1炎性细胞因子的产生(Banchereau等，1994)，而IL-10抑制巨噬细胞产生炎性细胞因子，因此间接减少TH1细胞产生的细胞因子，并通过下调MHC II类分子表达而影响抗原提呈细胞(Moore等，1993)。
自身免疫源于免疫系统对自体组分的不适宜反应，导致T细胞或B细胞的自反应性克隆活化，产生针对内源抗原的体液或细胞介导的应答，随之损伤细胞、组织和器官。有时损伤由抗体引起，如自身免疫病Addison病、自身免疫性贫血(例如自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血)、桥本氏甲状腺炎和硬皮病。
很多自身免疫病，例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM或I型糖尿病)、多发性硬化、类风湿性关节炎和自身免疫性甲状腺炎，其特征都是由内源抗原激活的T细胞介导的组织损伤。这些针对自体抗原的免疫应答是通过对自身反应性T淋巴细胞的持续激活而得以维持的。
自身免疫病可分为器官特异性自身免疫病和全身性自身免疫病，在器官特异性自身免疫病中，免疫应答是针对单一器官或腺体独有的靶抗原，使得表症很大程度上局限在该器官，而在全身性自身免疫病中，应答是针对广泛范围的靶抗原，涉及许多器官和组织。器官特异性自身免疫病的实例包括胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、甲状腺炎和重症肌无力，而全身性自身免疫病的实例包括系统性红斑狼疮和硬皮病。
正是TH1细胞导致器官特异性自身免疫病发病。例如，有强有力的证据显示，免疫抗原(例如髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP))特异性的CD4+TH1细胞引起小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。该病可通过MBP或PLP接种动物的T细胞或所述动物的克隆T细胞系由一只动物传给另一只动物。TH1型应答似乎还涉及其它T细胞介导性疾病，例如接触性皮炎(Romagnani，1994)。
大多数器官特异性自身免疫病例是因为自身反应性CD4+T细胞而发生。分析这些T细胞揭示，TH1/TH2平衡可能会影响是否发生自身免疫。TH1细胞涉及自身免疫的发生，而在某些情况下，TH2细胞不仅仅防止自身免疫的诱发，而且防止既有疾病的发展，并在异体移植耐受的诱生和维持中起保护作用。
已经开发了几种治疗自身免疫病的治疗方法。各种自身抗原的鉴定和测序促成了调节自身免疫T细胞活性的新方法的产生。涉及自身免疫病发病的完整抗原或由其序列衍生的肽已提出用于治疗自身免疫病。
适于免疫特异性治疗自身免疫病的合成肽由涉及自身免疫病发病的T细胞识别。这些肽的序列可由涉及所述疾病的抗原序列中的病原性序列组成，或者可是其类似物，在该序列中，一个或多个天然氨基酸残基由不同的氨基酸残基取代，特别是所谓的“变异肽”，其在病原性天然互作区(即接触TCR的部位)的表位中含一个氨基酸取代，但在抗原限制位(即接触MHC的部位)中没有变异。
每一种自身免疫病有其理想的肽用于治疗，这些肽可直接得自与所述疾病相关的抗原序列，或者是其变异肽或其它类似物。因此，如多发性硬化(MS)这样的疾病涉及与髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)和蛋白脂质蛋白(PLP)等自身抗原反应的T细胞，它就需要MBP、MOG或PLP肽或其类似物来治疗；重症肌无力可用乙酰胆碱受体肽治疗；甲状腺炎用甲状腺球蛋白肽治疗；I型糖尿病用谷氨酸脱羧酶(GAD)肽或胰岛素序列肽治疗；系统性红斑狼疮用P53蛋白衍生肽治疗；而Guillain-Barré综合症用髓鞘抗原P2肽治疗。
近几年，已提出与自身免疫病相关的病原性自身抗原衍生肽或其类似物用于治疗自身免疫病。例如，已描述人MBP序列衍生肽(US5,817,629、US 6,250,040)及其类似物(US 5,948,764、US 6,329,499)用于治疗多发性硬化；已提出65kD的人GAD异构体和胰岛素的肽类似物用于治疗糖尿病(分别为US 5,945,401和US 6,197,926)；已描述一种自身抗原或其片段用于治疗眼色素层视网膜炎(US 5,961,977)。
