专利名称：乙肝拉米夫定用药疗效检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体乙肝拉 米夫定用药疗效的试剂盒，通过检测拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性位点来评估个 体乙肝拉米夫定用药疗效。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种世界性疾病，发展中国家发病率 高。据统计全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者多达3.6亿，我国占1.2亿。感染者多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。特点为起病较缓，以亚临床 型及慢性型较常见。慢性感染者中约50% -75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症改变，部分 慢性肝炎可进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌，是主要的疾病死亡因素之一。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液及日常生活密切接触传 播，另一方式为母婴传播。乙肝疫苗的应用是控制和预防乙型肝炎的根本措施。慢性乙型肝炎病毒感染的自然病程漫长，可持续30-50年，并且多在青壮年时期 发病。期间可分为免疫耐受期、免疫清除期、残留期(低复制或无复制期)或终末肝病期。 在免疫清除期，机体免疫系统和病毒反复相互作用，导致慢性乙型肝炎病情持续进展，因而 是急需接受治疗的重要时期。抗乙型肝炎病毒治疗是病原治疗，也是根本的治疗方法，这已达成国际共识。然而 由于病毒、宿主、发病机制等诸多尚未阐明的复杂因素，目前已经批准用于临床的抗病毒治 疗药物有限，疗效还未能达到令人满意的程度，病人经有效的治疗后尚有一定比例的复发 率，治疗失败或复发的病人需要经过一个或多个周期的再治疗。P基因区是HBV DNA中最大的一个开放读码框，基因全长约2. 6kb，编码由850个 左右的氨基酸残基组成的蛋白质，具有逆转录酶活性。P基因变异主要见于RT基因片段(349 692aa，即rtl rt344)。在拉米夫定治 疗中，最常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异，即由YMDD变异 为YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，并常伴有rtL180M变异，且受药物选择而逐渐成为对 拉米夫定耐药的优势株。拉米夫定为核苷类似物抗病毒药，可竞争性抑制HBV DNA聚合酶，使HBV DNA延长 终止，从而抑制HBV-DNA的复制。拉米夫定治疗相关的变异多发生于HBV DNA聚合酶的活 性区域，即YMDD位点附近，并可涉及附近区域(第501、528、545位氨基酸的区段)。野生株YMDD部位呈缓和口袋型，有利于核苷酸和拉米夫定结合，rtM204位点的变 异使侧链变短，柔性降低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸盐之间形成空间位阻，导致与 拉米夫定三磷酸盐的结合力下降，从而不可继续合成HBV-DNA。拉米夫定是近年来新合成的二脱氧胞嘧啶核苷类似物。最早用于治疗AIDS。以 后发现对HBV和HIV混合感染病人，有明显的抗HBV作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水 平。它的作用机理是在体内通过磷酸化成为三磷酸核苷类似物后，可以抑制病毒的DNA多
3聚酶和逆转录酶的活性；并可与核苷竞争性掺入病毒的DNA链，终止DNA链的延长和合成， 使病毒的复制受到抑制而发挥抗病毒作用。在拉米夫定治疗过程中，HBV P区编码的DNA聚 合酶基因发生突变，致使其编码的HBV逆转录酶活性部位-YMDD功能区的甲硫氨酸(M)变 异为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)，即由YMDD变异为YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，导致 逆转录酶亚结构发生改变，在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸盐之间形成空间位阻，妨碍了 与拉米夫定的结合，从而造成HBV对拉米夫定敏感性下降。据报道，在体外YMDD变异株对 拉米夫定的敏感性比野生株降低10000倍。
发明内容
基于拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性可用来评估个体乙肝拉米夫定用药疗 效的基础上，本发明提供一种检测个体乙肝拉米夫定用药疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探 针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括10X荧光定量PCR反应缓冲液1 Pi，25mM dNTP 混合液 0. 1 u 1,25mM MgC12 溶液 0. 6 ii 1， 5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 u 1,20iiM特异性引物对每条引物各0. 225 iil，10 uM特异性荧光探针对每条探针各0. 25 ill，去离子水 5. 325ii 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总 体积10 u 1，包含浓度为20ng/ yl的DNA模板2 ill、1 ill 10X荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA 聚合 酶、20 y M的有义引物和反义引物各0. 225 iU、10 y M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各 0. 25ii 1，去离子水 5. 325 u 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体乙肝拉米夫定用药疗效的试剂盒，其特征在于包括检测拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液1 μ 1，25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,，20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体乙肝拉米夫定用药疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测拉米夫定用药靶向位点RT基因多态性位点来评估个体乙肝拉米夫定用药疗效。
文档编号G01N21/64GK101928763SQ200910053958
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司