专利名称：犬细小病毒的lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生化检测技术领域的试剂盒及其检测方法，具体是一种犬细小病 毒的LAMP(环介导等温扩增)检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科，细小病毒属，猫细小病 毒亚群(Parvovirinae)。CPV对于犬及犬科动物来说都是一个重要的病原，它能引起急性 肠炎，白细胞减少，剧烈的呕吐，以及幼犬的心肌炎等病症。该病一年四季皆可发生，以发 病急，病程短，传染性强，死亡率高，常呈爆发性流行。不同年龄、性别、品种的犬均可感染， 其非经治疗的成活率< 5%，是危害我国犬业最为严重的传染病之一。目前的检测方法一 般是先现场采样，然后再送实验室检验，存在流程长，耗时多、成本高等弊端，既影响检测 速度，更不利于疫病的及时控制与监测。T. Notomi等于2000年开发了一种新颖的恒温核 酸扩增方法，即环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification LAMP), 其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等温条件(65°C )保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应不需要模板的热变 性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法，具有 简单、快速、特异性强的特点。经对现有技术的文献检索发现，Desario，C等在《Journal of Virological Methods))(病毒方法学)2005年，第126期，179 185页发表了题为《Canine parvovirusinfection :which diagnostic test for virus ？》(检测犬细小病毒的方法有 哪些)一文，文中评述，犬细小病毒的检测方法主要有聚合酶链反应(PCR)、病毒分离(VI)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)等；但是这些技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和 操作过程繁琐的缺点，因此不适于现场快速检验，同时由于检测成本高，也加大了推广应用 难度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种犬细小病毒的LAMP检测试剂 盒及其检测方法。本发明的试剂盒使用简单，结果鉴定方便直观，检测特异性高，敏感性高， 且易于大范围推广应用。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，该试剂盒包含如下6条引物，所 述引物的碱基序列分别如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 所示。所述试剂盒包括反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体为每22uL反应液 A 的组分及含量为10 X Thermopol buffer 2. 5uL,2. 5mM dNTP mix 8uL，5M betaine 5uL, IMMgSO4 0. 2uL，8U/uL BstDNA 酶 luL，超纯水 2. 7uL,以及如下的引物
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50uM碱基序列如SEQ ID NO 1所示的引物0. IuL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 2所示的引物0. IuL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 3所示的引物0. 8uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 4所示的引物0. 8uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 5所示的引物0. 4uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 6所示的引物0. 4uL。所述SYBR Green I 为 1000XSYBR Green I。本发明还涉及一种利用所述犬细小病毒的LAMP检测试剂盒的检测方法，包括如 下步骤步骤一，按照常规方法提取待测样品的核酸；步骤二，利用所述LAMP检测试剂盒检测样品核酸，判断样品中是否含有犬细小病步骤二中，所述判断具体为观察最后得到的反应液的颜色，如颜色为绿色，则样 品中含有犬细小病毒，如果反应液的颜色为桔黄色，则样品中不含犬细小病毒。步骤二中，所示检测过程中，LAMP扩增的反应条件为63°C恒温60min。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明的试剂盒使用简单，结果鉴定方便直观；检测特异性高，敏感性高，最低可检测到10个拷贝，是普通 PCR灵敏度的100倍；本发明的试剂盒使得检测不需先进的仪器，一步就可完成实验操作， 减少了污染的机会，能较好的满足目前对犬细小病毒现场的检验的需要，用于进出口检疫， 畜牧饲养场等的现场检验，且易于大范围推广应用。