在各种自身免疫病的每一种当中，最好给予相关肽的佐剂溶液，所述佐剂应当活化抗炎TH2表型的T细胞。预期这样可阻碍自身免疫进程(参见Liblau等，1995)。还有不涉及自身免疫病治疗的情况，其中活化特异性TH2表型T细胞是有用的。但是，涉及自身抗原的治疗必须用不诱导TH1型免疫的佐剂进行，TH1型免疫可能激活受治疗患者的危险的TH1自身免疫。因此，需要鉴别出能够和诱导非炎性TH2型T细胞的特定抗原组合的佐剂。
佐剂依其特性为非特异性免疫调节剂。适于以上概述目的的佐剂应是能够与抗原或其它分子组合成治疗性疫苗的非特异性免疫调节剂，以便诱导目的抗炎表型的特异性T细胞活化。
几种适于治疗T细胞介导性疾病(例如自身免疫病)的肽显示在油性溶媒中以皮下(SC)给予小鼠有效，所述油性溶媒例如称为不完全弗氏佐剂(IFA)的矿物油乳浊液(Ben-Nun和Cohen，1982)。但是，IFA以及完全弗氏佐剂(CFA；含各种量灭活分枝杆菌生物体的矿物油制剂)不允许用于人类，因为矿物油在体内不能降解。
本发明人先前已经发现，包含10-20％植物和/或动物来源的甘油三酯、1.2-2.4％植物和/或动物来源的磷脂、2.25-4.5％渗透压调节剂、0-0.05％防氧化剂并加无菌水至总共100ml的可代谢脂肪乳浊液，例如称为Intralipid和Lipofundin的脂质乳浊液，可作为佐剂和特异性肽组合用于治疗T细胞介导性疾病(例如自身免疫病)(WO97/020016)。
US 5,019,383描述了含肽残基的合成疫苗，所述肽残基偶联至一个或多个至少12个碳原子的烷基或烯基或其它烃类物质，其中所述烷基或烯基可以为偶联多功能基团的一个或多个功能基团的脂肪酸残基，所述多功能基团结合至所述肽残基的N-末端氨基和/或C-末端羧基。
发现有效用于肽治疗的可降解并起抗炎免疫调节剂作用的载体应当是非常理想的。
本发明概述现在已经发现，按照本发明，某些长链脂肪醇、其与C1-C6链烷酸的酯、或长链脂肪酸与链烷醇或多元醇的某些酯起抗炎免疫调节剂的作用，因此可作为佐剂和特异性抗原组合用于激活T细胞，以便治疗自身免疫病和优选需要TH2型免疫应答的T细胞介导的免疫作用。
本发明因此在一个实施方案中涉及治疗T细胞介导性疾病的治疗性制剂，其含有炎性T细胞识别的抗原和载体，其中所述炎性T细胞与所述T细胞介导性疾病发病相关，而其中所述载体是选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其中所述酯选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C1-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
和本发明载体一起使用的抗原由与自身免疫病或其它T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别，并可以是肽或非肽抗原。
在另一个实施方案中，本发明涉及以上定义的治疗性制剂，其使个体T细胞细胞因子应答由TH1向TH2转换。
在另一个实施方案中，本发明涉及以上定义的治疗性制剂，其使IL-2和/或IFN-γT细胞细胞因子应答下降，而IL-4和/或IL-10 T细胞细胞因子应答增加。
在再另一个实施方案中，本发明涉及抗炎免疫调节剂和与T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别的抗原一起用于生产用于治疗所述T细胞介导性疾病的治疗性制剂的用途，所述抗炎免疫调节剂选自(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其中所述酯选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C1-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
在再另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗罹患T细胞介导性疾病的患者的方法，该方法包括给予所述患者含抗原(被与所述T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别)和生物活性载体的治疗性制剂，所述生物活性载体由选自以下的抗炎免疫调节剂的脂质乳浊液组成(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其中所述酯选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
