专利名称：一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法
技术领域：
本发明属于一种医学诊断用的方法，具体的说是一种检测卵巢癌组织中Legumain 蛋白来判断卵巢癌是良性还是恶性以及预后的方法，该方法是通过免疫检测技术实现的， 属于临床免疫诊断方法，特别是运用免疫组化方法检测Legumain蛋白从而判断卵巢癌是 良性还是恶性以及预后的方法。
背景技术：
卵巢癌是威胁妇女健康的重要恶性肿瘤疾病，其早期无典型症状及体征，目前临 床如遇可疑情况都可借助于现代影像学检查和广义的肿瘤标记物检查及早作出诊断。在卵 巢肿瘤中恶性卵巢肿瘤占25%，对其恶性程度的快速诊断可以对治疗产生积极的作用。
Legumain是一丝氨酸蛋白酶，是asparaginyl endop印tidase家族中的成员之 一。它首先被证明在植物的种子芽苞形成中起着重要作用。进一步发现它也存在于寄生虫 和哺乳动物细胞体内。然而近来我们发现Legumain在处于缺氧(Hypoxia)应激状态下极 高的表达于肿瘤组织中，而在相应的正常组织中的表达极低或不表达。进一步我们还发现 在肿瘤组织中，表达Legumain的TAMs在肿瘤新生血管细胞上高度表达，而非在培养的肿瘤 细胞系中表达。而更为重要的是Legumain过度表达与肿瘤细胞的浸润和转移情况高度相 关。通过对120例病例的临床观察研究发现，Legumain表达的高低与肿瘤患者的预后相关， 即表达越高，恶性程度越强，预后越差(见表1)。
表lLegumain在卵巢肿瘤组织中表达情况的分析
组别总例数阴性弱阳性强阳性p值
正常组201190
良性组207130<0.001
交界组202135
恶性组6002337 恶性组VS交界组(x 2 = 12. 212， p < 0. 05);恶性组VS良性肿瘤组(x 2 = 35. 704， p<0.01);恶性组VS正常组(x 2 = 45.500， p < 0.01);交界组VS良性肿瘤组高于良性 肿瘤组(x2 = 7.778， p < 0.05);交界组VS正常组(x 2 = 11. 958， p < 0. 05);良性肿瘤 组VS正常组(x2 = 10616， p > 0. 05)。结果表明Legumain随着卵巢肿瘤转向恶性，表达 量明显增强。
发明内容
针对上述情况，本发明通过免疫组化的方法检测病理组织中的Legumain分子， 以此判断卵巢癌的预后。具体的讲就是，通过对病理组织的免疫组化反应，检测该组织中 Legumain分子的表达数量，根据免疫组化反应的结果来判断卵巢癌的预后。
3
其技术内容包括免疫组化反应和显微镜观察等步骤。 本发明是通过以下技术方案实现的 1.脱蜡和水化 具体步骤如下 ①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟， ②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟， ③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟， ④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟， ⑤组织切片置于95%乙醇中浸泡10分钟， ⑥组织切片置于80%乙醇中浸泡10分钟， ⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟， ⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。 2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通过微波炉，加热10分钟，放入
组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。 3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。 4.将3%双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。 5.用超纯水洗2次，各五分钟 6.滴加封闭液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液 体。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室温静置1小时。 8. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室温静置0. 5小时。 10. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室温静置0. 5小时。 12. TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。 13. DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色， 后用自来水冲洗io分钟。 14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。 15脱水、透明 具体步骤如下 ①组织切片置于80%乙醇中浸泡30秒， ②95%乙醇中浸泡3分钟， ③无水乙醇中11浸泡5分钟， ④无水乙醇I浸泡5分钟， ⑤二甲苯11中浸泡5分钟， 二甲苯I浸泡5分钟， 16.树脂封片、镜检。
图1在恶性肿瘤检测结果中Leg咖ain主要在肿瘤间质细胞中的高表达。 图2在良性肿瘤检测结果中Legumain主要在肿瘤间质细胞中的低表达。
具体实施例方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。 实施例1 样本某妇女卵巢肿瘤的组织切片。 1.脱蜡和水化 具体步骤如下 ①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟， ②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟， ③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟， ④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟， ⑤组织切片置于95%乙醇中浸泡10分钟， ⑥组织切片置于80%乙醇中浸泡10分钟， ⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟， ⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。 2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通过微波炉，加热10分钟，放入
组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。 3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。 4.将3%双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。 5.用超纯水洗2次，各五分钟 6.滴加封闭液(正常山羊血清，5% BSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室温静置1小时。 8. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室温静置0. 5小时。 10. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室温静置0. 5小时。 12. TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。 13. DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色， 后用自来水冲洗io分钟。 14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。 15脱水、透明 具体步骤如下 ①组织切片置于80%乙醇中浸泡30秒， ②95%乙醇中浸泡3分钟， ③无水乙醇中11浸泡5分钟， 无水乙醇I浸泡5分钟，
