用于结合测定的多孔性固相和使用所述多孔性固相的结合测定法的制作方法

专利名称：用于结合测定的多孔性固相和使用所述多孔性固相的结合测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的用于结合测定的多孔性固相，其防止与结合测定法相关的测试 样品的流动行进不良，灵敏度差和测量波形中的扰动的问题，在所述结合测定法中多孔性 固相(例如，膜)用于检测测试样品组分。本发明还涉及使用所述多孔性固相的结合测定 法。更具体地，本发明提供了一种用于结合测定的多孔性固相(结合测定用多孔性固相)， 在所述多孔性固相中在加入测试样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种 表面活性剂选自由下列各项组成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由通式(I)显示的化合 物，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C) 类固醇表面活性剂，以及使用所述结合测定用多孔性固相的结合测定法。
背景技术：
当进行使用多孔性固相(例如，膜)检测测试样品组分的结合测定(例如，免疫色 谱法)时，可能由于各种原因发生多孔性固相中测试样品的流动行进(flow progression) 不良。例如，当测试样品含有大于多孔性固相的孔隙的物质(例如，血细胞)并且因此不能 容易地通过多孔性固相的孔隙移动和/或经过时，或当已经溶解在测试样品中的组分在测 定期间变得不可溶并且堵塞所述多孔性固相时，可能发生测试样品的流动行进不良。分析 物、游离的标记抗体，和分析物与标记抗体的复合物，以及包含在测试样品中并且可能与检 测试剂的标志物质具有类似活性的其他物质(例如，氧化酶)，在正常情况下它们预期均能 全部自由地通过多孔性固相移动/经过，而在这些情况下，它们可能停止通过所述多孔性 固相移动/经过并且可能停留在多孔性固相中不合乎需要的位置中。结果，可能丢失正常 情况下与分析物的存在相关的预期信号强度，使得检测变得困难(使得不可能进行测定或 导致假阴性结果)，或可能发生干扰信号检测的非特异性反应(使得不可能进行测定或导 致假阳性结果)，使得测试的可靠性或再现性可能下降。常规地，已经通过在将测试样品施加到多孔性固相之前，通过在特定条件下离心 或过滤或经由沉淀、吸附或类似方法去除包含在测试样品中的杂质(例如，比多孔性固相 的孔隙大的物质(例如，血细胞)或容易变得不溶的组分)来防止多孔性固相的堵塞。然 而，上述操作的每一种均是耗时的，并且在操作期间测试样品的损失是不可避免的。而且， 这些操作需要额外的成本。如果测试样品含有感染性病原微生物，进行测试的人(例如，医 生或研究人员)可能遭受感染的高风险。包括将表面活性剂加入至温育媒介中的方法(例如，专利文件1)已经被广泛地用 于防止结合测定期间的非特异性干扰。然而，取决于加入的表面活性剂的类型，与固相载体 结合的俘获试剂(例如，抗体)可能从载体上被去除，或固相载体和抗体之间的结合反应可 能首先被妨碍，使得特异性信号可能大幅减少并且可能不能达到所需的检测灵敏度。此外， 当上述方法应用于利用多孔性固相的结合测定中时，即使表面活性剂(例如，专利文件1中 公开的葡糖苷表面活性剂)不影响检测灵敏度本身，但测定系统中测试样品组分的绝对量可能由于测试样品的稀释而减少，使得可能不能有效地确保所需的检测灵敏度。此外，专利 文件1仅针对防止非特异性干扰。在专利文件1中，没有提到而且也没有提示测试样品的 流动行进不良，并且因此没有将其作为待解决的课题而认识到。在其中全血用作测试样品的免疫测定中，如果血细胞分离垫设置在结合测定条 (strip)上的全血负载区域和多孔性固相(膜)之间，则采用离心对测试样品的预处理可以 被省略。根据此方法，血细胞组分保留在分离垫中，并且防止其在短时期内流入至多孔性固 相中，同时允许血浆组分在血细胞组分之前流入至免疫色谱膜中；因此，该测定不受血细胞 组分的存在的影响。然而，即使在这种情况下，由于除由杂质的尺寸所导致的堵塞以外的原因仍然可 能发生样品流动行进(移动或经过)不良。这些其他的原因的实例包括测试样品的高粘度， 和测定期间多孔性固相的干燥。高粘度测试样品(例如，含有大量固体组分诸如血细胞或 大量蛋白的测试样品，或由于蒸发导致失水的测试样品)固有地具有差的流动性并且因此 花费长时间在多孔性固相中行进，导致不均一的行进并缺少测定再现性。常规地，当含有固体组分或具有高粘度的测试样品(例如，血液(全血)、血浆、血 清、唾液、痰或粪便)通过免疫色谱法测定时，必需预先用适当的稀释液(温育媒介)稀释 测试样品。磷酸盐缓冲盐水(PBS)或类似物用作稀释液，并且牛血清白蛋白(BSA)或类似 物通常加入至稀释液中以便改善测试样品的可分散性。然而，市售的BSA可能含有杂质诸 如免疫球蛋白，所述免疫球蛋白可能导致非特异性反应。上面已经提到了与稀释液中包含 表面活性剂相关的问题。上面还提到了这样的事实通过改变稀释液的成分来解决所述问 题的任何尝试仍将遭遇最根本的问题，即，由稀释导致的测定中可用的分析物的量或浓度 的减小。已有报道(专利文件2、，当用于色谱测定的多孔膜被层压以增加其机械强度并且 用于防止在色谱测定期间流体的蒸发(干燥)时，该多孔膜可以由于层压中使用的胶粘剂 组分的作用而变得不太亲水，导致测试样品的流动行进不良。专利文件2通过基于胶粘剂 组分的备选选择以及在层压之前用烷基磺酸表面活性剂处理膜来提高所述膜的亲水性，解 决了此流动行进不良问题。然而，专利文件2没有认识到，或没有提出关于与含有固体组分 或具有高粘度的测试样品相关的流动行进不良的问题的解决方案。作为使用多孔膜作为固相载体的酶免疫测定中的组分，专利文件3公开了一种用 于酶免疫测定固相的洗涤溶液，其含有烷基葡糖苷表面活性剂或类固醇表面活性剂。专利 文件3中公开的洗涤溶液用于洗掉来自测试样品的可能导致非特异性反应的物质，或游离 的标志物质的目的，它们在所述测试样品或所述标志物质(能够免疫结合测试样品中的分 析物)加入至固相载体后均不能经过/移动通过所述多孔膜并且因此残留在膜上。专利文 件3中公开的洗涤溶液与测试样品分开地并在免疫反应之后加入至固相载体中，用于去除 多孔膜上残留的所述物质。因此，其需要独立于测试样品的单独的制备步骤和单独的添加 步骤，使得测定步骤较为复杂。专利文件3的方法是在以下面的情况为前提设想的一些 物质仍然残留在膜上并且需要被洗掉，并且因此其根本不存在对首先防止膜堵塞的任何考 虑。因此测试样品的流动行进不良不能被专利文件3中公开的方法改善，其是本发明所解 决的问题。流通测定法，诸如专利文件3中的实施例中所述的流通测定法，可以包括洗涤步骤。然而，当一次测试许多测试样品时，这种测定法可能需要辅助手段诸如加压和抽吸(例 如，增加膜下方吸水垫的体积)以便在实用的时间范围内获得可再现的结果，这使得就便 利性和成本而言该测定系统不太有利。已经公开了涉及使用非离子型表面活性剂以洗涤固体基板(阵列)的方法(专利 文件4)，所述固体基板上固定有生理活性物质。专利文件4公开了作为非离子型表面活性 剂的烷基葡糖苷表面活性剂。然而，专利文件4的发明涉及这样一种阵列，其中所述阵列 (其上固定有蛋白或肽)用于检测包含在由培养细胞制备的溶胞产物中的蛋白激酶活性， 并且其方法包括在检测之前洗涤所述阵列以便防止溶胞产物组分被非特异性地吸附至阵 列基板的表面上。具体地，该方法包括将含有表面活性剂的洗涤溶液加入至阵列上，然后使 其从阵列中排出。因此，专利文件4的唯一目的是防止非特异性反应，并且类似于上面讨论 的专利文件1，专利文件4没有提到也没有提示测试样品的流动行进不良的问题，也没有将 此问题作为待解决的课题而认识到。在免疫色谱法中，分析物与检测试剂的复合物的检测可以如下进行测量反射光 的强度，并基于测量的强度计算吸光度(反射吸光度)。反射吸光度由在测量线处和其邻近 区域处测量的反射光强度的比率计算，但在此步骤中，测量波形(谱型)可以有时显示在上 游或下游侧的测量线(在此检测到复合物)附近处(尤其是下游侧)的扰动，这归因于其 中提高的反射光强度。当测试样品(试样)中包含的分析物的浓度低时，在确定基线时此 测量波形的扰动不能被忽视。因此，特异性信号(峰)的检测精确度可能降低，并且可能使 得测量本身无法进行。由于测量波形的这种扰动不以固定的频率或以固定的程度出现，因 此测定的再现性下降，并且在每次测量中可能必需对测量值进行适当的校正(即，对测量 波形的评估)。在使用白色膜和光学检测设备的常见免疫色谱法中，甚至用肉眼就可以将测量波 形的扰动识别为下面的现象，其中膜上相应的区域变得比周围区域更白，如同被漂白一样。现有技术没有解决测量波形的扰动问题，因此对此问题不存在已知的解决方案。引用的对比文件专利文件专利文件1 JP-A-H06-235730专利文件2 JP-A-H03-120468专利文件3 JP-A-H10-332697专利文件4 JP-A-2008-9290