附图简述
图1显示了油醇(OA)对佐剂关节炎(AA)的剂量效应作用。在诱生AA前14天皮下给予大鼠一次不同剂量的OA。
本发明详述在本文的说明书和权利要求书中，术语“载体”和“佐剂”作为同义词使用，是指可与抗原组合成治疗性疫苗诱导目的抗炎表型的特异性T细胞活化的非特异性免疫调节剂。
本发明提供一种作为佐剂和与T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别的抗原一起用于生产治疗所述T细胞介导性疾病的治疗性制剂的抗炎免疫调节剂。
按照本发明使用的佐剂是选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其中所述酯选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
按照本发明的一个优选实施方案，所述佐剂为长链饱和或不饱和C10-C20脂肪醇，优选C16-C20脂肪醇，最优选C18脂肪醇。按照本发明可使用的饱和脂肪醇的实例包括但不限于癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇和优选的鲸蜡醇(也称作棕榈醇)。所述不饱和脂肪醇优选具有一个或多个顺式双键和16-18个碳原子，例如但不限于油醇(顺式-9-十八碳烯醇)、亚油醇(顺式-9，12-十八碳二烯醇)、γ-亚麻仁醇(顺式-6，9，12-十八碳三烯醇)和亚麻仁醇(顺式-9，12，15-十八碳三烯醇)。在优选实施方案中，所述脂肪醇为鲸蜡醇、亚麻仁醇或最优选的油醇。
在另一个实施方案中，本发明的佐剂为以上定义的脂肪醇和C1-C6链烷酸(例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)的酯。
在再一个实施方案中，本发明的佐剂为饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸的酯，其中所述酯选自C1-C8烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯，其中甘油三个羟基中的一个或两个与所述饱和或顺式不饱和长链脂肪酸酯化。
C10-C20脂肪酸优选为C16-C20脂肪酸，最优选为C18脂肪酸。在一个实施方案中，所述C10-C20脂肪酸是饱和脂肪酸，例如但不限于癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。在另一个实施方案中，所述C10-C20脂肪酸是顺式不饱和脂肪酸，例如但不限于棕榈烯酸(顺式-9-十六碳烯酸)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)、顺式-异油酸(顺式-11-十八碳烯酸)、亚油酸(顺式-9，12-十八碳二烯酸)、γ-亚麻酸(顺式-6，9，12-十八碳三烯酸)、亚麻酸(顺式-9，12，15-十八碳三烯酸)和花生四烯酸(顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸)。在一个优选实施方案中，所述脂肪酸为油酸。
饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸的烷基酯在烷基链中可具有1-6个碳原子，可为但不限于甲基或乙基。在优选实施方案中，所述烷基酯为油酸甲酯或油酸乙酯。
在另一个实施方案中，本发明的佐剂为饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸与具有至少两个羟基的多元醇(例如C2-C8链烷二醇、甘油或糖类)的单酯。
所述C2-C8链烷二醇优选为2-4个碳原子，更优选为2个碳原子，其可以为1，2-乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。这种酯的一个实例是1，2-乙二醇一油酸酯。
所述糖类可以是例如但不限于单糖，例如核糖、果糖、葡萄糖、半乳糖或甘露糖。这种酯的一个实例是甘露糖一油酸酯。
