专利名称：用于荧光定量pcr法检测肠道克柔念珠菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种用于荧光定量PCR法检测肠道克柔念珠菌的试剂
i^r 。
背景技术：
在正常人类肠道中存在一个丰富、多样的真菌群落。人们采用传统的分离培养法己经对人 类肠道真菌进行了许多研究(Khatib R， Riederer KM， Ramanathan J， et aL Faecal fungal flora in healthy volunteers肌d inpatients. Mycoses, 2001， 44:151-6.)， 该 方法通过对真菌表型进行诊断，观察固体培养基上的菌落生长和繁殖情况，根据菌落形状、 大小、颜色、粘性以及其他结构特征鉴定真菌，结合不同的生理、生化和耐热性试验等进行 形态学诊断。运用分离培养法可以准确的诊断某些致病性真菌，但是，在某些特殊情况下， 比如分离培养的菌落形态不典型、特殊培养基无法获取、培养时间过长、表型结果非特异等 等，则无法对真菌病原体进行准确诊断，需要依靠非培养诊断技术进行真菌鉴定。
实时荧光定量PCR技术已经广泛应用于微生物的各个领域(Espy MJ， Uhl JR, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol, 2006， Rev 19(1): 165-256.)。该技术不仅能够从本质上增加 病原体检测的灵敏度，结合种特异性引物和扩增产物融解曲线分析可以特异的检测和鉴定某 种病原体，检测过程无需分离培养，操作简便、快速，极大的縮短了诊断时间；并且可以作 为病原体感染患者治疗疗效的监测手段。但是，由于人类肠道微生态群结构复杂，存在大约 IO"个不同的微生物有机体，而真菌所占比例较低，不到1%;某些真菌菌种的生长还需要复 杂的培养条件，分离培养法只能检测到一小部分条件适合的微生物，检测灵敏度低且诊断周 期长。而实时荧光定量PCR技术是基于对病原体核苷酸的检测，不受培养条件限制且检测灵 敏度高，有利于更加准确、全面的了解真菌群落在肠道病理生理过程中的作用。利用实时荧 光定量PCR技术能够准确、快速的检测和鉴定真菌病原体，这对于及时治疗和有效控制肠道 真菌感染都至关重要。发明內容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于荧光定量PCR法检测肠道克柔 念珠菌的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
提供一种用于荧光定量PCR法检测肠道克柔念珠菌的试剂盒，该试剂盒包括-
反应总体积1/10的10XTaqman PCR buffer;
各O. 15 umol/L l umol/L的上游和下游引物；
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0 mmol/L 3. 5廳1/L的MgCl2;
0.05U/U1 HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02XSYBR green I荧光染料；
标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释； 余量为无菌双蒸水；
所述两条引物为PCR扩增过程中使用的特异性扩增克柔念珠菌ITS区的引物，其中 上游引物序列为:5， - AAAAGTCTAGTACGCTCGG-3， (SEQ ID NO: 1); 下游引物序列为5' - GCATCCATGAAGAACGCAGC-3， (SEQ ID NO: 2); 所述标准阳性模版为克柔念珠菌标准菌株DNA经前述引物扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接后获得的标准质粒DNA;编码所述扩增产物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核 苷酸序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果是
操作简便、快速；特异性好，灵敏度高；基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制；定 量检测，能真实反映肠道克柔念珠菌定植和发生感染的情况；可同时进行高通量的样本检 测。本发明提供的试剂盒可对肠道克柔念珠菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离 培养的传统诊断方法，并适于在临床实验室广泛推广应用。
图1为将本发明试剂盒标准阳性模版梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的动力曲 线图，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行于横坐标的直线代表荧光阈 值。图2为将本发明试剂盒标准阳性模版梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的标准曲 线图，横坐标代表荧光阈值，纵坐标代表不同稀释度标准阳性模版的浓度。
图3为具体实施例中所述荧光定量PCR扩增产物的融解曲线图，横坐标代表融解温度， 纵坐标代表相对荧光强度。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。
本发明所述的用于荧光定量PCR法检测肠道克柔念珠菌的试剂盒包括引物、Taqinan PCR buffer、 dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA聚合酶、SYBR green I荧光染料、标准阳性模版和无菌双蒸 水。其中-