发明内容
本发明要解决的问题本发明的目的是提供一种结合测定用多孔性固相，其使得在加入测试样品(例 如，全血)后在不需要对样品预处理(例如，离心)或额外的操作的条件下能够快速地、方 便地、准确地和低成本地分析所述测试样品，以及使用所述多孔性固相的结合测定法。解决问题的手段本发明人对于如何防止下列的问题已经进行了广泛的研究多孔性固相中测试样 品的流动行进不良、灵敏度差、再现性差和与使用多孔性固相(例如，膜)检测测试样品组分的结合测定法相关的测量波形的扰动，并且已经完成了本发明。具体地，本发明提供一种结合测定用多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入测 试样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组 成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由通式(I)显示的化合物，(B)含糖表面活性剂，其包 含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂。本发明 还提供使用所述结合测定用多孔性固相的结合测定法。细节在下面[1]_[24]中给出。[1] 一种用于结合测定的多孔性固相，其中在加入测试样品之前已经结合了至少 一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具 有5或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度， 且R1和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子， 和(C)类固醇表面活性剂。[2]根据[1]所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性剂㈧是 正辛基-β -D-葡糖苷和/或正庚基-β -D-硫代葡糖苷。[3]根据[1]所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性剂⑶是 蔗糖单己酸酯和/或蔗糖单月桂酸酯。[4]根据[1]所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述类固醇表面活性剂(C) 是胆酸钠和/或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPS)。[5]根据[1]44]中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述结合测 定法是免疫测定法。[6]根据[1]_[5]中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述结合测 定法是侧流形式、浸渍片(dipstick)形式、或流通形式膜测定法。[7]根据[1]- ]中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中俘获试剂固 定在所述多孔性固相上。[8]根据[7]所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述俘获试剂是抗体、特异 性俘获物质或抗原。[9] 一种结合测定条，其包含根据[1]_[8]中任一项所述的多孔性固相。[10]根据[9]所述的结合测定条，其还包含缀合物释放垫，所述缀合物释放垫包 含检测试剂。[11]根据[10]所述的结合测定条，其中所述检测试剂是标记的抗体、标记的特异 性俘获物质或标记的抗原。[12]根据[11]所述的结合测定条，其中所述标记包括粒径不同的两种类型的胶 体金。[13]根据[10]_[12]中任一项所述的结合测定条，其中所述缀合物释放垫包含氨基酸。
[14]根据[9]所述的结合测定条，其还包含样品垫和/或血细胞分离垫。[15]根据[14]所述的结合测定条，其中所述样品垫包含抗凝剂。[16] 一种用于侧流形式结合测定法的结合测定条，其包括(1)样品垫；(2)缀合物释放垫，其包含检测试剂并且放置在所述样品垫下方且与所述样品垫 接触；(3)血细胞分离垫，其放置在所述缀合物释放垫和下述多孔性固相(4)之间；和(4)多孔性固相，其上固定有俘获试剂，其中所述多孔性固相是[1]_[8]中任一项 所述的用于结合测定的多孔性固相。[17] 一种装置，其包括[9]_[16]中任一项所述的结合测定条。[18] 一种结合测定法，其通过使用根据[1]_[8]中任一项所述的多孔性固相来实 施。[19] 一种结合测定法，其通过使用根据[9]_[16]中任一项所述的结合测定条来 实施。[20] 一种结合测定法，其测试检测试剂和分析物的复合物的存在，所述复合物在 测试样品通过根据[1]所述的多孔性固相移动和/或经过时形成，所述分析物来自于所述 测试样品并且被固定在所述多孔性固相上的俘获试剂俘获。[21]根据[18]_[20]中任一项所述的结合测定法，其中所述测试样品是全血。[22] 一种在侧流形式或浸渍片形式结合测定中防止测试样品的流动行进不良的 方法，所述方法包括使用用于结合测定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述测 试样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组 成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具 有5或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度， 且R1和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子， 和(C)类固醇表面活性剂。[23]根据[22]所述的方法，其中所述测试样品具有50%或更高的Ht值。[24] 一种在侧流形式或浸渍片形式结合测定法中防止测试样品的测量波形中的 扰动的方法，所述方法包括使用用于结合测定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入 所述测试样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列 各项组成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具 有5或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度，且R1和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子， 和(C)类固醇表面活性剂。发明的效果本发明提供一种新型的结合测定用多孔性固相，其用于其中通过使用多孔性固 相进行测试样品组分的检测的结合测定，所述多孔性固相在加入所述测试样品前包括至少 一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组成的组(A)含糖表面活性 剂，其包含由通式(I)显示的化合物，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成 脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂，以及；使用所述多孔性固相的新型 结合测定法。根据本发明，有可能进行具有优异的再现性的结合测定，其中防止了多孔性固 相中测试样品的流动行进不良，并且具体地，防止了假阴性和假阳性，否则在含有固体组分 或具有高粘度的测试样品中将看到所述假阴性和假阳性。由于在加入测试样品后不需要预 处理测试样品(包括制备稀释液或洗涤溶液)，也不需要洗涤步骤，因此操作是简单和方便 的。此外，本发明能够获得极佳的测定性能，其特征是高灵敏度并缺少测量波形中的扰动。附图简要说明