按照本发明的另一个实施方案，所述佐剂为甘油和C10-C20脂肪酸的单酯或二酯。在单酸甘油酯(例如甘油一油酸酯)的情况下，获得的酯将含有两个自由羟基。双酸甘油酯包含一个自由羟基而另两个羟基都可以与2个C10-C20脂肪酸分子酯化(例如双油酸甘油酯)，或者一个羟基与1个C10-C20脂肪酸分子酯化，第二个羟基与1个另一种羧酸分子(例如但不限于脂肪族C1-C6羧酸，例如乙酸、丙酸、丁酸和己酸))酯化。
本发明的抗炎免疫调节剂形成脂质乳浊液，当作为疫苗佐剂与被治疗疾病所涉及的T细胞能与之反应的抗原物质一起使用时，用于介导治疗前TH1 T细胞反应向治疗后TH2 T细胞反应的转换。这一发现证实，这样的脂质乳浊液是耐受抗原性的生物活性载体，可用于治疗任何TH1介导疾病的疫苗中。在这样的疫苗中，抗原提供疗效的免疫特异性，而本发明的生物活性载体则提供了生物学效应，即TH1→TH2转换。由于本发明的所述生物活性载体介导的转换，一系列自身反应性疾病可以通过使用一种可诱导T细胞细胞因子转换的抗原/载体组合加以治疗。
包含抗原和所述抗炎免疫调节佐剂的治疗性制剂按照本发明的一个优选用途为治疗由TH1细胞介导的器官特异性自身免疫病。这样的疾病包括但不限于诸如多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎和甲状腺炎等自身免疫病。
用于这种制剂的抗原是一种与所述自身免疫病发病相关的炎性T细胞识别的抗原，并可以是参与所述疾病进程的完整蛋白、所述蛋白序列衍生的肽、在病原性自身抗原肽表位中具有单个氨基酸取代的变异肽或与所述疾病相关的炎性T细胞识别的任何其它肽。
因此，用于治疗多发性硬化的抗原可以是MBP、MOG或PLP，或US 5,817,629所述的人MBP序列衍生的肽，例如肽MBP(75-95)、MBP(86-95)和MBP(82-98)，或US 5,948,764和6,239,499描述的其类似物，或MOG肽或PLP肽或其类似物。所述抗原还可以是共聚物1或Cop1，其是一种由以下4种氨基酸组成的随机共聚物酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸，其与MBP在功能上可交叉反应，并能够在抗原提呈时与MHC II类分子上的MBP竞争。乙酸盐形式的Cop1(通用名为Glatiramer乙酸盐)已在几个国家批准用于治疗MS，其商品名为COPAXONE(Teva Pharmaceuticals Ltd.，Petah Tikva，Israel的商标)。
对于I型糖尿病(IDDM)治疗，所述肽可衍生自谷氨酸脱羧酶(GAD)或如US 5,945,401所述的GAD肽类似物，或胰岛素肽类似物，例如包含天然胰岛素B链序列残基9-23的肽，其在12、13、15和/或16位变异，并可如US 6,197,926所述进一步变异。
对其它自身免疫病治疗，所述肽衍生自与所述疾病相关的抗原序列或其肽类似物。因此，对于自身免疫性甲状腺炎治疗，所述肽衍生自甲状腺球蛋白序列；对于类风湿性关节炎，自身抗原可衍生自胶原蛋白II或分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)，例如称为hsp60的60kDa热激蛋白(其构成在佐剂关节炎中由T淋巴细胞识别的分枝杆菌表位)或对应的人HSP60或其肽；对于重症肌无力治疗，所述肽衍生自乙酰胆碱受体序列或如US 6,066,621所述的其类似物；对于系统性红斑狼疮治疗，所述肽可衍生P53蛋白序列；而对于Guillain-Barré综合症治疗，所述肽可衍生自髓鞘抗原P2序列。
所述抗原可以为非肽抗原。可按照本发明使用的非肽抗原的实例包括但不限于治疗磷脂综合症的磷脂、治疗动脉硬化的胆固醇以及治疗系统性红斑狼疮的DNA分子。
该抗原是否为肽并不重要。因此，例如，对TH1介导的变态反应，其结果是皮肤过敏和发炎，如接触性皮炎，可以使用这样的疫苗来治疗包括刺激性抗原和本发明的可以引起细胞因子反应从TH1型向TH2型转换的生物活性载体。因此，虽然患者继续维持针对抗原的高水平抗体，但造成皮肤发炎的炎症性T细胞反应受到抑制。
