专利名称：一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法、检测系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于临床医学诊断学领域，具体涉及一种检测血清N糖1og(P9/P4) 的方法、检测系统及其应用。
背景技术：
原发性肝细胞癌(HCC)是全球第五位常见恶性肿瘤，也是近年来发病率 上升最快、病死率最高的肿瘤之一。在我国，由于HBV的高感染性而导致慢 性肝病、肝硬化的高发性。据研究报道在这些高危人群一生中有10-25%的机 率发展为HCC。 HCC起病多较隐匿，早期一般多无临床症状，或仅有肝炎 的症状与体征，很难早期发现。 一旦出现典型的临床表现，如肝区疼痛，消 瘦，黄疸或腹水等，通常已经发展到中晚期，而失去了进行根治性手术的机 会。目前常用的高危人群筛查指标是血清甲胎蛋白(AFP)检测及超声检查。 AFP是目前唯一公认的可用于临床HCC高危人群筛选的肝癌肿瘤标志物， 但临床研究表明其敏感性仅36-64%，特异性为79-91% ，有1/3左右的HCC 可表现为AFP正常，即使AFP升高者,也不能排除慢性肝病、肝硬化等非恶性 肝病。超声检查通常难以发现、确认小于3cm的肿块，且超声医师个体诊断 水平的差异对诊断结果有很大影响，上述现状导致HCC难以实现早期发现和 早期治疗，患者预后差、5年生存率低、病死率高。因此寻找有效的早期筛 查及诊断指标对提高HCC的整体诊治水平迫在眉睫。
近年来蛋白组学及糖组学研究的快速发展为研究肿瘤生物学及相关肿瘤 标志物提供了新的契机。糖基化是最常见的蛋白翻译后修饰形式，体内所有 蛋白质中近50%为糖基化蛋白。细胞表面糖蛋白的糖基化形式参与介导了细 胞-细胞、细胞-间质之间的相互作用。而且在肿瘤发生发展过程中常出现寡 糖结构的改变，这种改变为特殊糖基化分子成为潜在早期诊断标志物提供了 重要理论依据。由于血清中除浆细胞产生的免疫球蛋白外，绝大部分糖蛋白 由肝细胞合成的，肝脏参与了血浆中近50%的糖蛋白的糖基化修饰，所以HCC 患者血清糖蛋白的糖基化改变可以反应病变的发生发展。但长期以来，糖基化分析由于存在技术瓶颈，难以在临床研究中得以采用。目前主要研究手段
包括FACE (荧光辅助糖电泳)、糖微点矩阵、荧光糖结合物探针、毛细管电 泳、X-光衍射(X-ray)、核磁共振(MRI)、高效液相色谱(HPLC)、飞行时间 质谱(MS)、前沿亲和层析、凝集素亲和纯化等。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测血清N糖1og(P9/P4)的方法，及其检测系 统，并将该检测方法与检测系统用于HCC的早期筛査及诊断，特别是与HBV 感染相关的原发性肝细胞癌(HCC)倾向的早期筛查及诊断。
本发明提供一种检测血清N糖1og(P9/P4)的方法，该方法是基于DNA测 序仪的荧光毛细管电泳技术(DSA-FACE， DNA Sequencer Adapted -Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis )，主要步骤是样品血清中 糖蛋白中与天冬酰胺连接(N2连接)的寡糖的释放；用灵敏的荧光标记试剂 标记释放的N糖；去除N-糖链末端唾液酸；检测临床血清中N-糖组图谱， 并对其进行分析比较。
检测血清N糖log(P9/P4)，具体是指，检测样品血清中糖蛋白上以N-糖 苷键相连的糖链成分分布，计算log(P9/P4)值，其中P9是糖链成分分布中第 9个峰的高度，P4是糖链成分分布中第4个峰的高度。
本发明的方法具体包括以下步骤
(1) 用酰胺酶水解样品血清；
(2) 用荧光标记物标记水解出的糖链；
(3) 用唾液酸酶水解；
(4) 对水解产物进行毛细管电泳，检测N-糖链成分分布，计算log (P9/P4)值。
上述的酰胺酶，优选N-糖苷酶F (iWG^eF入 上述的荧光标记物，优选是8-氨基萘酚-1,3,6-亚磺酸(APTS)。 本发明检测结果
