专利名称：5-fu抗肿瘤疗效与安全性检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体5-FU抗 肿瘤疗效与安全性的试剂盒，通过检测5-氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性位 点来评估个体5-FU抗肿瘤疗效与安全性。
背景技术：
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤被人类发现已有3000多年历史，一般 分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，通常所讲的“癌症”指的是所有的恶性肿瘤。目前调查研究显示，肿瘤已成为常见病，多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健 康最严重的一类疾病。我国最为常见和危害性最严重的肿瘤为肺癌、肝癌、大肠癌、食管癌、 胃癌、乳腺癌和白血病等。在肿瘤的治疗中，化疗占有十分重要的地位，是手术后辅助治疗的必要手段。然而 各种抗肿瘤药物因具有细胞杀伤能力而潜藏着严重的药物毒副作用，且因人而异的发挥着 难以预测的治疗作用。因此，随着人们对药动学、药效学和药物基因组学的深入了解和把 握，使得通过更加灵敏、有效的基因检测手段来预测药物疗效和规避不良反应成为可能。5-氟尿嘧啶该药为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷 酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转换成脱氧胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合 成也有一定的抑制作用。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-氟尿嘧啶(5-FU)分解代谢的限速酶，其活性的高低 将影响5-FU的代谢速度，进而影响到5-FU的疗效和毒副反应。DPD由二氢嘧啶脱氢酶基因 (DPYD)编码，DPYD序列上碱基的突变可能引起DPD结构及活性的改变。估计约有3_8%的 肿瘤患者带有导致DPD活性降低的基因突变位点。这使得病人即使是仅服用非常小剂量的 5-FU或仅服用1次5-FU后，就可能导致非常严重的毒副作用，甚至危及生命。对于DPYD基因的变异和碱基序列的缺失也研究得较多。到目前为止，至少有20 余种突变与DPD活性下降有关。其中与5-FU密切相关的是DPYD第1986位剪接位点发生 G到A的转化(DPYD*2A)导致外显子14的缺失(IVS14+1G > A)，形成无活性DPD，使5-FU 的代谢清除受阻，而合成途径更加活跃。合成途径的活性代谢产物累积可以导致血液、神经 以及消化系统的毒性，甚至危及生命。
发明内容
基于5-氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性可用来评估个体5-FU抗肿 瘤疗效与安全性的基础上，本发明提供一种检测个体5-FU抗肿瘤疗效与安全性的试剂盒。该试剂盒包括检测5-氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性位点的特异性引物对及特异 性荧光探针对；
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荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括10X荧光定量PCR反应缓冲液1 Pi，25mM dNTP 混合液 0. 1 u 1,25mM MgC12 溶液 0. 6u 1,5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 u 1,20 iiM特异性引物对每条引物各0.225 iil，10 uM特异性荧光探针对每条探针各0. 25 u M，去离子水 5. 325ii 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总 体积10 u 1，包含浓度为20ng/ yl的DNA模板2 ill、1 ill 10X荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA 聚合 酶、20 y M的有义引物和反义引物各0. 225 iU、10 y M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针 各 0. 25ii 1，去离子水 5. 325 u 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体5 FU抗肿瘤疗效与安全性的试剂盒，其特征在于包括检测5 氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液1 μ 1，；25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,；25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，；5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,；20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，；10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体5-FU抗肿瘤疗效与安全性的试剂盒。该试剂盒包括检测5-氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测5-氟尿嘧啶药物用药靶向位点DPYD基因多态性位点来评估个体5-FU抗肿瘤疗效与安全性。
文档编号G01N21/64GK101928765SQ200910053960
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司