因而，本发明的耐受抗原性生物活性载体可以在需要对T细胞攻击的抗原产生耐受的任何时候使用，即，当疫苗被用以限制T细胞介导性疾病，特别是TH1细胞介导疾病的任何时候。如果可以确定在移植物排斥或移植物抗宿主疾病中是何种抗原激活此反应，那么给予这样的抗原和本发明的载体就可以指望促使从不希望的炎症性TH1反应向更为期望的TH2反应转换，不管在这种情况下能与T细胞反应的抗原数目总体上的复杂性。
为了确定肽激活后T细胞分泌的细胞因子，用体外激活测定法检测患者外周血中的淋巴细胞。从置于fico-hypaque中的肝素化全血中分离外周血淋巴细胞，将其与5-50μg/ml浓度的测试肽培养。在不同时间收集培养T细胞上清液，按ELISA或生物测定法检验不同细胞因子的活性。
本发明发现长链脂肪醇及其酯以及某些脂肪酸酯可以有效地作为佐剂用于T细胞活化，这是完全出乎意料的。同样，这些制剂为耐受抗原性生物活性抗炎免疫调节剂这一发现也是完全出乎意料的。
加入抗原和如本文所述使用免疫调节剂作为佐剂的优势在于以下事实治疗可限于诱导保护性TH2免疫反应所需的相对较短的接触—如此诱导的特异性TH2免疫自身将积极抑制疾病。如果没有所述抗原，则不得不长期给予所述免疫调节剂，以便持续抑制炎症，而且一旦停止治疗，预计疾病将复发。持续给予单独的抗炎剂的长期作用可能不理想。因此，通过将本发明的免疫调节剂和特异性抗原组合在一起诱导对炎症过程的积极且特异性调节是有利的。
本文引用的所有美国专利和其它参考文献都在此引作参考，就如同在本文完全公开一样。
现在用以下的非限制性实施例阐述本发明。
实施例实施例1.油醇和其它药物防佐剂关节炎(AA)的抗炎作用一个用于测试本发明药物抗炎活性的模型是佐剂关节炎，它是一种用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原接种某些大鼠品系诱发的实验性关节病(Pearson，1956)。该病用作人类关节炎病(例如类风湿性关节炎、Reiter综合症的反应性关节炎、关节强直性脊椎炎和其它似乎由免疫系统介导的关节炎)的模型(Pearson，1964)。佐剂关节炎也用作免疫介导炎症(一般包括细胞介导的自身免疫反应、移植排斥和变态反应)的模型。例如，可抑制佐剂关节炎的治疗包括皮质甾类、环孢菌素A(Jaffee等，1989；Pollock等，1989)、咪唑硫嘌呤之类的免疫抑制剂和其它广泛用于治疗自身免疫病的免疫抑制剂。因此，一种治疗剂抑制佐剂关节炎就表明该药物是潜在有效的广谱抗炎药。
如文献所述(Pearson，1956)用1mg/0.1ml灭活结核分枝杆菌(Sigma)的IFA(Sigma)溶液在尾根处接种近交8-10周龄Lewis大鼠(Harlan-Olac Limited，Blackthorn，Oxon，UK)，以诱发AA。观察到12-14天后肢体出现关节炎，如文献所述(Holoshitz等，1983)分别对四肢每一条的炎症严重性以0-4评分，求和得0-16的评分。通常在接种后26天左右观察到关节炎发病高峰。
对照大鼠未治疗或注射盐水治疗。通过将在诱发后第12天开始每隔一天腹腔给予皮质甾类药物地塞米松(200μg)进行治疗的大鼠组包括在内，获得免疫抑制的阳性对照。在诱发AA前第14天或诱发AA后第12天皮下(SC)给予一次所述免疫调节剂。如下计算炎症最强日检测的炎症抑制百分比 实验采用各100μl的甘油单油酸酯、油醇、亚麻仁醇、鲸蜡醇、甘露醇单油酸酯、油酸乙酯和油酸甲酯，结果显示它们全部都有效，产生超过66％的炎症抑制，而油酸没有作用。结果概述于表1。另两个实验显示500μl油醇抑制炎症达96％和91％。
表1.各种药物对佐剂关节炎炎症的作用
实施例2.不同剂量油醇的抗AA作用为研究油醇对AA的剂量效应作用，如以上实施例1所述，在诱发AA前第14天皮下给予Lewis大鼠一次10、50、100或500μl剂量的油醇。
图1显示了油醇的剂量效应作用。由图可见，油醇剂量增加抑制关节炎。在发病高峰日第26天，炎症抑制达14％(10μl)、61％(50μl)、78％(100μl)和90％(500μl)。
实施例3.免疫调节剂作为佐剂治疗EAE的用途已经表明在以上实施例1测试的油醇和其它化合物是有效的抗炎免疫调节剂，现在的目的是测试其作为佐剂和与T细胞介导性疾病(例如自身免疫病)发病相关的炎性T细胞识别的抗原一起对治疗所述T细胞介导性疾病的作用。