① 在原有11峰值的基础上，HCC组常常会出现峰(peak) 12， peakl3 (见
图1);
② 与阴性对照组比较，在HCC组中peak4所占比例减低，而peak9所占比例 升高，与疾病对照组(肝纤维化组，CL)正好相反(见表1)， 1og(P9/P4)可以很好的鉴别HCC与CL，其受试者工作曲线(ROC, receiver operator characteristic)下面积为AUO0. 873 (见图2)。
(D将HCC组病例根据有无血管浸润，分为无浸润(stage I )和有浸润(stage II)两组。Stage II组1og(P9/P4)相对stage I组增加，有统计学意义，(见 表2); 1og(P9/P4)可用于鉴别HCC有无血管浸润，其受试者工作曲线(R0C， receiver operator characteristic)下面禾只为AUC=0. 706 (见图3)。 (Dlog(P9/P4)与临床常规指标AFU， AFP， GGT和T丽分级具有显著相关性 (P<0. 05)。相对AFP以200ng/rnl为临界值，log(P9/P4)用于诊断HCC不同分 级的特异性提高16%，正确率提高8% ，敏感度相近(见表3)。
用本发明的方法，计算得到的1og(P9/P4)大于-0.56，则表明有患与HBV 感染相关的原发性肝细胞癌(HCC)的倾向；1og(P9/P4)小于-0.56，则表明有 患肝纤维化的倾向。
特别是1og(P9/P4)大于-0.25，则表明有患与HBV感染相关的原发性肝细 胞癌(HCC)第II期或更严重的倾向；1og(P9/P4)小于-0.25，则表明有患与 HBV感染相关的原发性肝细胞癌(HCC)第I期的倾向。
本发明还提供了一种检测血清N糖1og(P9/P4)的检测系统，包括毛细管 电泳设备、糖链成分分布检测软件、计算机和输出设备，将上述方法中步骤 (3)得到的水解产物用毛细管电泳设备——ABI3130测序仪进行片段分析， 得到的糖链成分分布图谱输入计算机，经糖链成分分布检测软件一一 PeakScan软件分析，计算1og(P9/P4)值，最后由输出设备输出1og(P9/P4)值。
上述的输出设备是打印机。
另外，计算机还可以进一步将log(P9/P4)与-0.56和/或-0.25比较； 输出设备输出1og(P9/P4)，还可以进一步输出1og(P9/P4)与-0.56和/或-0.25
的比较结果。
本发明的检测方法，相对于目前唯一公认的用于临床原发性肝细胞癌高 危人群筛选的肿瘤指标AFP而言，本发明中的指标1og(P9/P4)对于原发性肝 细胞癌与肝硬化的鉴别诊断效力相近，但log (P9/P4)和peak 9在监测HCC 进程方面似乎较AFP更有效，1og(P9/P4)用于诊断HCC不同分级的特异性提 高16%，正确率提高8% ，敏感度相近。本发明还涉及所述指标1og(P9/P4) 的检测方法。图l三组血清N-糖组图谱，图中显示的是正常对照组，肝纤维化组和HCC 患者组的N-糖组图谱。
图2用于鉴别诊断原发性肝细胞癌与肝硬化的ROC曲线，红色为AFP，绿 色为Log(P9/P4)。
图3:用于鉴别诊断原发性肝细胞癌有无血管浸润的ROC曲线，蓝色为 Log(P9/P4)，绿色为AFP。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。 实施例l:正常对照组、肝纤维化组和HCC患者组的N-糖组图谱分析
