专利名称：测定尿液特殊蛋白芯片及试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定尿液特殊蛋白的一种蛋白芯片和配套试剂。更具体的体现在本发 明设计了调整尿液环境试剂，增加尿液特殊蛋白测定结果的稳定和特异性的配套试剂，同 时改进芯片板结构，在芯片底板框架上增加一种尼龙薄膜。
背景技术：
肾小球和肾小管损害时尿液中蛋白含量增加，并且增加的程度与肾脏损害程度相 关。测定尿蛋白的方法和试剂在临床诊断中被广泛应用。因此尿液蛋白测定方法备受关 注。尿液蛋白定量的方法比较多，有黄硫酸法、丽春红显色发以及免疫法等定量方法，而这 些方法只能够测定尿蛋白的总量，不能够同时分别测定尿液中不同类型蛋白。由于人尿 液中存在100多种蛋白，能够同时测定不同类型蛋白对于肾脏疾病的诊断具有临床意义。 芯片技术为同时测定不同类型蛋白奠定了技术基础。2002年7月17日公开，授予楼屹的 《快速检测肾脏损害的尿蛋白芯片》专利号CN1359004A，公布了一种快速检测肾脏损害的 尿蛋白芯片的测定方法，它由载体盒面板、载体盒背板和蛋白质试纸条组成，所述的面板下 端为进样口、中部为观察口以及进样口和观察口之间的控样线，所述载体盒背板内有扇形 排列的四个载体槽，载体槽内分别放置检测白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TF)、视黄醇结合蛋白 (RBP)和尿NAG的尿蛋白试纸条，利用芯片技术集成化、高通量、并行的原理，将这些蛋白试 纸条以平行或扇形方式任意组合，集成在一起，形成尿蛋白芯片，他能够一次性同时检测尿 液中这四种蛋白。由于判定结果敏感度有限，本法测定结果只能够达到半定量。在2004年 12月15日公开的授予赵建龙等实用新型《毛细管电泳芯片分离检测蛋白的方法》，专利号 1554947A，本专利公开了一种毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，其特征在于通过微 加工工艺制作石英介质，并在加样池中加入样品，最后将加样的毛细管电泳芯片置于光学 检测平台上，各池中插入相应电极，施加适当时序和幅值的电压进行分离检测。它只是公开 了一种分离尿液蛋白的方法，与常规分离尿蛋白分离技术相比，具有所用样品盒试剂少、检 测块、成本低的优点特点，但不具备对于蛋白进行定量的作用。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服了在利用芯片技术测定尿液蛋白过程中由于尿液 中成分复杂和反应环境对结果的影响，即使同一患者患者，由于饮食以及患者治疗药物的 影响，使尿液中所含生物化学成分发生改变，造成尿液蛋白测定结果不准确以及设立了四 种用于诊断肾损害的特殊蛋白系列组合，即防止过度检测增加患者负担过少检测造成漏诊 现象发生，又提高了肾脏损害的诊断率。本发明提出解决上述技术问题采用的技术方案是本发明的配套试剂具有调节尿 液PH环境的作用，有利于尿液中的蛋白与固定于芯片上的抗体进行反应达到理想环境。另 外在芯片框架上有一层尼龙薄膜，膜与芯片底板之间有3mm高度的空间，能够防止尿液中 细胞、真菌等大分子成分对芯片测定结果的影响。
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芯片配套试剂为IM Tris-Hcl试剂pH为7. 4，在尿蛋白芯片测定时加入比例为，试 剂体积尿液体积=1 200。由于人肌体代谢复杂，尿液排除的成分随着饮食以及患者治 疗过程中所用药物不同，导致尿液中所含生物化学成分发生改变，造成尿液蛋白测定结果 不准确。加入芯片测定配套试剂能够改变实验环境，稳定测定结果。正常人尿液中存有蛋白，一般对小时尿液蛋白在150mg以下。分析其中蛋白类型 达到100余种。肾病诊断和肾脏损害需要测定总量和其中蛋白类型，但是测定蛋白所有类 型又造成资源的浪费和增加患者负担。本芯片设立了四种抗体标记与芯片上，用于测定尿 液中的相应蛋白含量和比例。其四种抗体为转甲状腺素蛋白(transthyretin)抗体、抗人 血清β 2-球蛋白(i3 2-miCr0gl0bulin)抗体、抗人血清白蛋白(albumin)抗体和抗-免疫 球蛋白 G(immunoglobulin G)抗体。芯片部分包括芯片框架、尼龙薄和芯片底板。芯片框架为塑料材料制成框架结构； 薄膜为尼龙薄膜，能够阻止细胞、霉菌、尿滴虫等细胞成分透过；芯片底板为玻璃、纤维素 膜、石英玻片。在底板上附框架，材料为塑料成分，框架O)高度为5mm，附着框架高度为 3mm。上述的两框架的厚度不同，但是两框架( 和框架内部小的正方形或圆形窗口形 状和大小完全相同。在两框架( 和框架(4)之间，利用粘合剂将一层尼龙薄膜粘合在上述两框架之 间。在芯片底板上标记抗体为抗人-血清转甲状腺素蛋白(transthyretin)抗体、 抗人血清-β 2-球蛋白(0 2-microglobulin)抗体、抗人-血清白蛋白(albumin)抗体、 抗-免疫球蛋白G(immunoglobulin G)抗体。芯片上设立了四种用于诊断肾损害的敏感的 蛋白系列组合，防止过度检测增加患者负担过少检测造成漏诊现象发生。本法测定上述四种尿液特殊蛋白的方法，其敏感度可以测定ng/ml以上，能够准 确进行定量。同时能够计算四种蛋白与之间的比例。整个测定过程在1.5小时内完成，比 ELISA法、化学发光法测定时间明显缩短。