图1显示结合测定条(测试条)的示意性结构图。图2显示其中具有高Ht值的模型全血用作测试样品的测试的结果，该测试验证本 发明防止测试样品的流动行进不良的效果(实施例3)。图3显示其中具有高Ht值的模型全血用作测试样品的测试的结果，该测试验证就 测量的再现性而言本发明防止测试样品的流动行进不良的效果(实施例4)。图4显示其中具有高Ht值的模型全血用作测试样品并且每种表面活性剂的浓度 发生变化的测试的结果，该测试验证就测量的再现性而言本发明防止测试样品的流动行进 不良的效果(实施例5)。图5显示包含对照线的测试条(实施例6)的示意性结构图。图6显示其中浓缩血浆用作测试样品的测试的结果，该测试验证就测量的再现性 而言，本发明改善测试线处测试样品的流动行进不良的效果(实施例7)。图7显示其中浓缩血浆用作测试样品的测试的结果，该测试验证就测量的再现性 而言，本发明防止对照线处测试样品的流动行进不良的效果(实施例7)。图8显示其中浓缩血浆用作测试样品的测试的结果，该测试验证就测量的再现性 而言，本发明防止测试线处测试样品的流动行进不良的效果(实施例9)。图9显示其中浓缩血浆用作测试样品的测试的结果，该测试验证就测量的再现性 而言，本发明防止对照线处测试样品的流动行进不良的效果(实施例9)。图10显示其中与本发明的多孔性固相一起使用两种类型的粒径不同的胶体金的 测试结果，该测试验证本发明防止测试样品的流动行进不良的效果(实施例10)。图11显示其中具有高Ht值的模型全血用作测试样品并且胆酸钠的浓度发生变化 的测试的结果，该测试验证就测定再现性而言本发明防止测试样品的流动行进不良的效果 (实施例11)。图12显示其中浓缩血浆用作测试样品并且多孔性固相用本发明的表面活性剂或其他表面活性剂预处理的测试的结果，该测试验证使用每种表面活性剂是否存在防止测量 波形中的扰动的效果(实施例12)。图13显示其中浓缩血浆用作测试样品并且多孔性固相用本发明的表面活性剂或 其他表面活性剂预处理的测试的结果，该测试验证是否可以改善灵敏度/再现性(实施例 12)。图14显示其中浓缩血浆用作测试样品并且本发明的表面活性剂和其他表面活性 剂以与本发明的方法不同的方式使用以测试是否可以防止测量波形中的扰动的测试的结 果(实施例13)。图15显示其中浓缩血浆用作测试样品并且本发明的表面活性剂和其他表面活性 剂以与本发明的方法不同的方式使用以测试是否可以改善灵敏度/再现性的测试的结果 (实施例13)。图16显示其中从健康人采集的全血用作测试样品并且将各种抗凝剂加入至样品 垫以验证就测量再现性而言防止测试样品的流动行进不良的效果的测试的结果(实施例 14)。图17显示其中从健康人采集的血浆用作测试样品并且将各种氨基酸加入至缀 合物释放垫以验证就测量再现性而言防止测试样品的流动行进不良的效果的测试的结果 (实施例15)。本发明的最佳实施方式本文使用的术语“测试样品”是指血液(全血)、血清、血浆、淋巴、尿液、粪便、腹 水、胸腔积液、组织/细胞，和类似物。本文使用的术语“测试样品”包括通过离心、过滤、 纯化或类似方法从全血或类似物中分离/分馏的测试样品组分，用有机溶剂或类似物提取 的测试样品组分，用表面活性剂或类似物溶解的测试样品组分，用缓冲液或类似物稀释的 测试样品组分，通过化学反应或类似反应改性/改变的测试样品组分，等等，它们可以进 行使用根据本发明的结合测定用多孔型固相的测定。本发明的测试样品在其加入时为液 体(流体)，并且在根据本发明的结合测定用多孔性固相中行进。本发明的测试样品还可 以包括诸如植物、河水和土壤的物质。本文使用的术语“行进(progression)”包括“移动 (migration) ”和“经过(passage) ”，“移动”是指当多孔性固相以其最大表面面向上放置时 液体在水平方向上的流动(即，在多孔性固相的纵向上(lengthwise)流动)，“经过”是指 当多孔性固相以其最大表面面向上放置时液体在垂直方向上的流动(即，液体跨多孔性固 相的厚度的流动)。下面描述本发明的优选实施方案，其中全血主要用作测试样品的实例。本文使用的术语“测试样品组分”是指包含在测试样品中的组分。测试样品组分的 具体实例包括凝固或纤维蛋白溶解标志物诸如纤维蛋白降解物(例如，D- 二聚体)，可溶 性纤维蛋白，TAT (凝血酶-抗凝血酶复合物)，和PIC (纤溶酶-纤溶酶抑制物复合物)；心 血管相关标志物诸如氧化LDL和BNP (脑钠肽)；代谢相关标志物诸如脂连蛋白，肿瘤标志 物诸如CEA(癌胚抗原)，AFP( α -甲胎蛋白)，CA19-9，CA125，和PSA(前列腺特异性抗原)； 炎症相关标志物诸如CRP (C-反应蛋白)，IgA，IgGjP IgM ；传染病相关标志物诸如流行性 感冒，HIV (人免疫缺陷病毒)，HBV (乙型肝炎病毒)，HCV (丙型肝炎病毒)，弓形虫属，衣原 体和梅毒；变态反应特异性IgE (免疫球蛋白E)，激素，药物，涉及单核苷酸多态性(SNPs)的核酸链和其片段，以及所述核酸链的互补链。术语“测试样品组分”在本文中还可以称为 “分析物”。本发明防止含有固体组分或具有高粘度的测试样品在多孔性固相中的流动行进 不良的有利效果可以最有益于例如，含有高比例的血细胞和少于正常量的血浆并具有高血 细胞比容(Ht)值的全血样品(称为“高Ht值样品”)，或由于高蛋白含量或其他原因而缺 少流动性的测试样品(称为“高粘度测试样品”)。这些测试样品具有低含水(液体)量。 高Ht值样品的实例包括具有50%或更高的Ht值的样品，该Ht值超过标准范围。例如，高 Ht值可能是由于由一些疾病导致的红细胞增加，或脱水导致的每单位全血量中血浆体积的 异常降低所引起的。在采集后或在结合测定开始后，由于一种原因或另一种原因，经受水蒸 发且已经干燥/浓缩的测试样品也可以受益于本发明。本文使用的术语“俘获试剂”是指与测试样品组分特异性结合并与其形成复合物 的试剂，并且其可以包括针对抗原的抗体，“特异性俘获物质”，以及针对抗体的抗原。术语 “特异性俘获物质”包括配体的受体，核酸链的互补链或适体，特定含糖物质的凝集素，和类 似物。本领域普通技术人员将容易地理解，取决于待测分析物的选择，测定系统的设计，等， 如在一种情况下被识别为本发明的测试样品组分(例如，针对抗体的抗原)在另一种情况 下可能变成本发明的俘获试剂。本领域普通技术人员还将容易地理解俘获试剂可以是任何 类型只要其可以与测试样品组分形成复合物，并且其可以是整个物质或其功能片段。例如， 如果俘获试剂是抗体，其可以是多克隆抗体，单克隆抗体，其功能片段(例如，Fab, Fab', F(ab，)2，和 Fv)，等等。本文使用的术语“检测试剂”与术语“缀合物”是同义词，并且是指用检测标志物标 记的俘获试剂，或与标记的分析物具有相同特性的物质，或在结合测定中与标记的分析物 等效的物质。检测试剂的具体实例包括标记的抗体，标记的特异性俘获物质，标记的抗原， 和类似物。已知标志物的实例包括可视化微粒诸如金属胶体颗粒(例如，胶体金)和有色的 胶乳颗粒，酶诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，和β -D-半乳糖苷酶，放射性同位素诸如 碘-125 (125I)，发光物质诸如acridinium化合物和鲁米诺(luminal)，荧光物质诸如异硫氰 酸荧光素和铕(III)螯合物，和类似物。抗体或类似物可以通过任何已知的标记方法(即， 引入和结合标志物质的方法)标记，而没有限制。本文使用的术语“样品垫”是指接受可能含有测试样品组分(分析物)的测试样品 的部件，并且其包括可以以垫的形式吸收液体测试样品并且允许液体和测试样品组分经过 的任何物质或形状。适合于样品垫的材料的具体实例包括，但不限于，玻璃纤维，丙烯酸纤 维，亲水的聚乙烯材料，干纸，纸浆，织物，和类似物。优选使用玻璃纤维垫(由Lydall制造) 作为样品垫。所述样品垫可以作为样品垫本身起作用，或可以另外地赋予缀合物释放垫或 血细胞分离垫的功能，所述缀合物释放垫或血细胞分离垫通常从样品垫接收测试样品。样品垫可以包含通常在结合测定中使用的封闭试剂或类似物以便防止或抑制结 合测定用多孔性固相内的非特异性反应(吸附)。这样的试剂的实例包括HeteroBlock(由 Omega Biologicals, Inc.