收集2007年1月一2008年4月间第二军医大学附属东方肝胆外科医院住院 原发性肝细胞癌145例患者血清。收集同期上海交通大学仁济医院住院肝纤维 化128例患者血清患者。以上患者均符合以下入选标准①均为HBV感染的HCC 患者②患者术后病理标本均经病理科专家确诊为HCC患者或肝纤维化患者；③ 排除人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、丙型 (h印atitis C virus, HCV)、丁型(h印atitis D virus,丽)、戊型(h印atitis E virus HEV)肝炎病毒和梅毒(syphilis)等除乙型肝炎病毒感染之外的其 他病毒感染；④排除自身免疫性肝病、酒精性肝病，药物性肝病和Wilson病； 每例患者临床血常规、生化、肿瘤标志物、乙肝肝炎病毒标志物、DNA载量等 数据的采集与血清收集同期，血清采集均在患者未接受任何治疗之前。对照 组血清120例来自第二军医大学长征医院体检人员。
试剂或仪器p印tide-N-glycosidase F (PNGaseF) 、 10 % NP40购自New England Biolabs公司；标记染料APTS与寡糖标准品购自Beckman Coulter 公司；唾液酸酶(Arthrobacter ureafaciens sialidase)贝勾自Roche公司； 氰基硼氢化钠(NaBH3CN)购自Sigma公司(美国)；99. 99 %十二烷基 硫酸钠(SDS )由Boehringer Ingelheim公司提供(德国)；碳酸氢铵、 乙酸钠、柠檬酸化学纯选用上海试剂四厂试剂。仪器采用美国生物应用公司 (ABI) 3130测序仪，应用PeakScan软件分析结果。
1)以上人员均抽提空腹全血，静置30分钟，3000rpm， lOmin.吸取上层血清，
-8(TC冰箱保存备用。2) 寡糖的释放
214血清+2|4缓冲液(10 mM NH4HC03， 5°/。SDS) 水， 95。C加热5分钟，4。C放置15分钟，
然后加入314 PNGaseF(2. 2 UM) ， 37。C孵育3小时，4'C冷却， 加入10Cmi水，标记为D管。
3) 标记N-糖
取20W (D管溶液)，6CTC烘干3小时， 加入2W标记溶液(20 mM APTS: 1M NaCNBH3 =1:1)， 37 。C孵育16小时， 加200W水终止反应，标记为L管。
4) 去唾液酸
2W(L管溶液)+3W去唾液酸酶(2 mU)， 37。C孵育过夜，
35W水振荡混匀，标记为DE管。
5) 检测分析
取(DE管溶液)用ABI3130测序仪进行片段分析，图谱经PeakScan 软件分析。
经由上述过程处理，每份血清标本均可测得至少11个峰的糖组图谱(见 图l),我们将其标记为peakl至peakll。 HCC组常常会出现peakl2， peakl3。 峰值量化，求的log(P9/P4)值。
应用DSA-FACE方法分析，与疾病对照组(肝纤维化组)和阴性对照组(健 康正常组)比较分析。
本发明检测结果
① 在原有11峰值的基础上，HCC组常常会出现peak12， peakl3(见图1)， 在HCC组中，我们可以发现peak9相对于正常对照组和肝纤维化组均有显著 的升高；
② 与阴性对照组比较，在HCC组中peak4所占比例减低，而peak9所占 比例升高，与疾病对照组(肝纤维化组，CL)正好相反(见表l)， 1og(P9/P4) 可以很好的鉴别HCC与CL，其受试者工作曲线(R0C， receiver operator characteristic)下面积为AUC=0.873 ， AFP的曲线下面积为0.888， 1og(P9/P4)的曲线下面积接近于AFP，因此二者诊断效力相近(见图2)。表l:三组血清N-糖组图谱峰值
peaksControl(n=120)Fibrosis(n=128)HCC(n=145)
HeightHeightHeight
peak17.41±2.558.6±2.8310.16±3.56
pesk21.24±0.531.23±0.461.78±0.73
peak36.56±1.217.25±1.346.88±1.67
pe3k47.13±1.087.51±1.336.62±0.99
peak539.23±3.6438.12±4.7037.57±5.75
peak621.63±3.2121.63±2.8120.23±3.31