(1) 引物是特异性扩增克柔念珠菌ITS区的引物； 上游引物序列为5' - AAMGTCTAGTACGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列为5， - GCATCCATGAAGAACGCAGC-3， (SEQ ID NO: 2)
(2) 标准阳性模版
克柔念珠菌标准菌株DNA经前述引物扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接即为标准 阳性模版；编码所述扩增产物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；扩增产物与 pGEMT-T Easy载体连接后可在大肠杆菌DH5 a中增殖。储存浓度为1(T拷贝/ul，使用前进行 系列稀释。
该试剂盒保存于-2(TC,尽量减少反复冻融。
本发明中所述克柔念珠菌标准菌株购自生物梅里埃公司生产的克柔念珠菌ATCC 6258菌 株，pGEMT-T Easy载体为Promega公司产品，PCR用Buffer、 MgCl2、 d證s、 HOTSTART Taq DNA聚合酶、SYBR greenl荧光染料购自大连宝生物技术公司。
具体实施例1:
本实施例中的试剂盒包括
反应总体积1/10的lOXTaqtnan PCR buffer;
各O. 15 umol/L的上游和下游引物；
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0 ,1/L的MgCl2;
0. 05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶；0. 02XSYBR green I荧光染料；
标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释; 余量为无菌双蒸水。"
具体实施例2: 试剂盒成份如下
反应总体积1/10的10XTaqman PCR buffer;
各1.0 umol/L的上游和下游引物；
各200ymol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 5咖ol/L的MgCl2;
0.05U/wl HOTSTART T叫DNA聚合酶;
0. 02XSYBR green I荧光染料；
标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释; 余量为无菌双蒸水。
具体实施例3:
试剂盒成份如下-
反应总体积1/10的lOXTaqman PCR buffer;
各0. 5 U mol/L的上游和下游引物；
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 0睡1/L的MgCl2;
0. 05U/iil HOTSTART Taq DNA聚合酶;
0. 02XSYBR green I荧光染料；
标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释; 余量为无菌双蒸水。
本发明试剂盒的工作原理介绍
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链 后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信 号的增加与PCR产物的增加完全同步。反应包括以下几个步骤(1) PCR变性过程产生单链 DNA, SYBR荧光染料呈游离状态，荧光信号很低；(2)引物退火过程中，双链DNA部分形成，SY服荧光染料同时特异性地掺入DNA双链，荧光信号增加；(3)PCR延伸过程中，双链 DNA逐渐形成，SYBR荧光染料不断掺入DNA双链中，荧光信号不断增加；(4)最后延伸阶段 结束后，所有DNA形成双链，掺入DNA双链中的荧光染料达到最大值，荧光信号也达到最大 值。
本发明所述试剂盒使用方法举例
(1) 反应体系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的浓度分别 为200ymol/L，上游和下游引物的浓度为0. 5 y mol/L， MgCl2的浓度为3. 0咖ol/L， 0.02XSYBR green I荧光染料，2UH0TSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA2pl，无菌双蒸水补 足体积至40ul。
(2) 反应程序95。C变性5min，随后94。C预变性30s， 6(TC退火30s， 72。C延伸45s， 循环35次，最后72'C延伸5min。
(3) 定量标准曲线制备将标准阳性模版进行连续10倍稀释(如109， 108， 107， 106)，获得系列拷贝数梯度的标准质粒DNA。按照上述反应体系和反应程序，每个浓度重复 三次进行扩增。反应结束后，根据起始模版拷贝数的对数值和C(T)值绘制标准曲线Y=aX + b, R2。
(4) 样品检测取受试者新鲜尾便200mg，按照常规方法提取DNA,取2ul DNA作为模 版，按照上述反应体系和反应程序进行扩增。
(5) 结果计算根据标准曲线和所得的C(T)值计算起始模版拷贝数。
本发明的应用实例介绍
取40例健康志愿者新鲜尾便，采用沙保氏培养基分离培养和本发明所述荧光定量PCR检 测试剂盒同时进行检测。 1.模版DAN的制备
(1) 试剂采用QIAamp DNA stool mini kit结合玻璃珠击打法抽提受试者粪便标本 DNA， QIAamp⑧DNA stool mini kit试剂盒购自北京东胜创新实验技术有限公司，玻璃珠购自 上海生物工程公司。
(2) 粪便标本DNA的提取用电子天平称取受试者新鲜尾便200mg/份，加入ASL缓冲液 和0. 3g玻璃珠，置入Fast Pr印FP120快速核酸提取仪，6. 5 m/sX45 s进行破壁，然后按 照QIAamp DNA stool mini kit说明书进行操作，最后AE洗脱DNA。所有抽提获得的DNA均 置于-8(TC保存备用。2.荧光定量PCR反应