制造的“500-11-001”)和类似物。此外，样品垫可以包含一种 或多种抗凝剂，例如，以便防止血液凝固并抑制在测定期间由于血液凝固引起的非特异性 反应(特别地，在分析物到达多孔性固相之前)。作为抗凝剂，可以使用肝素，柠檬酸，氟化 钠(NaF)，或螯合剂(或其盐或水合物)，只要它不损害本发明的效果。螯合剂的实例包括EDTA, CyDTA, DTPA，和类似物。本文使用的“缀合物释放垫”是指含有与测试样品组分特异性反应的检测试剂的 部件，并且当测试样品经过所述缀合物释放垫时所述缀合物释放垫允许检测试剂和测试样 品组分通过特异性反应形成复合物。缀合物释放垫本身可以靠近多孔性固相放置。备选地， 缀合物释放垫可以放置为在一侧与样品垫接触，并且还在另一侧与血细胞分离垫(下述) 接触，使得其接收通过毛细流动已经经过样品垫的测试样品并且然后还通过毛细流动将所 述测试样品运送至血细胞分离垫。本领域普通技术人员将容易地理解样品垫、缀合物释放 垫和血细胞分离垫的一种或多种的选择，以及选择的部件如何相对于用于结合测定的多孔 性固相放置，可以根据情况而变化，这取决于测试条设计的预期目的等。适合于缀合物释放垫的材料的实例包括，但不限于，纸，纤维素混合物，硝化纤维 素，聚酯，丙烯腈共聚物，玻璃纤维，非织造纤维(例如，人造丝)。优选使用玻璃纤维垫(由 Pall Corporation制造的“No. 8964”)作为缀合物释放垫。缀合物释放垫可以包含“对照试剂”以确保测定的可靠性，诸如不与测试样品组分 反应的标志物标记的抗体，和用标志物标记的高抗原性蛋白(例如，匙孔血蓝蛋白(KLH))。 对照试剂可以是预期不存在于测试样品中的任何组分(物质)，并且其与对照俘获试剂(下 述)适当地组合。缀合物释放垫还可以包含稳定剂、增溶剂和类似物质的一种或多种，使得 所述检测试剂(和任选地对照试剂)保持稳定的状态并且在与测试样品接触时迅速和有效 地溶解和流态化，从而促进检测试剂和测试样品中可能包含的分析物之间的特异性反应。 稳定剂和增溶剂的实例包括牛血清白蛋白(BSA)，蔗糖，酪蛋白，氨基酸和类似物。氨基酸优 选是甘氨酸或丝氨酸。本文使用的术语“血细胞分离垫”是指靠近所述缀合物释放垫放置的部件使得所 述血细胞分离垫接收通过毛细流动已经经过所述缀合物释放垫的测试样品，并且然后通过 毛细流动将所述测试样品运送至多孔性固相，所述多孔性固相放置为与血细胞分离垫的另 一侧接触。血细胞分离垫由亲水性和吸附性材料形成，所述材料具有过滤掉测试样品中包含 的细胞组分部分的固有能力，并且，如果所述测试样品是全血，则其可以将其中包含的细胞 组分的部分与血浆或血清分离。即使所述测试样品不含有细胞组分，其可能含有比血细胞 分离垫的孔隙大的固体组分，其可以与细胞组分相同的方式分离。因此，本领域普通技术人 员将容易地理解血细胞分离垫可以用来不仅分离血细胞，而且可以分离测试样品中通常包 含的固体组分。适合于血细胞分离垫的材料的实例包括，但不限于，吸水或不吸水的纤维性或非 纤维性基质诸如亲水无机粉末(例如，硅胶，氧化铝，和硅藻土)；海绵材料；粘土材料；布 料；亲水天然聚合物材料诸如纤维素材料(特别是纤维素多孔珠)和含纤维纸(特别是滤 纸或色谱纸)；和合成的或改性的天然聚合物诸如醋酸纤维素，聚氯乙烯，聚丙烯酰胺，聚 丙烯酸酯，聚氨酯，交联葡聚糖，琼脂糖和其他交联的或非交联的不溶于水的亲水聚合物。 适合于血细胞分离垫的材料的更多实例包括，但不限于，纤维性或非纤维性基质诸如玻璃 纤维基质；和合成聚合物诸如聚丙烯，聚乙烯，尼龙，聚偏氟乙烯和聚砜。多孔硬塑料也可以 用作用于血细胞分离垫的材料，只要其可以分离包含在全血中的血细胞组分，并且具有足 够的孔隙率从而允许血浆或血清经过多孔性固相并与其接触。优选使用聚砜垫(由I^llCorporation制造的“BTS-SP300”)作为血细胞分离垫。本文使用的术语“吸收体”是指吸收液体部件，所述吸收液体部件吸收已经通过结 合测定用多孔型固相的俘获试剂负载区域移动/经过的测试样品以控制测试样品的流动 行进。例如，在侧流或浸渍片形式中，吸收体可以设置在测试条的下游端上，并且在流通形 式中，吸收体可以设置在其上固定有俘获试剂的膜的下方。吸收体的实例包括，但不限于， 滤纸。优选使用由Whatman制造的740-E滤纸。本文使用的术语“多孔性固相”是指通常用于结合测定的多孔膜。测试样品的流动 行进发生在多孔性固相中，并且测试样品组分的检测最终在其中进行。用于多孔性固相的 材料不受限制，并且例如，多孔性固相可以由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、玻璃、 多糖(例如，纤维素或纤维素衍生物)、陶瓷或类似物产生。具体实例包括获自Millipore， Toyo Roshi JPWhatman的玻璃纤维滤纸和纤维素滤纸。俘获试剂固定在多孔性固相上。俘获试剂可以通过任何方法固定在多孔性固相 上，只要俘获试剂经由物理吸附、化学键合或类似作用直接或间接地固定在多孔性固相上。 例如，抗体或抗原可以通过将含有抗体或抗原的溶液涂覆或“点印(spotting) ”在膜上，并 且然后将所述膜干燥而吸附或固定在膜上。上面结合缀合物释放垫而提及的“对照俘获试 剂”也可以通过类似的方法固定在多孔性固相上。对照俘获试剂是用于确保测定的可靠性 的试剂。例如，如果标记抗体来自小鼠，则例如抗小鼠抗体(可以酌情选择抗小鼠特异性的 类型)可以是对照俘获试剂。如果缀合物释放垫包含对照试剂诸如标记的KLH，则抗-KLH抗 体或类似物可以用作对照俘获试剂。对照俘获试剂固定在多孔性固相上的位置可以根据测 定系统的设计适当地选择。例如，当使用侧流或浸渍片形式和标记的小鼠来源抗体，并且抗 小鼠抗体用作对照俘获试剂时，抗小鼠抗体正常情况下固定在用于测试样品组分的俘获试 剂的下游侧。当使用流通形式时，抗小鼠抗体正常情况下固定在离用于测试样品组分的俘 获试剂的固定位置适当的距离处(或如果检测多个测试样品组分，则以合适的间隔固定)。 总之，用于固定对照俘获试剂的最适位置可以通过考虑测定系统的设计以及对照试剂和对 照俘获试剂的组合来选择。本文使用的术语“测试条”是指其中结合测定用多孔性固相根据情况安装有样品 垫、缀合物释放垫、血细胞分离垫和吸收体中的至少一种的产品。假设测定不涉及测试样品 的稀释且没有加入测试样品以外的额外步骤，则测试条可以至少包括安装有缀合物释放垫 的结合测定用多孔性固相。该测试条通常形成在固相支持物诸如粘性塑料板上。固相支持 物，以及胶粘剂组分应该由不妨碍测试样品的毛细流动的材料制成。多孔性固相可以被层 压以增加其机械强度并防止测定期间的水蒸发(干燥)(参见专利文件幻。当聚酯膜或类 似物在多孔性固相的上侧成层使得所述多孔性固相被覆盖在层状体中时，可以观察到对测 试样品的流动行进的有利效果，诸如改善的流动行进速度。该测试条可以安装在容器(外 壳)中或装配在容器(外壳)上，所述容器(外壳)适合于所述测试条的尺寸、测试样品的 加入方式和位置、俘获试剂的固定位置、信号检测方法等等。这样的产品称为“装置”。可以在本发明中使用的表面活性剂之一为(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通 式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具有5或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度， 且R1和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接。可以用于本发明中的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基的实例包括，但不限 于，戊基、3-甲基丁基、己基、甲基戊基、庚基、4-甲基己基、5-甲基己基、4-乙基戊基、辛基、 6-甲基庚基、5-甲基庚基、5，5_ 二甲基己基、壬基、癸基和类似基团。烷基可以用任何取代 基取代，只要该取代不损害本发明的效果。取代基的实例包括卤素原子(例如，氯原子、氟 原子和碘原子)、羟基和类似基团。优选的R1是具有7或8个碳原子的直链烷基(正庚基 或正辛基)。具有5或6个碳原子的还原糖的实例包括葡萄糖、半乳糖和果糖。还原糖可以是 α-形式或形式，但优选形式。还原糖可以与相同的或不同的还原糖形成缩合物。 缩合物的具体实例包括麦芽糖(两个葡萄糖分子的缩合物)、蔗糖(一个葡萄糖分子和一个 果糖分子的缩合物)等。