可通过用MBP的CFA溶液接种Lewis大鼠诱发EAE。为此，通过用25μg MBP(总共50μg)的CFA溶液(Sigma)注射每只爪垫，用豚鼠MBP(Sigma)接种7-9周龄的雌性Lewis大鼠。在接种后约12天发病，其特征是由于中枢神经系统炎症而导致的不同程度的麻痹。使用4级评分对大鼠麻痹评分0，无麻痹；1，尾无力(悬垂)；2，后肢麻痹；3，后肢和前肢麻痹；4，严重的全身麻痹(Lorentzen等，1995)。
EAE由识别MBP分子限定决定簇的T细胞引起。Lewis大鼠中的主MBP决定簇由包含MBP序列71-90的肽(后文称为p71-90肽)组成。
为了测试给予致脑炎的MBP p71-90肽和本发明的佐剂是否也可以抑制EAE的发生，在MBP接种当天(第0天)和5天后(第5天)或MBP接种前第14天和第7天，皮下注射以100μl油醇或本发明的另一种免疫调节剂的石蜡油溶液乳化的p71-90肽或免疫调节剂的单独的石蜡油溶液(没有所述肽)来治疗每组5-8只的Lewis大鼠。通过检测发病率和疾病严重性评价p71-90/油醇或另一种免疫调节剂对EAE的治疗作用。与对照治疗相比用p71-90肽的石蜡油溶液或用没有肽的免疫调节剂和石蜡油的最大麻痹程度下降，这表明诸如p71-90 MBP肽的相关肽的乳浊液和所述免疫调节剂能够调节大鼠中的EAE。
实施例4.免疫调节剂作为佐剂治疗AA的用途如以上实施例1所述，通过用含1mg灭活结核分枝杆菌的IFA溶液(Sigma；0.1ml的1mg/ml溶液)在尾根处接种7-9周龄雌性Lewis大鼠来诱发AA。以0-16评分对关节炎程度进行评级。
为治疗AA，在诱发AA后，用100μg重组hsp60(在Lewis大鼠佐剂关节炎中由T淋巴细胞识别的分枝杆菌表位(Van Eden等，1988))的PBS溶液、或其用100μl油醇或本发明另一种免疫调节剂的石蜡油溶液乳化的溶液、或用免疫调节剂的单独的石蜡油溶液(无肽)，通过在AA诱发当天(第0天)和7天后(第7天)或第-14天和第-7天皮下注射，治疗每组5-8只7-9周龄的雌性Lewis大鼠。如实施例1所述评价对关节炎的治疗作用。
实施例5免疫调节剂治疗I型糖尿病的用途在NOD糖尿病小鼠模型中，胰脏中产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏是由T淋巴细胞介导的。5-8周龄胰岛周围发生炎症性浸润，到14-20周龄导致胰岛素缺乏的β细胞损伤和外显糖尿病都已显现出来，到了35-40周龄则几乎100％的雌性NOD小鼠都受到影响。
可用油醇或本发明的另一种免疫调节剂配制的60kDa hsp肽p277或其类似物p277(Val6-Val11)(如WO 97/20016所述)进行治疗，但下文描述的是p277(Val6-Val11)的油醇溶液。
用100μg p277(Val6-Val11)的0.1ml PBS溶液或油醇脂质乳浊液治疗NOD雌性小鼠。6月龄时检查糖尿病发病率和抗p277(Val6-Val11)抗体的产生率。糖尿病诊断依据是持续高葡萄糖血症，间隔一周至少二次用Beckman Glucose Analyser II测得血糖水平超过11mmol/L。成功的肽治疗如下评价维持正常血糖浓度(低于11mmol/L)，减轻胰岛岛内炎症(胰岛炎)和诱导作为TH2型免疫反应指标的针对治疗肽的抗体。
用p277(Val6-Val11)肽治疗对糖尿病的保护依赖于对该肽的TH2免疫反应性。因此，以ELISA来测定p277(Val6-Val11)免疫小鼠中抗体的产生情况。用10μg/ml p277(Val6-Val11)肽包被Maxisorp微量滴定板(Nunc)18小时，用7％奶粉封闭非特异性结合2小时。小鼠血清以1∶50稀释后结合2小时，特异性结合通过加入碱性磷酸酶抗小鼠IgG(Serotec)保温2小时和对硝基苯磷酸盐底物(Sigma)保温30分钟进行检测。用ELISA读数仪(Anthos)检测OD＝405nm的光密度值。NOD小鼠用p277(Val6-Val11)的PBS溶液免疫后根本未表现处抗体反应，而p277(Val6-Val11)的油醇溶液免疫后小鼠产生肽特异性抗体，提示治疗效应可能源自自身免疫性T细胞产生的主导性细胞因子的转换。
如前所述，TH1细胞分泌诱导T细胞增殖的IL-2和介导组织炎症的细胞因子(如IFN-γ)；而TH2细胞分泌IL-4，“协助”B细胞产生某些抗体同种型，主要是IgG1和IgG2b，而TH2细胞分泌的IL-10和其它细胞因子(例如IL-5)则“抑制”组织炎症。