图1为实施例1中利用试剂盒检测的结果图；图2为实施例3中验证试剂盒体系特异性的凝胶电泳结果图；图3为实施例3中对试剂盒体系中扩增的终产物进行扩增特异性确认的凝胶电泳 结果图；图中，终产物经限制性内切酶Sau3A I消化以确认试剂盒体系的特异性，消化后得 到预期大小117bp和124bp的片段，证明了扩增的特异；图4为实施例2中试剂盒检测和普通PCR检测的敏感性的对比图；图5为实施例1中不同Mg2+浓度下试剂盒扩增效率的凝胶电泳结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1犬细小病毒的LAMP检测步骤一，LAMP弓丨物的设计(1)从基因数据库中检索获得犬细小病毒的基因组序列，通过DNAstar软件进行序列比对，得到犬细小病毒基因组的特异性保守序列SEQ ID NO 7；(2)通过 LAMP 引物设计软件(Primer Explorer software, version 4.0)对该保 守序列进行LAMP引物设计，得到6条引物primer F3 的序列如 SEQ ID NO 1 所示；primer B3 的序列如 SEQ ID NO 2 所示；primer FIP 的序列如 SEQ ID NO 3 所示；primer BIP 的序列如 SEQ ID NO 4 所示；primer LF 的序列如 SEQ ID NO 5 所示；primer LB 的序列如 SEQ ID NO 6 所示；步骤二，LAMP反应体系的优化LAMP反应体系的优化通过Mg2+浓度、反应温度和反应时间三个参数的变化来确定 最优反应体系；首先反应温度设为62°C，反应时间设为60分钟，设置不同浓度的Mg2+(0、2、 4、6、8、10、12、14mM)，反应结束进行凝胶电泳观察，结果见图5，由图5可以确定最佳Mg2+ 浓度为8mM，如此类推可以确定最佳反应温度和最佳反应时间分别为63°C和60min ；最终确 定的最佳反应体系如下内引物FIP和BIP 1.6uM，外引物F3和B3 0. 2uM，环引物LF和LF 0. 8uM,0. 8mM dNTP mix, IM betaine,8mM MgS04，8U BstDNA酶，1 XThermopol buffer超纯 水2. 7uL，模板DNA 3uL。最佳反应条件63°C恒温60min。 步骤三，LAMP检测程序(1)配置22uL反应液A :22uL反应液A的组分及含量为IOXThermopol buffer (美国 NEB 公司)2. 5uL，50uM primer FIP 0. 8uL,50uM primer BIP 0. 8uL,50uM primer F3 0. IuL,50uM primer B3 0. IuL,50uM primer LF 0. 4uL,50uM primer LF 0. 4uL,2. 5mM dNTP mix 8uL,5M betaine (美国 Sigma 公司)5uL，IM MgS04 0. 2uL,8U/uL BstDNA 酶(美国 NEB 公司)luL，超纯水2. 7uL。(2)用 Trizol 商品化RNA提取试剂盒(美国 Invitrogen 公司，Cat. No. 15596-026) 提取待检样品(疑似犬细小病毒感染犬的粪样)中的核酸；取3uL提取的核酸加入22uL反 应液A中，使终反应体积为25uL，混勻反应液，短暂离心；(3)将步骤⑵配置的反应液置于63°C恒温60min进行LAMP扩增；(4)取出上述扩增反应管，在其中加入IuL 1000X荧光染料SYBR Green I (美国 Invitrogen公司)，如反应管中液体颜色变为绿色，则说明样品中含有犬细小病毒，如果颜 色为桔黄色，则说明样品中不含犬细小病毒。如图1所示，图1犬细小病毒的LAMP检测体 系最终反应液中加入反应液B后颜色变化，阳性反应颜色变为绿色(管1 7)；阴性反应 颜色变为桔黄色(管8)。
实施例2LAMP检测体系敏感性分析用分光光度仪测从犬粪便中提取的细小病毒核酸的0D260nm值，将数值带入公 式计算其浓度。然后将其做10倍梯度稀释，稀释后的各浓度为5. 7X IO7Copies/UL, 5. 7 X IO6Copies/ μ L......5. 7 X IO0Copies/ μ L,将其作为模板进行LAMP方法和普通PCR方法检测，比较两种方法的灵敏度。LAMP方法的反应体系为 实施例1中的最佳反应体系以及最佳反应时间和温度。普通PCR方法反应体系为2 X PCR TaqMix (天根生化科技(北京)有限公司)25 μ L、弓丨物 l(50ymol/L)0· 5μ L所述引物1 为5，TCTGCTACTCAGCCACCAA 3，(SEQ ID NO 8)弓丨物 2(50ymol/L)0· 5μ L所述引物2 为5，ACCTCCTTCAGCTTGAGGCAA 3，(SEQ ID NO 9)DNA 模板 4 μ L、无菌双蒸水20 μ L，总体积为50yL;反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，53°C退火40s，72°C延伸2min，34个 循环，72 °C延伸IOmin。PCR结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示LAMP检测方法的灵敏度可达到检测57个拷贝的犬细小病毒核酸，该方 法比普通PCR方法灵敏度高100倍，见图4，图4犬细小病毒的LAMP检验反应体系和普通 PCR 的敏感性，M 为 DNA Marker ；其中 1 8 分别为 5. 7 X IO7Copies/μ L、5. 7 X IO6Copies/ μ L......5. 7Χ IO0Copies/μ L。实施例3LAMP检测体系特异性分析为验证该LAMP检测体系的特异性，用Trizol商品化RNA提取试剂盒提取可能有 潜在交叉反应的病毒的核酸，分别以犬细小病毒、犬瘟热病毒、猪细小病毒和人细小病毒 B19的核酸为模板进行LAMP特异性检测，反应体系为25uL体系含有10 X Thermopol buffer (美国NEB公司)2. 5uL, 50uMprimer FIP 0. 8uL,50uM primer BIP 0. 8uL,50uM primer F30. IuL,50uM primer B30. 1uL,50uM primer LF 0. 4uL,50uM primer LF 0. 4uL,2. 5mM dNTP mix 8uL, 5Mbetaine (美国 Sigma 公司)5uL, IM MgS040. 2uL，8U/uL BstDNA 酶(美国 NEB 公司)IuL, 超纯水2. 7uL ；模板DNA 3uL ；反应条件63°C恒温60min。结果显示该LAMP检测体系特异性良好，不能检测到其它非目标病毒核酸。如图2 所示，图2犬细小病毒的LAMP特异性，1 4分别为犬细小病毒DNA，犬瘟热病毒CDNA，猪细 小病毒 DNA，人细小病毒 B19DNA ；M 为 DNA Marker DL2000。