χ是1-3的数，其表示还原糖的缩合度。需注意χ是平均值，其可 以通过质子NMR测定。χ优选为1-2。R1和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接以形成糖苷键或硫代糖苷键。这样的结 构的具体实例是经由连接在葡萄糖的5位碳处的氧原子或硫原子通过醚键连接的R1和葡 萄糖。由通式⑴显示的化合物的具体实例包括烷基葡糖苷衍生物诸如正庚 基-β -D-葡糖苷(正庚基-β -D-吡喃葡糖苷)，正辛基-β -D-葡糖苷(正辛基-β -D-吡 喃葡糖苷)，正壬基-β -D-吡喃麦芽糖苷，正癸基-β -D-吡喃葡糖苷，和正癸基-β -D-吡 喃麦芽糖苷；烷基硫代葡糖苷衍生物诸如正庚基-β -D-硫代葡糖苷(正庚基-β -D-硫 代吡喃葡糖苷)，正辛基-β-D-硫代葡糖苷(正辛基-D-硫代吡喃葡糖苷)，正壬 基-β -D-硫代吡喃麦芽糖苷，辛基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，和正十二基-β -D-麦芽糖 苷；和类似物。在这些化合物中，特别优选正辛基-D-葡糖苷或正庚基-D-硫代葡 糖苷用于防止测试样品的流动行进不良和用于改进测定的灵敏度。为了防止测量波形的扰 动，优选正辛基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷或正十二基-β -D-麦芽糖苷。可以用于本发明中的另一种表面活性剂是(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪 酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子。具有5-14个碳原子的脂肪酸的实例包括戊酸(pentanoic acid)(戊酸(valeric acid)),己酸(hexanoic acid)(己酸(caproic acid)),庚酸(heptanoic acid)(庚酸 (enanthic acid)),辛酸(octanoic acid)(辛酸(caprylic acid)),壬酸(nonanoic acid) (壬酸(pelargonic acid)),癸酸(decanoic acid)(癸酸(capric acid)),十 二烧酸 (dodecanoic acid)(月桂酸(lauric acid)),禾口十四烧酸(tetradecanoic acid)(肉豆 蔻酸(myristic acid))。在这些脂肪酸中，优选具有6或12个碳原子的脂肪酸(即，己酸 (hexanoic acid)(己酸(caproic acid))或十二烧酸(dodecanoic acid)(月桂酸(lauric acid))) 0经由酯键与一个蔗糖分子连接的脂肪酸分子的数目可以为，例如，1-3。优选使用 其中一个脂肪酸分子与一个蔗糖分子经由酯键连接的蔗糖脂肪酸酯。这样的化合物的具体 实例包括蔗糖单己酸酯和蔗糖单月桂酸酯。在如本文使用的“含糖表面活性剂”的上下文中，术语“含糖”是指选自由㈧通式(I)显示的化合物和(B)蔗糖脂肪酸酯组成的组的表面活性剂在其结构中含有糖结构部分 或糖衍生的结构部分，其中在所述蔗糖脂肪酸酯中构成脂肪酸具有5-14个碳原子。可以用于本发明中的另一种表面活性剂还有(C)类固醇表面活性剂.本文使用的术语“类固醇表面活性剂”是指离子型或非离子型表面活性剂，其中疏 水基团具有类固醇主链。类固醇表面活性剂的具体实例包括胆酸盐，脱氧胆酸盐，去氢胆酸 盐，牛磺胆酸盐，甘胆酸盐，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]丙磺酸，3-[(3-胆酰胺丙基) 二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPQ，N，N-双(3-D-葡萄糖酰氨基丙基)胆酰胺，类固醇 皂苷(例如，洋地黄皂苷)，和类似物。在这些表面活性剂中，胆酸钠，CHAPS，和类似物优选 用于防止测试样品的流动行进不良和用于改进测定的灵敏度。为了防止测量波形的扰动， 优选胆酸钠，CHAPS，或洋地黄皂苷。上面提及的表面活性剂可以单独或组合使用。这些表面活性剂正常地以 0. 001-2.0% (w/v)的浓度使用。本领域普通技术人员将能够考虑要进行的结合测定中除 表面活性剂之外其他组分/元素的存在，膜的材料，和类似因素，通过试验确定表面活性剂 的最适浓度，从而使本发明的效果最大化。例如，表面活性剂的浓度优选为0. 001-0. 5%，更 优选0. 01-0. 5%,和还更优选0. 01-0. 1 %的范围。本发明的表面活性剂以溶液的形式使用。例如，可以通过将多孔性固相浸渍在表 面活性剂溶液中，然后将所述多孔性固相干燥，从而在加入测试样品之前将所述表面活性 剂结合至多孔性固相中。在其中将表面活性剂结合至多孔性固相中的根据本发明的方法中，测试样品不需 要预处理，并且排除了由于测试样品的稀释而引起的检测灵敏度的降低。而且，如果提供缀 合物释放垫，将不需要在加入测试样品后加入检测试剂的额外步骤。因此，可以容易地进行 结合测定。在常规方法中进行的测试样品的预处理将使得测定结果取决于洗涤溶液的加入 时机或其他因素而变化。然而，使用本发明的预先包含表面活性剂的多孔性固相，不仅消除 了进行预处理的麻烦，而且消除了对使用者的熟练度的要求(就调节洗涤溶液的时间等而 言)，从而改善了测定的精确度。洗涤溶液的加入时机需要根据测试条的批次间变化来进一 步进行调节，但如上所讨论地，此问题在本发明中问题较小。为了使本发明的效果最大化并提供最实用的实施方案，重要的是将表面活性剂固 定在多孔性固相上并且将其在使用前转变为干燥状态。在侧流或浸渍片形式的情况下，本 发明的表面活性剂需要至少固定在多孔性固相的测试样品移动区域中。多孔性固相的测试 样品移动区域在引入测试样品的部分处开始(直接引入或通过缀合物释放垫或类似物引 入)，包括测试样品的移动路径，并且在其中固定俘获试剂的部分处终止。然而，优选表面活 性剂的固定延伸至多孔性固相的端部。此外，重要的是将表面活性剂均勻地固定在测试样 品的移动区域内，使得所述测试样品可以均勻地移动。如上所述，根据本发明的用于结合测 定的多孔性固相使得测试样品(甚至高粘度的测试样品)有序地行进(移动/经过)，并且 因此使得测定具有优异的再现性，其中检测灵敏度不受损害。需注意的是上面提到的表面 活性剂的浓度主要预期用于上面提到的通过浸渍将表面活性剂结合在多孔性固相中的方 法。因此，如果采用不同的方法以将表面活性剂结合在多孔性固相中，例如，将表面活性剂 喷雾至多孔性固相上或多孔性固相材料本身的改性/加工，则可以对该方法确定适当的表 面活性剂浓度，其中在浸渍法中获得的结果用作参考点。
表述“将表面活性剂固定在多孔性固相上并将其在使用前转变为干燥状态”是指 其中表面活性剂结合在多孔性固相中并且不容易从多孔性固相上脱离或脱落的状态；其不 一定需要物理吸附或化学键合。因此，固定，可以通过将多孔性固相浸渍在表面活性剂溶液 中并且然后将所述多孔性固相干燥来实现，如该词在此上下文中所意指的那样。简言之，如 果多孔性固相在测定之前以某种方式以干燥状态保持表面活性剂就足够了。上述的本发明的表面活性剂溶液除了表面活性剂以外，还可以包含在结合测定中 通常用作封闭溶液、洗涤溶液或稀释剂的组分的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和 Good's缓冲液。缓冲溶液的pH不受限制，但优选在5-9的范围内。此外，通常加入至缓冲 液中的其他组分，诸如盐(例如，氯化钠)和防腐剂，可以加入至表面活性剂溶液中。此外，上述的本发明的表面活性剂溶液除了本发明的表面活性剂以外，还可以包 含通常用于结合测定中的其他表面活性剂(例如，聚氧乙烯非离子型表面活性剂诸如聚氧 乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯或聚氧乙烯单-对异辛基苯基醚)，所述其他表面活性剂在 此技术领域中通常使用的浓度下不干扰测定系统。下面通过将免疫测定作为实例描述利用根据本发明的结合测定用多孔性固相的 结合测定法。测试样品施加至结合测定条上，所述结合测定条包括接收测试样品的样品垫、 包含标记的抗体(作为检测试剂)的缀合物释放垫、用于分离细胞组分的血细胞分离垫和 包含表面活性剂的本发明的多孔性固相，抗体(作为俘获试剂)固定在所述多孔性固相上。 