⑤二甲苯11中浸泡5分钟， ⑥二甲苯I浸泡5分钟， 16.树脂封片、镜检。 镜检结果如图l所示。 可见该组织切片中Leg咖ain的表达程度较高，有明显棕黄色颗粒，为Leg咖ain检
测阳性结果，后经病理检测结果为恶性肿瘤。 实施例2 样本某妇女恶性卵巢肿瘤的组织切片。 1.脱蜡和水化 具体步骤如下 ①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟， ②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟， ③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟， ④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟， ⑤组织切片置于95%乙醇中浸泡10分钟， ⑥组织切片置于80%乙醇中浸泡10分钟， ⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟， ⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。 2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通过微波炉，加热10分钟，放入
组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。 3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。 4.将3%双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。 5.用超纯水洗2次，各五分钟 6.滴加封闭液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液 体。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室温静置1小时。 8. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室温静置0. 5小时。 10. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室温静置0. 5小时。 12. TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。 13. DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色， 后用自来水冲洗io分钟。 14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。 15脱水、透明 具体步骤如下 ①组织切片置于80%乙醇中浸泡30秒， @95%乙醇中浸泡3分钟， ③无水乙醇中11浸泡5分钟，
6
无水乙醇I浸泡5分钟， ⑤二甲苯I1中浸泡5分钟， ⑥二甲苯I浸泡5分钟， 16.树脂封片、镜检。 镜检结果如图2所示。 可见该组织切片中Leg咖ain的表达程度较低，无明显棕黄色颗粒，为Leg咖ain检 测阴性结果，后经病理检测结果为良性肿瘤。
权利要求
一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法，其特征在于，一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法所检测的目标蛋白是Legumain蛋白分子。
2. 根据权利要求1所述的一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法，其特征在于，使用免疫组化的方法检测卵巢肿瘤组织中Legumain蛋白分子的方法，其具体技术方法如下1. 脱蜡和水化，具体步骤如下① 组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟，② 组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟，③ 组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟，④ 组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟，⑤ 组织切片置于95%乙醇中浸泡10分钟，⑥ 组织切片置于80%乙醇中浸泡10分钟，⑦ 组织切片置于自来水中浸泡1分钟，⑧ 组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。`2. 抗原修复，将10mM的Citrate Buffer (pH 6.0)通过微波炉，加热10分钟，放入组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。
3. 用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。
4. 将3%双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置IO分钟，甩去多余液体。
5. 用超纯水洗2次，各五分钟
6. 滴加封闭液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。
7. 滴加一抗(1 : 100)50iiL，室温静置1小时。
8. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
9. 滴加二抗(1 : 100)50iiL，室温静置0. 5小时。
10. TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
11. 滴加三抗(1 : 100)50iiL，室温静置0. 5小时。
12. TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。
13. DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗IO分钟。
14. 苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。
15.脱水、透明，具体步骤如下①组织切片置于80%乙醇中浸泡30秒，@95%乙醇中浸泡3分钟，③无水乙醇中II浸泡5分钟， 无水乙醇I浸泡5分钟，⑤ 二甲苯II中浸泡5分钟，⑥ 二甲苯I浸泡5分钟，
16.树脂封片、镜检。
全文摘要
本发明公开了一种医学诊断用的方法，具体地说是一种检测卵巢癌组织中Legumain蛋白来判断卵巢癌预后的方法，该方法是通过免疫检测技术实现的，属于临床免疫诊断方法，特别是运用免疫组化方法检测Legumain蛋白从而判断卵巢癌预后的方法。具体的技术方案是通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的Legumain蛋白含量，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应的产物，从而能够在细胞或组织原位确定Legumain蛋白的含量。并且以此进一步判断卵巢癌预后的免疫检测方法。本发明所载明的方法对卵巢癌的临床诊断具有实际意义。
文档编号G01N21/84GK101726602SQ20091022910
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者刘寅, 刘艳华, 向荣, 吕丹, 张舒, 李娜, 李雪菲, 王丽娜, 贾现培, 马雪明 申请人:南开大学