peak75.86±1,306.03±1.446.29±1.48
peak87.07±1.515.83±1.735.12±1.75
peak92.21±1.101.98±0.993.83±1.48
pe3k100.17±0.190.26±0.210.38±0.36
peak"1.48±0.401.55±1.241.13±0.48
log(P9/P4)-0.56±0.26-0.63±0.24-0.27±0.21
表1显示了三组血清N-糖组图谱峰值(mean土SD)。其中正常对照组 (Control) 120例，肝纤维化组(Fibrosis) 128例，HCC患者组145例。表 中分别显示三组样本peakl至peakll的峰高。由表中可以看出，peak9和 log(P9/P4)在HCC组中显著升高。
③将HCC组病例根据有无血管浸润，分为无浸润(stage I )和有浸润 (stagell)两组。StageII组log(P9/P4)相对stage I组增加，有统计学意 义，(见表2);蓝色为Log(P9/P4)，绿色为AFP。 二者的曲线下面积分别为 0. 706和0.605， 1og(P9/P4)可用于鉴别HCC有无血管浸润，其受试者工作曲 线(R0C， receiver operator characteristic)下面积为AUO0. 706改图是 显示鉴别诊断原发性肝癌Stage I和stagell的ROC曲线。1og(P9/P4)的曲 线下面积显著大于AFP，因此说明1og(P9/P4)的诊断效力有显著性提高，该 指标可以更好的鉴别诊断HCC的不同分级。(见图3)。
表2: HCC患者按有无血管浸润分组各峰丰度比较
Peak
Stage I (n=67)stagell (n=69)P
peak110.33±3.6810.01±3.400.602
peak21.83±0.771.72±0.630.344
peak37.15±1.766.60±1.570.057
peak46.82±0.936,43±1.050.024
peak537.27±5.8437.99±5.660.466
pe3k620.54±3.4819.76±3.110.171
8peak76.23±1.486.38±1.530.569
peak84.98±1,705.21±1.830.440
peak93.41±1.384.30±1.500.000
pe3k100.36±0.380.41±0.330.435
peak111.07±0.501.19±0.450.166
log(P9/P4)-0.34±0.20-0.20±0.200扁
表2显示两组原发性肝癌，Stage I和stage II的N-糖组图谱峰值比较。 其中Stage I组67例，stage II组69例。Peak9和log (P9/P4)在stage II组 中显著升高(P〈0.001)。
④1og(P9/P4)与临床常规指标AFU, AFP， GGT和T薩分级具有显著相关 性(P<0. 05)。相对AFP以200ng/ml为临界值，log(P9/P4)用于诊断HCC不 同分级的特异性提高16%，正确率提高8% ，敏感度相近(见表3)。
表3: AFP与1og(P9/P4)在HCC不同级期中诊断效力
Cutoff valueTest resultActU3l St3tUS Stage H ，Ssnsitivity (%)Specificity (%)PPV (%)NPV (%)Accuracy (100%)
AFPStage II473162.07
68,1253.7360.2661.03
(200)Stage 12236
log(p寧)Stage II472068.1270.1568.1269.12
2270.15(-0.250)Stage 147
PPV:阳性预测值(positive predictive value), NPV:阴性预测值(negative predictive value).