当测试样品经过缀合物释放垫时，标记的抗体与测试样品组分(分析物)反应形成特异性 复合物。该复合物通过毛细管作用通过膜行进(移动/经过)，并且测量来自已经被固定在 膜上的抗体俘获的特异性复合物内的标志物的信号。在根据本发明的结合测定法中，由于 表面活性剂被干燥并且预先固定在多孔性固相的测试样品移动区域上，因此测试样品显示 优异的流动性并且可以通过多孔性固相均勻地移动，即使当所述测试样品含有固体组分或 是高度粘性时。此外，在根据本发明的结合测定中可以减小含有俘获试剂的线的周围区域 变白(在上游侧或下游侧)的现象的频率。这样的免疫测定的具体实例包括“流通形式”免疫测定，“浸渍片形式”免疫测定， 和“侧流形式”免疫测定。在“侧流形式”中，液体测试样品逐滴加入至装置中并且在水平方向上通过已经施 加了俘获试剂的多孔性固相行进(移动)，所述俘获试剂可以特异性地结合测试样品组分 (分析物)。特异性结合分析物的检测试剂，分析物本身以及固定在多孔性固相上的俘获 试剂一起在多孔性固相上形成三元复合物，并且然后检测或定量包含在检测试剂中的标志 物。“流通形式”与侧流形式具有相同的测定原理，但与侧流形式的不同之处在于液体测试 样品在垂直方向上通过多孔性固相行进(经过)。“浸渍片形式”与上述两种形式的不同之处在于测试条的一部分浸泡在预定量的 液体测试样品中。在此，当测试样品沿多孔性固相上升时实现测试样品的行进(移动)。在本发明的多孔性固相中实现的防止测试样品的流动行进不良的有益效果在测 试样品运行的行进距离越长时越好。换句话说，当本发明与“侧流形式”或“浸渍片形式”组 合使用时可以以优异的再现性进行结合测定，在“侧流形式”或“浸渍片形式”中测试样品 沿着多孔性固相的最长侧移动。由于包含表面活性剂的根据本发明的多孔性固相抑制测试 样品的流动行进不良，因此其有效用于不包括洗涤步骤的结合测定中，并且其特别适合于侧流或浸渍片形式结合测定。包含表面活性剂的本发明的多孔性固相、缀合物释放垫等可以根据需要通过修改 /改变下面实施例中所述的方法来产生。在测定期间可以以任意顺序进行涉及测试样品和 标志物的反应，只要可以利用根据本发明的用于结合测定的多孔性固相。可以根据公知方 法测量来自标志物的信号。例如，当使用胶体金作为标志物时，可以测量反射光的吸光度或 强度。当使用放射性同位素作为标志物时，可以使用计数器来计数辐射剂量。
实施例下面通过实施例进一步描述本发明。然而，本发明不限于下面的实施例。比较例1 使用常规结合测定用多孔性固相的免疫色谱装置的制造(1)胶体金标记的抗-D 二聚体抗体(抗-DD抗体缀合物)的制备IOml含有92. 4 μ g/ml抗-D 二聚体单克隆抗体(抗-DD抗体)的2mmol/l硼酸盐 缓冲溶液(PH 8. 0)加入至200ml含有胶体金(10D/ml)(粒径40nm)的碳酸钾缓冲溶液(pH 8. 0)中。该混合物在室温下搅拌10分钟。向胶体金-抗-DD抗体混合物中加入20mll0% 牛血清白蛋白(BSA)水溶液后，混合物继续搅拌5分钟，并在10°C下离心(10，OOOrpm) 45分 钟以获得沉淀物(缀合物)。缀合物用缀合物稀释缓冲液(由Scripps制造)稀释(悬浮 在其中)至170D/ml。在524nm(即，胶体金的最大吸收波长)下测量吸光度。(2)缀合物释放垫的制备(1)中制备的缀合物与1.33%酪蛋白和4%蔗糖溶液(pH 7.5)混合以制备缀 合物溶液GOD/ml)。玻璃纤维垫(宽度13. Omm,长度254mm，厚度0. 56mm)(由I^all Corporation制造的“No. 8964”)浸渍以1. 2体积(相对于垫的体积)的缀合物溶液。该 垫在烘箱中在70°C下干燥30分钟以获得缀合物释放垫。(3)其上固定有抗-DD抗体的膜(用于结合测定的多孔性固相)的制备通过使用免疫色谱分配器“XYD050” (由BI0D0T制造)，将含有lmg/ml抗-DD抗 体和2. 5%蔗糖的lOmmol/1磷酸盐缓冲溶液(pH 7. 2)的“线”画在(1 μ 1/cm)硝化纤维素 膜(短边25mm，长边254mm，厚度0. 235mm)(由Millipore制造的“HFM0”)上，沿膜的 长边离长边的边缘Ilmm的位置处。该膜在烘箱中在70°C下干燥45分钟以获得其上固定有 抗-DD抗体的膜。(4)样品垫的制备玻璃纤维垫(短边16mm，长边254mm，厚度0. 55mm)(由Lydall制造)浸渍 以1. 15体积(相对于垫的体积)的样品垫浸渍溶液(含有25mmol/l NaCl，0.5%蔗糖 和 0.25mg/ml HETERO BLOCK (由 Omega Biologicals 制造的 “500-11-001”)的 20mmol/l Tris-HCl缓冲液(pH 7. 2))0该垫在烘箱中在70°C下干燥45分钟以获得样品垫。(5)结合测定条(测试条)的制备其上已经固定有抗-DD抗体的上述膜(d)粘合至粘性塑料板(g)。血细胞分离垫 (c)(由Mil Corporation制造的“BTS-SP300”)放置在与已经施加了抗-DD抗体(e)的 一侧相对的膜的一端处。吸收体(f)(由Whatman制造的“740-E”)放置在膜的另一端处， 即已经施加了抗-DD抗体的同一侧。放置在O)中制备的缀合物释放垫(b)以叠盖血细胞 分离垫，并放置(4)中制备的样品垫(a)以叠盖缀合物释放垫。最后，聚酯膜(h)层压在顶部以覆盖多孔性固相和吸收体。将得到的结构切成6mm的宽度以获得测试条，在所述结构 中这些部件彼此成层。测试条的宽度为6mm且长度为70mm。测试条安装在塑料外壳(未显 示在图1中)中/装配在其上，所述塑料外壳为此目的专门设计并且具有样品添加窗和检 测窗，从而获得免疫色谱装置。图1是测试条的示意性结构图。实施例1 使用根据本发明的测试条的免疫色谱装置的制造(1)其上固定有抗-DD抗体的本发明的膜(用于结合测定的多孔性固相)的制备硝化纤维素膜(由Millipore制造的“HFM0”)浸泡在含有0. 05% (w/v)浓度的 表1中所示的本发明表面活性剂的lOmmol/1磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)中，并在室温下振荡 30分钟。去除过量液体后，将膜在烘箱中在37°C下干燥1小时。然后得到的含有表面活性 剂的膜以与比较例1的步骤C3)中相同的方式加工以获得其上固定有抗-DD抗体的本发明 的膜。(2)本发明的免疫色谱装置的制造本发明的测试装置以与比较例1的步骤(5)中相同的方式，使用比较例1的步骤 (2)中制备的缀合物释放垫，比较例1的步骤中制备的样品垫，和上面提到的其上固定 有抗-DD抗体的本发明的膜制造。实施例2 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果[1](1)具有高Ht值的模型全血的制备将全血离心获得血细胞层。由相同全血获得的血浆加入至血细胞层以获得具有 70%的Ht值的模型全血。(2)测试方法100 μ 1模型全血施加至在实施例1中制造的根据本发明的装置的测试条的样品 垫，并且在15分钟后，用肉眼检查来源于缀合物并指示行进液体的边缘的紫红色线是否到 达位于测试条的一端的吸收体。如果紫红色线已经到达位于测试条一端的吸收体，则判断 所述多孔性固相已经防止了测试样品的流动行进不良。结果显示在表1中。在相关的注释 中，在其中缀合物直接施加至比较例1的膜上的测试中，是否存在粘性塑料板对测试样品 的流动行进速率不造成可观察到的差异。表 1
本发明的表面 活性剂的名称表面活性剂类别效果实施例1-1正辛基-β-D-葡 糖苷烷基葡糖苷O实施例1-2正庚基-β-D-硫 代葡糖苷烷基葡糖苷〇实施例1-3蔗糖单己酸酯蔗糖脂肪酸酯〇比较例1无表面活性剂无表面活性剂X