本说明书包括三幅附1为本发明的主视2芯片结构透视示意3为图2中芯片底板(5)版面的俯视图
具体实施例方式下面以具体实施例进一步解释发明，但不限制本发明范围由图1-3所示，本发明 提供的一种蛋白芯片和配套试剂。芯片部分包括芯片底板(5)、芯片框架(2、4)和滤膜(3)三部分。其中所述蛋白芯 片的框架为塑料框架0、4)，所述的窗口形状为方形、圆形形，实用空的数量为36个，每个 孔德分隔板在上框架( 和框架(4)之间夹有一层尼龙膜，并且框架(4)紧贴于底板(5) 之上，防止尿液中细胞成分、真菌等直接与芯片底板接触，影响样品中蛋白的测定结果。
本发明提供的一种蛋白芯片底板与上方的框架紧密黏贴。具有36个标志性蛋白 点阵的硝酸纤维素膜(5)，在底板的两个边分别标记(1-6)数字和(A-F)字母坐标标记，利 于根据坐标确定测定标本的编号，能够同时测定36个标本。实例2009年5月27日授予穆海东的名称为《一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的 制备》公告号CN201247M6Y。2006年10月4日授予李泽松等的名称为《肝纤维化相关血 清标志物检测蛋白芯片》公开号CN1841068A。详细的披露了一些抗原测定蛋白芯片的制 备过程。其步骤主要是(1)准备硝基纤维素膜；( 设计芯片，确定点阵排列方式和点样位 置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝基纤维素膜上；(4)装配硝基纤维素膜，并且 进行封闭、干燥、包装、保存。具体制备步骤肿瘤标志物检测抗原的确定1检测指标抗原的确定肿瘤标志物CEA是由六段相似很高的肽段组合而成，选择其中A1+B1段基因工程 表达；PSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-1均为长基因表达，FAP和CA19-9为肿瘤细胞分泌抗原。 制备单克隆抗体。2点样制备具检测指标涂层的膜芯片用Gesim点样仪喷点，点样整从384孔板吸 出抗体喷点于纤维素膜上，点阵形式为10 矩形阵列，当点直径为0. Imm,点横向间距为 0. 6mm，抗体阵列的大小为6mmXmm ；点样后贴膜，封闭，最后将芯片干燥、包装后于4°C保存。
权利要求
1. 一种能够检测尿液中特殊蛋白含量和比例的蛋白芯片和配套试剂，配套试剂(1)为 浓度为IM的TriS-Hcl的混合物，pH为7. 4，测定时加配套试剂与尿液的体积为1 100 ； 芯片部分包括芯片底板(5)、芯片框架⑵和芯片框架⑷以及薄膜(3)组成。所述的芯 片框架O)高度为5mm和框架的高度为3mm，这样使两框架的高度不同，但是上述两框 架的窗口大小相同，窗口的形状为正方形或圆形，用于芯片读数仪读取底板上的数据。在框 架(2)与框架(4)的观察口之间有尼龙膜(3)。框架( 端的观察口测为样品加入口，框架 (4)与底板的粘合口微测定蛋白读数口。所述的载体槽中底板至少标记有能够检测尿转甲 状腺素蛋白、白蛋白、β 2-球蛋白和免疫球蛋白G四种蛋白的特异性抗体。
权利要求
1.所述测定尿液特殊蛋白芯片，其特征在于配套试剂和芯片框架之间的尼龙薄膜和底 板上标记的蛋白特异性抗体组合。
2.根据权利要求(1)所述的尿蛋白检测芯片，其特征在于所述的芯片框架O)、框架 ⑷的载体窗口为正方形或圆形排列的六个以上(含六个)的单槽。
全文摘要
本发明公布了一种适合测定尿液特殊蛋白芯片和配套试剂。该配套试剂为一种化学混合溶液含有Tris，浓度为1摩尔和Hcl，最终pH值为7.4；芯片包括芯片底板、芯片框架和尼龙薄膜三部分。尼龙薄膜夹在两框架的中间，紧贴底板的框架厚度为3mm，尼龙膜上面的框架厚度为5mm。下层框架紧密粘附于底板上，框架中间的窗口大小相等，窗口为方形或圆形。芯片底板为上固定了抗-转甲状腺素蛋白抗体、抗β2-球蛋白抗体、抗-白蛋白抗体和抗-免疫球蛋白G抗体等四项抗体组合。主权项目1.所述测定尿液特殊蛋白芯片，其特征在于配套试剂和芯片框架之间的尼龙薄膜和底板上标记的尿液蛋白特异性抗体组合。2.根据权利要求(1)所述的尿蛋白检测芯片，其特征在于所述的芯片框架(2)、框架(4)的载体槽窗口为正方形或圆形排列的六个 以上(含六个)的单槽。
文档编号G01N33/68GK102095870SQ20091022910
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者孙续国 申请人:孙朝, 孙续国, 赵鹏