表3显示了 AFP和log(P9/P4)在cut off值分别为200和-O. 250的情况 下，用于鉴别诊断HCC不同分级的灵敏度，特异度，阳性预测值，阴性预测 值和准确度。表中我们可以看出1og(P9/P4)用于诊断HCC不同分级的特异性 提高16%，正确率提高8%，灵敏度相似。
实施例2:检测患者血清N糖1og(P9/P4)
具体实验步骤
1) 患者l、 2、 3和4抽血，留取血清。
2) 寡糖释放缓冲液(10 rnM NH4HC03， 5%SDS) 水；95 。C加热5分钟，4。C放置15分钟；加入3)4 PNGaseF(2. 2 UM); 37。C孵育3 小时，4。C冷却；加入100W水，标记为D管。
3) 寡糖的标记取20W (D管溶液)，60°C烘干3小时；加入2W标记溶液 (20mMAPTS: 1M NaCNBH3 二l: 1); 37 。C孵育16小时；加200W水终止反应，标记为L管。
4) 寡糖去唾液酸2Pl(L管溶液)+3W去唾液酸酶(2 mil); 37。C孵育过夜； 35W水振荡混匀，标记为DE管。
5) 检测分析取l(Hil (DE管溶液)用ABI3130测序仪进行片段分析，图谱 经PeakScan软件分析。
6) 依次读取peakl至peakll的峰高，并计算1og(P9/P4)。
根据1og(P9/P4)对患者进行分级，即log(P9/P4)<-0.250的为I级，
iog(P9/P4) >-o. 250的为n级及n级以上。
表4: 4位患者各丰度及log(P9/P4)值
丰度患者l患者2患者3患者4
peakl176118222206
peak245143022
peak39987174159
peak49582161122
peak5600377849588
peak6270256524423
peak714371153107
peak8127449491
pesk9275514343
peak10611810
peak1125133224
log(P9/P4)-0. 546-0. 173-0. 051-0. 453
7) 根据cut off值-0.250，我们可以推断患者1和患者4，其 log(P9/P4)<-0.250，因此HCC分级仍处于I级，而患者2和3，其 log(P9/P4)<-0.250，因此HCC分级则高于I级。
8) 随后对患者进行超声，CT等体格检查，结果证实患者1和患者4处于I 级，而患者2和患者3分别处于II级和nia级。
可见本发明检测方法在四例患者中均正确。
10
权利要求
1、一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法，该方法是基于DNA测序仪的荧光毛细管电泳技术，其特征在于该方法具体包括以下步骤(A)用酰胺酶水解样品血清；(B)用荧光标记物标记水解出的糖链；(C)用唾液酸酶水解；和(D)对水解产物进行荧光毛细管电泳，检测糖链成分分布，计算log(P9/P4)值，其中P9是糖链成分分布中第9个峰的高度，P4是糖链成分分布中第4个峰的高度。
2、 根据权利要求1所述的一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法，其特征在于 所述的酰胺酶是N-糖苷酶F。
3、 根据权利要求1所述的一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法，其特征在于 所述的荧光标记物是APTS。
4、 如权利要求l所述的一种检测血清N糖log(P9/P4)的检测系统，其特征在 于该系统包括毛细管电泳设备、糖链成分分布检测软件、计算机和输出设备， 该系统将上述方法中步骤(C)得到的水解产物用毛细管电泳设备进行片段分 析，得到的糖链成分分布图谱输入计算机，经糖链成分分布检测软件分析， 计算1og(P9/P4)值，最后由输出设备输出1og(P9/P4)值。
5、 根据权利要求4所述的一种检测血清N糖log(P9/P4)的检测系统，其特征 在于所述的输出设备是打印机。
6、 如权利要求1所述的一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法在原发性肝细胞 癌的早期筛査及诊断中的应用。
7、 如权利要求4所述的一种检测血清N糖1og(P9/P4)的检测系统在原发性 肝细胞癌的早期筛查及诊断中的应用。
全文摘要
本发明属于临床医学诊断学领域，原发性肝细胞癌(HCC)是全球第五位常见恶性肿瘤，目前常用的高危人群筛查指标是血清甲胎蛋白(AFP)检测及超声检查，但敏感性较低，特异性不高，导致HCC难以早期发现早期治疗。本发明的目的是提供一种检测血清N糖log(P9/P4)的方法，该方法是基于DNA测序仪的荧光辅助毛细管电泳糖分析技术(DSA-FACE)来检测血清中糖蛋白上以N-糖苷键相连的糖链成分分布，计算log(P9/P4)值；本发明还提供了相应的检测系统，并将该检测方法与检测系统用于HCC的早期筛查及诊断，特别是与HBV感染相关的原发性肝细胞癌(HCC)倾向和肝纤维化倾向的早期筛查及诊断。相对于AFP而言，特异性提高16％，正确率提高8％，敏感度相近。
文档编号G01N27/447GK101576495SQ200910052698
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者周飞国, 君 季, 萌 房, 皓 王, 赵云鹏, 赵金艳, 星 顾, 高春芳 申请人:中国人民解放军第二军医大学