(3)测试结果在比较例1的测试条中，紫红色线没有到达抗-DD抗体线。另一方面，在包含正辛 基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷或蔗糖单己酸酯的本发明的测试条中，证实紫 红色线已经移动至位于测试条的一端的吸收体。从上面判断正辛基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷，和蔗糖单己酸酯各 自具有防止用于结合测定的多孔性固相中测试样品的流动行进不良的效果(在表1的“效 果”栏中标记为“〇”)。实施例3 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果[2](1)含有纯化的D 二聚体(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制备全血离心获得血细胞层。含有纯化的DD和获自相同全血的血浆的lOmmol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至血细胞层，从而获得在重配后含有终浓度为1. 0 μ g/ml的 DD和Ht值为70%的的模型全血。(2)测试方法100 μ 1 DD模型全血施加至实施例1中制造的包含本发明的结合测定用多孔性固 相(包含正辛基-D-葡糖苷)的免疫色谱装置的样品垫，并且以1分钟间隔(在加入样 品后从1分钟-15分钟)通过使用免疫色谱读数器“ ICA-1000”由Hamamatsu Photonics K. K.制造)测量测试装置的检测窗中反射吸光度(此后，在实施例中称为“吸光度”)的变 化。在所有实施例中使用相同的装置测量吸光度。(3)测试结果在包含本发明的结合测定用多孔性固相的测试条中，在加入DD模型全血后10分 钟观察到吸光度增加，并且吸光度继续线性增加直至加入DD模型全血后15分钟。在两次 测量中观察到几乎相同的结果(图2中的“实施例”)。在包含比较例1的结合测定用多孔 性固相的测试条中，在第一次测量中直至加入DD模型全血后14分钟才观察到吸光度增加， 并且在加入DD模型全血后15分钟时吸光度的增加低于在加入DD模型全血后10分钟时在 本发明的测试条中观察到的吸光度增加。在第二次测量中，在加入DD模型全血后11分钟 时观察到吸光度的增加。然而，在加入DD模型全血后15分钟时测量的吸光度低于本发明 的测试条中获得的吸光度(图2中的“比较例”)。因此证实本发明的测试条可以以优异的再现性进行测定，即使是当具有非常低的 流体含量的全血(例如，具有70%的Ht值)用作测试样品时，并且证实本发明具有防止结 合测定用多孔性固相中测试样品的流动行进不良的显著效果。实施例4 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果[3](I)DD模型全血的制备DD模型全血以与实施例3相同的方式制备。(2)根据本发明的免疫色谱装置的制造使用正辛基- β -D-葡糖苷、正庚基-D-硫代葡糖苷或蔗糖单月桂酸酯作为表 面活性剂以与实施例1中相同的方式制备免疫色谱装置。(3)测试方法
100 μ 1 DD模型全血施加至上面O)中制造的本发明的免疫色谱装置的样品垫， 并且15分钟后，测量测试装置的检测窗中的吸光度(n = 5)。计算测量值的CV(% )，并且 与包含具有常规结合测定用多孔性固相的测试条的免疫色谱装置中获得的CV进行比较。(4)测试结果根据本发明的测试条与常规测试条相比显示显著较低的CV(% )(参见图幻。因 此证实本发明的结合测定用多孔性固相的使用能够以优异的再现性测定甚至那些具有极 高Ht值的测试样品，并且证实本发明防止结合测定用多孔性固相中测试样品的流动行进 不良，并且能够进行精确的测量。实施例5 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果W](1)含有纯化的D 二聚体(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制备全血离心获得血细胞层。含有纯化的DD和获自相同全血的血浆的lOmmol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至血细胞层，从而获得含有终浓度为1. 0 μ g/ml的DD和Ht 值为62%的模型全血。(2)其上固定有抗-DD抗体的膜(结合测定用多孔性固相)的制备以与实施例1的步骤(1)中相同的方式制备其上固定有抗-DD抗体的膜(结合测 定用多孔性固相)，不同之处在于加入至lOmmol/1磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)中的表面活性剂 浓度为 0,0. 01，0. 05，0. 075，或 0. 10% (w/v)。(3)测试方法使用实施例4的步骤(3)中所述的测试方法。计算测量值的CV(% )以确定最适 浓度范围。(4)测试结果如图4中所示，各种表面活性剂的使用与常规方法相比在每个测试浓度下均确保 优异的再现性。当CV值等于或小于15% (即，使用常规方法获得的值的一半)时，判断表 面活性剂的使用是有效的。在本实施例中使用的每种表面活性剂在0.01-0. 10%的浓度范 围内得到的CV值均小于15%。由此证实这些表面活性剂的每一种与常规方法相比均提供 令人满意的效果。实施例6 包含对照线的免疫色谱装置的制造(1)用于对照线的胶体金标记的KLH(KLH缀合物)的制备其中已经溶解了 KLH粉末(620 μ g/ml)的IOml 2mmol/l磷酸盐缓冲液(pH 6. 1) 加入至200ml含有10D/ml胶体金(粒径40nm)的碳酸钾缓冲液(pH 8. 0)中。该混合物 在室温下搅拌10分钟。将20ml 10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液加入至胶体金-KLH混合 物中后，将该混合物搅拌5分钟，并在10°C下离心(10，OOOrpm)45分钟以获得沉淀物(缀 合物)。缀合物用缀合物稀释缓冲液(由Scripps制造)稀释(悬浮在其中)至170D/ml。 在531nm(即，胶体金的最大吸收波长)下测量吸光度。(2)缀合物释放垫的制备在比较例1的步骤(1)中制备的抗-DD抗体缀合物和上面步骤(1)中制备的KLH 缀合物与1.33%酪蛋白和4%蔗糖溶液(pH 7.5)混合以制备其中缀合物的浓度分别为 40D/ml和4. 50D/ml的缀合物溶液。玻璃纤维垫(宽度13. Omm,长度254mm，厚度0. 56mm)(由Pall Corporation制造的“No. 8964”)浸渍以1. 2体积(相对于该垫的体积)的缀合 物溶液。该垫在烘箱中在70°C下干燥30分钟以获得缀合物释放垫。(3)其上固定有抗-DD抗体和抗-KLH多克隆抗体的膜(结合测定用多孔性固相) 的制备硝化纤维素膜浸泡在含有如实施例1的步骤(1)中的具体浓度的本发明表面活性 剂的lOmmol/1磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)中，并在室温下振荡30分钟。去除过量液体后，将膜 在烘箱中在37°C下干燥1小时。通过使用免疫色谱分配器“XYD050” (由BIODOT制造)， 将含有lmg/ml抗-DD抗体和2. 5%蔗糖的10mmol/l磷酸盐缓冲溶液(pH 7. 2)的“线”， 和含有0. 5mg/ml抗-KLH多克隆抗体和2. 5%蔗糖的lOmmol/1磷酸盐缓冲溶液(pH7. 2) 的“线”分别画在(1 μ 1/cm)硝化纤维素膜(短边25mm，长边254mm，厚度0. 235mm)(由 Millipore制造的“HFM0”)上，沿膜的长边离长边的一端Ilmm和离相同的一端15mm的位 置处。该膜在烘箱中在70°C下干燥45分钟以获得其上固定有抗-DD抗体的膜。(4)样品垫的制备样品垫以与比较例1的步骤⑷中相同的方式制备。(5)免疫色谱装置的制造以与比较例1的步骤(5)中相同的方式，使用上面(2)中制备的缀合物释放垫、上 面(3)中制备的膜和上面中制备的样品垫制备包含对照线的测试条和免疫色谱装置。 图5是该测试条的示意性结构图。在下面的实施例7和9中，术语“测试线”是指当测试样品到达膜(d)上固定抗-DD 抗体(e)的位置处时检测到的线(其在图5中出现在(e)中)，并且术语“对照线”是指当 测试样品到达所述膜上固定对照俘获试剂(抗-KLH多克隆抗体)的位置时检测到的线(其 在图5中出现在(j)中)。实施例7 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果[5](1)含纯化的D 二聚体(DD)的浓缩血浆(DD浓缩血浆)的制备从健康人采集的冻干血浆(0. 5ml)溶解在0. 25ml纯水中以制备2倍浓缩血浆。含 有纯化的DD的lOmmol/1 Tris HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至浓缩血浆中以制备DD终浓度 为1. 