此外，对LAMP检测体系的终产物进行扩增特异性确认，用限制性内切酶Sau3A I 酶切LAMP检测体系的终产物，得到预期大小117bp和124bp的片段，说明扩增特异，见图3， 图3终产物经限制性内切酶Sau3A I消化确认反应的特异性，消化后得到预期大小117bp和124bp的片段，说明扩增特异。M为DNA Marker DL2000 ；1为LAMP扩增产物呈典型的梯 形图；2为扩增产物经内切酶Sau3A I消化后。序列表<110>上海交通大学<120>犬细小病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法<160>9<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gctgaggttg gttatagtgc20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2tcctgtatct tgatgtgcta t21<210>3<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgcttgatt ttcatctgtt tgcgcttttg aggcgtctac aca43<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>4tggtgatcca agatatgcat ttggatctct caggtgtttc tcc43<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5ctgcaatagg tgttttaaat ggcc24<210>6<211>25
<212>DNA<213>人工序列<400>6tagacaacat ggtcagaaaa ctacc<210>7<211>222<212>DNA<213>犬细小病毒<400>7gctgaggttg gttatagtgc accatattataaaacaccta ttgcagcagg acgggggggaggtgatccaa gatatgcatt tggtagacaaacacctgaga gatttacata tatagcacat<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8tctgctactc agccaccaa19<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>9acctccttca gcttgaggca a21
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权利要求
一种犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下6条引物，所述引物的碱基序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示。
2.根据权利要求1所述的犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征是，试剂盒包括 反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体为每22uL反应液A的组分及含量为 IOXThermopol buffer 2. 5uL,2. 5mM dNTP mix 8uL，5M betaine 5uL, IM MgS040. 2uL,8U/ uL BstDNA酶luL，超纯水2. 7uL，以及如下的引物50uM碱基序列如SEQ ID NO 1所示的引物0. IuL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 2所示的引物0. IuL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 3所示的引物0. 8uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 4所示的引物0. 8uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 5所示的引物0. 4uL ；50uM碱基序列如SEQ ID NO 6所示的引物0. 4uL。
3.根据权利要求2所述的犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述SYBRGreen I 为 1000XSYBR Green I。
4.一种利用根据权利要求1所述的犬细小病毒的LAMP检测试剂盒的检测方法，其特征 在于，包括如下步骤步骤一，按照常规方法提取待测样品的核酸；步骤二，利用所述LAMP检测试剂盒检测样品核酸，判断样品中是否含有犬细小病毒。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，步骤二中，所述判断具体为观察最后 得到的反应液的颜色，如颜色为绿色，则样品中含有犬细小病毒，如果颜色为桔黄色，则样 品中不含犬细小病毒。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，步骤二中，所示检测过程中，LAMP扩增 的反应条件为63°C恒温60min。
全文摘要
一种卫生检验技术领域的犬细小病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法；该试剂盒包含如下6条引物，所述引物的碱基序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示；利用所述试剂盒进行检测的方法包括如下步骤步骤一，按照常规方法提取待测样品的核酸；步骤二，利用所述LAMP检测试剂盒检测样品核酸，判断样品中是否含有犬细小病毒。本发明的试剂盒使用简单，结果直观，特异性及敏感性高。
文档编号G01N21/78GK101899532SQ20091031168
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者华修国, 单同领, 商晓桂, 崔立, 郭伟 申请人:上海交通大学