从TH1型反应向TH2型反应转换的可能性得到了p277(Val6-Val11)治疗后产生的抗体同种型分析的支持。如上所述用油中的p277(Val6-Val11)或PBS治疗各组的3月龄NOD小鼠。治疗后分析各只小鼠血清针对p277(Val6-Val11)的抗体同种型(每组12-15只小鼠)。使用采用同种型特异性显影抗体试剂(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)的ELISA测定法对抗体同种型进行检测。治疗后产生的抗p277抗体的抗体同种型分析表明它们无一例外属IgG1和IgG2b类，它们依赖于产生IL-4的TH2 T细胞，这证实了用所述免疫调节剂治疗诱导TH1向TH2转换。p277(Val6-Val11)治疗不应产生TH1型IgG2a抗体。产生针对治疗所用特异性肽的抗体是一种信号，表明自身免疫T细胞反应已经从破坏性TH1炎症模式转向产生无害抗体以及抑制炎症和组织损伤的TH2 T细胞反应。
为证实细胞因子转换事件，分析了p277(Val6-Val11)-油醇治疗小鼠和对照小鼠中对p277(Val6-Val11)反应活性的T细胞所产生的细胞因子。伴刀豆球蛋白A(ConA)是一种T细胞分裂原，用其刺激整个脾T细胞作为对照。
用p277(Val6-Val11)的油醇溶液或PBS的油醇溶液治疗3月龄10只一组的NOD小鼠。5周后，取下各小鼠的脾，将脾细胞混合在一起。将脾细胞与ConA或p277(Val6-Val11)共温育24小时(分泌IL-2和IL-4)或48小时(分泌IL-10和IFN-γ)。按照Pharmingen细胞因子ELISA方法采用Pharmingen成对抗体以ELISA计量培养上清中存在的细胞因子。Pharmingen重组小鼠细胞因子作为标准制备标准曲线。简言之，平底96孔微量滴定板用大鼠抗小鼠细胞因子单抗(mAb)4℃包被18小时，加入培养上清或重组小鼠细胞因子，置于4℃达18小时。冲洗该板，加入生物素化大鼠抗小鼠细胞因子单抗，室温45分钟，然后充分冲洗，加入抗生物素蛋白-碱性磷酸酶。冲洗此板，加入显色底物(对硝基苯磷酸酯)，用ELISA读数板于405nm对样品读数。对照小鼠脾细胞在与p277(Val6-Val11)温育时分泌IL-2和IFN-Y，但在p277(Val6-Val11)或ConA作用下产生非常少的IL-4或IL-10。在p277(Val6-Val11)-油醇治疗小鼠中，在p277(Val6-Val11)作用下IL-10和IL-4产量显著升高，同时IL-2和IFN-γ产量下降，这证实了从TH1向TH2的转换。
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权利要求
1.一种用于治疗T细胞介导性疾病的治疗性制剂，其包含抗原和载体，其中所述抗原是与所述T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别的抗原，而其中所述载体是选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
2.权利要求1的治疗性制剂，其中所述载体是饱和C10-C20脂肪醇。
3.权利要求2的治疗性制剂，其中所述饱和C10-C20脂肪醇选自癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇和硬脂醇。
4.权利要求1的治疗性制剂，其中所述载体是顺式不饱和C16-C18脂肪醇。
5.权利要求4的治疗性制剂，其中所述顺式不饱和C16-C18脂肪醇选自油醇、亚油醇、γ-亚麻仁醇和亚麻仁醇。
6.权利要求1的治疗性制剂，其中所述载体是饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇与C1-C6链烷酸的酯。
7.权利要求1的治疗性制剂，其中所述载体是饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
8.权利要求7的治疗性制剂，其中所述脂肪酸为饱和C10-C20脂肪酸。
9.权利要求8的治疗性制剂，其中所述饱和脂肪酸选自癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