(1) 反应体系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的浓度分别 为200umol/L，上游和下游引物的浓度为0.5 umol/L， MgCl2的浓度为3.0 mmol/L， 0.02XSYBR green I荧光染料，2U HOTSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2ul，无菌双蒸水补 足体积至40ul。
(2) 反应程序95。C变性5min，随后94。C预变性30s, 6(TC退火30s， 72。C延伸45s， 循环35次，最后72'C延伸5min。
(3) 定量标准曲线制备将标准阳性模版进行连续10倍稀释(如109， 108， 107， 106)，获得系列拷贝数梯度的标准质粒DNA。按照上述反应体系和反应程序，每个浓度重复 三次进行扩增。反应结束后，根据起始模版拷贝数的对数值和C(T)值绘制出标准曲线Y二-0. 2867X + 10. 19， R2=0. 994 (图l， 2)。
(4) 样品检测取40例健康志愿者粪便标本DNA作为模版，按照上述反应体系和 反应程序进行荧光定量PCR扩增。在循环结束时通过对PCR产物进行融解温度曲线分析来决 定产物的特异性，即从75'C至95°C，每升温0. 5'C，持续2秒后采集反应管中反应液的荧光 信号。每次荧光定量PCR反应均设置倍比稀释的标准阳性模版构建标准曲线，以此获取样本 中不同菌种基因拷贝数。各种真菌数量以每克粪便基因拷贝数的对数值表示，数据以均数
(5) ±标准差(s)表示。
结果显示，本发明试剂盒检测克柔念珠菌所得标准曲线的相关系数为0.99，最低线性检
测限为102拷贝/111 (图1， 2)。扩增产物的融解温度为9L0'C，而且融解曲线显示扩增反应
特异性较好(图3)。本发明试剂盒的检测阳性率(60.0%)显著高于分离培养法(5.0%) (代O.OOl) ， 40例健康志愿者肠道克柔念珠菌的荧光定量PCR检测结果为6.521±0.318 (1ogw拷贝/g)。实验结果表明，本发明试剂盒与传统分离培养法比较，具有特异性好，灵
敏度高，检测快速等特点。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于
以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出
或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表
SEQ ID NO: 1
aaaagtctag tacgctcgg 19 SEQ ID NO: 2
gcatccatga agaacgcagc 20
SEQ ID NO: 3
a犯agtctag tacgctcggc cagcttcgct
ctttacacgt cgtccgctcc gctcccccaa
tc犯acaggc atgccccccg g肌tgccg已g
ttcacgatgg ctgcaattca cactaggtat
ccctttcagg cgagtcgcag ctccgacgct 60 ctctgcgcac gcgcaagatg gaaacgacgc 120 gggcgcaatg tgcgttcaag aactcgatga薦 cgcatttcgc tgcgttcttc atggatgc 238
权利要求
1、一种用于荧光定量PCR法检测肠道克柔念珠菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括反应总体积1/10的10×Taqman PCR buffer；各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl2；0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；0.02×SYBR green I荧光染料；标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释；余量为无菌双蒸水；所述两条引物为PCR扩增过程中使用的特异性扩增克柔念珠菌ITS区的引物，其中上游引物序列为5’-AAAAGTCTAGTACGCTCGG-3’；下游引物序列为5’-GCATCCATGAAGAACGCAGC-3’；所述标准阳性模版为克柔念珠菌标准菌株DNA经前述引物扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接后获得的标准质粒DNA；编码所述扩增产物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种试剂盒，旨在提供一种用于荧光定量PCR法检测肠道克柔念珠菌的试剂盒。该试剂盒包括标准阳性模版和两条PCR扩增过程中使用的特异性扩增克柔念珠菌ITS区的引物，其中编码扩增产物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本发明操作简便、快速；特异性好，灵敏度高；基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制；定量检测，能真实反映肠道克柔念珠菌定植和发生感染的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对肠道克柔念珠菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统诊断方法，并适于在临床实验室广泛推广应用。
文档编号G01N21/64GK101555523SQ20091009855
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者李兰娟, 郭仁勇, 瑜 陈, 陈珍晶, 鲁海峰 申请人:浙江大学