10.权利要求7的治疗性制剂，其中所述脂肪酸为顺式不饱和C10-C20脂肪酸。
11.权利要求10的治疗性制剂，其中所述顺式不饱和C10-C20脂肪酸选自棕榈烯酸、油酸、顺式-异油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、亚麻酸和花生四烯酸。
12.权利要求11的治疗性制剂，其中所述脂肪酸烷基酯为油酸甲酯或油酸乙酯。
13.权利要求7-12任一项的治疗性制剂，其中所述脂肪酸酯是脂肪酸与多元醇的单酯，所述多元醇选自C2-C8链烷二醇、甘油和糖。
14.权利要求13的治疗性制剂，其中所述链烷二醇选自1，2-乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。
15.权利要求13的治疗性制剂，其中所述脂肪酸与甘油的单酯为甘油一油酸酯。
16.权利要求13的治疗性制剂，其中所述糖为单糖，选自核糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
17.权利要求16的治疗性制剂，其中所述脂肪酸单酯为甘露糖一油酸酯。
18.权利要求7-12任一项的治疗性制剂，其中所述脂肪酸酯为脂肪酸与甘油的二酯。
19.权利要求18的治疗性制剂，其中所述甘油二酯为甘油二油酸酯。
20.一种引起个体的T细胞细胞因子反应从TH1向TH2转换的治疗性制剂，其包含抗原和载体，其中所述抗原被与T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别，而其中所述载体是选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
21.权利要求20的治疗性制剂，其中所述载体同权利要求2-19任一项的定义。
22.权利要求20或21的治疗性制剂，其引起IL-2或IFN-γT细胞细胞因子反应降低，而IL-4或IL-10 T细胞细胞因子反应增强。
23.权利要求1-22任一项的治疗性制剂，其中所述T细胞介导性疾病为自身免疫病，而所述抗原为肽。
24.权利要求23的治疗性制剂，其中所述自身免疫病是一种器官特异性自身免疫病。
25.权利要求24的治疗性制剂，其中所述器官特异性自身免疫病选自I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎和自身免疫性甲状腺炎。
26.权利要求25的治疗性制剂，其用于治疗多发性硬化，其包含由髓鞘碱性蛋白(MBP)序列衍生的肽或其类似物，所述肽或其类似物被参与多发性硬化发病的T细胞识别。
27.一种载体和一种抗原一起用于生产治疗T细胞介导性疾病的治疗性制剂的用途，其中所述载体为选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯，而其中所述抗原被与所述T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别。
28.权利要求27的用途，其中所述载体同权利要求2-19的任一项的定义。
29.用于治疗罹患T细胞介导性疾病的患者的方法，该方法包括给予所述患者一种治疗性制剂，其含有被与所述T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别的抗原和由选自以下的抗炎免疫调节剂组成的载体(a)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪醇或其与C1-C6链烷酸的酯；和(b)饱和或顺式不饱和C10-C20脂肪酸酯，其选自脂肪酸的C1-C6烷基酯、脂肪酸与具有至少两个羟基的C2-C6多元醇的单酯以及脂肪酸与甘油的二酯。
30.权利要求29的方法，其中所述载体同权利要求2-19任一项的定义。
全文摘要
本发明提供用于治疗T细胞介导性疾病的治疗性制剂，其包含抗原和载体，其中所述抗原被与所述T细胞介导性疾病发病相关的炎性T细胞识别，而其中所述载体为选自以下的抗炎免疫调节剂(a)饱和或顺式不饱和C
文档编号A61P19/00GK1514736SQ02811488
公开日2004年7月21日 申请日期2002年4月11日 优先权日2001年4月11日
发明者I·R·科亨, M·钦茨奇, R·马加利特, I R 科亨, 永 , 钠 申请人:耶达研究及发展有限公司