0 μ g/ml的DD浓缩血浆。(2)测试方法100 μ 1 DD浓缩血浆施加至实施例6中制造的免疫色谱装置的样品垫，并且15分 钟后，测量测试装置的检测窗中的吸光度(n = 5)。计算测量值的CV(% )，并且与用常规 免疫色谱装置(即，除不包括根据本发明的表面活性剂以外与实施例6的免疫色谱装置相 同)获得的CV(%)进行比较。(3)测试结果图6显示测试线处的检测结果，且图7显示在对照线处的检测结果。与常规免 疫色谱装置中测量到的CU0A )相比，每种根据本发明的表面活性剂的使用均产生较低的 CV(%)0在常规方法中在对照线处的检测再现性差，因为行进的测试样品的边缘没有到达 测试线。然而，当使用本发明的结合测定用多孔性固相时由于防止了测试样品的流动行进 不良，极大地改善了再现性。因此证实本发明的结合测定用多孔性固相能够以优异的再现性测定两倍浓缩血浆测试样品，并且证实本发明防止结合测定用多孔性固相中测试样品的 流动行进不良，并且能够进行精确的测量。实施例8 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果W](1)材料和测试方法使用实施例2中所述的相同材料和测试方法，不同之处在于使用胆酸钠或CHAPS 作为表面活性剂。表2
本发明的表面 活性剂的名称表面活性剂类别效果实施例胆酸钠类固醇〇实施例CHAPS类固醇〇比较例无表面活性剂无表面活性剂X⑵测试结果包含胆酸钠的本发明的测试条允许紫红色线到达位于测试条的一端处的吸收体， 与实施例2中显示的表面活性剂类似。因此，判断胆酸钠和CHAPS有效地防止结合测定用多孔性固相中测试样品的流动 行进不良(在表2的“效果”栏中标记为“〇”)。实施例9 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品的 流动行进不良的效果[7](1)材料和测试方法使用实施例4中所述的相同材料和测试方法，不同之处在于使用胆酸钠或CHAPS 作为表面活性剂。(2)测试结果图8显示测试线处的检测结果，且图9显示对照线处的检测结果。与常规测试条 相比，用胆酸钠或CHAPS处理的根据本发明的测试条在测试线以及对照线处显示显著较低 的CV(%)(参见图8和9)。对于对照线处的检测，常规方法中的CV(%)十分高。这是因 为测试样品由于流动行进不良而没有到达对照线。因此证实具有高Ht值的测试样品也可 以以优异的再现性使用胆酸钠或CHAPS来测定。实施例10 粒径不同的两种类型的胶体金的使用(1)加入60nm胶体金标记的抗-D 二聚体抗体IOml含有46. 2 μ g/ml抗-D 二聚体单克隆抗体(抗-DD抗体)的2mmol/l硼酸 盐缓冲液(pH 8. 0)加入至含有10D/ml胶体金(粒径60nm)的200ml碳酸钾缓冲液(pH 8.0)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。加入IOml 10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液后， 胶体金-抗DD抗体混合物搅拌5分钟，并且在10°C下离心(10，OOOrpm)45分钟以获得沉 淀物(缀合物)。缀合物用缀合物稀释缓冲液(由Scripps制造)稀释(悬浮在其中)至170D/ml。在531nm( S卩，胶体金的最大吸收波长)下测量吸光度。(2)缀合物释放垫的制备40nm胶体金标记的抗-DD抗体和60nm胶体金标记的DD抗体与1. 33%酪蛋白和 4%蔗糖溶液(pH 7. 5)混合以制备缀合物溶液，在所述缀合物溶液中每种抗体调节至40D/ ml ο玻璃纤维垫(宽度13.0_，长度254mm，厚度0.56mm)(由I^all Corporation制造的 "No. 8964”)浸渍以1. 2体积(相对于垫的体积)的缀合物溶液。该垫在烘箱中在70°C下 干燥30分钟以获得缀合物释放垫。(3)根据本发明的免疫色谱装置的制造以与实施例1中相同的方式制造免疫色谱装置，不同之处在于使用上面(2)中制 备的缀合物释放垫。正庚基-D-硫代葡糖苷用作表面活性剂。(3)含纯化的D 二聚体(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制备全血离心获得血细胞层。含有纯化的DD和获自相同全血的血浆的lOmmol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)加入至血细胞层，从而获得Ht值为60%的的模型全血。DD浓度 调节为 0,3. 0，或 15μ g/ml。(4)测试结果在其中使用粒径不同的两种类型的胶体金的测定系统中，与常规方法(其中使用 单一粒径的胶体金)相比，使用本发明的多孔性固相改善了检测灵敏度，并且能够以更加 定量的方式分析含有高浓度分析物的测试样品(图10)。实施例11 验证由根据本发明的结合测定用多孔性固相所显示的防止测试样品 的流动行进不良的效果[8](1)含纯化的D 二聚体(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制备全血离心获得血细胞层。含有纯化的DD和获自相同全血的血浆的lOmmol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至血细胞层，从而获得含有终浓度为1. 0 μ g/ml的DD且Ht 值为60%的模型全血。(2)其上固定有抗-DD抗体的膜(结合测定用多孔性固相)的制备以与实施例1的步骤(1)中相同的方式制备其上固定有抗-DD抗体的膜(结合测 定用多孔性固相)，不同之处在于使用胆酸钠作为表面活性剂并且加入至lOmmol/1磷酸盐 缓冲液(pH 7.2)中的表面活性剂浓度为0，0.01，0.05，0.075，0. 1或0.5% (w/v) 0(3)测试方法使用实施例4的步骤(3)中所述的测试方法。计算测量值的CV(% )以确定最适 浓度范围。(4)测试结果如图11中所示，与常规方法相比，每个测试浓度的表面活性剂的使用均提供优异 的再现性。当CV值等于或小于10% (即，使用常规方法获得的值的一半)时，判断表面活 性剂的使用是有效的。在本实施例中使用的表面活性剂在0. 01-0. 5%的浓度范围内得到的 CV值均小于10%。由此证实与常规方法相比表面活性剂的使用提供令人满意的效果。实施例12 比较使用本发明的表面活性剂和使用其他表面活性剂预处理结合测 定用多孔性固相所获得的防止测量波形中的扰动的效果(1)含纯化的D 二聚体(DD)的浓缩血浆(DD浓缩血浆)的制备
从健康人采集的冻干血浆(0. 5ml)溶解在0. 25ml纯水中以制备2倍浓缩血浆。含 有纯化的DD的lOmmol/1 Tris HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至所述浓缩血浆中以制备DD终 浓度为1. 0 μ g/ml的DD浓缩血浆。(2)免疫色谱装置的制造以与实施例6的步骤(3)相同的方式制备其上固定有抗-DD抗体和抗-KLH多 克隆抗体的膜，不同之处在于在lOmmol/1磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中使用0.05%正庚 基-β-D-硫代葡糖苷，0.05% Tween 20，或0.05% TritonX-IOO作为表面活性剂。使用所 述膜以与实施例6的步骤( 相同的方式制造免疫色谱装置。(3)测试方法120 μ 1 DD浓缩血浆施加至上面O)中制备的免疫色谱装置的样品垫，并且15分 钟后，测量测试装置的检测窗中的吸光度(n =幻。在每次测量中检查测量波形的形状。本发明的免疫色谱装置(正庚基-D-硫代葡糖苷预处理)与包含不浸渍表面 活性剂的硝化纤维素膜的免疫色谱装置(常规方法)，以及其中用于浸渍固相的表面活性 剂为iTriton Χ-100或Tween 20的免疫色谱装置(Triton X-100预处理或Tween 20预处 理)进行比较。(4)测试结果图12显示在不同试验条件下的测量波形的形状。图的左侧是上游侧，右侧是下游 侧，且向下的峰代表信号。首先出现的峰对应于测试线，且随后出现的峰对应于对照线。由 于反射吸光度由峰处和峰周围的反射光强度之间的比率来计算，因此峰周围的反射光强度 的变化影响测量的精确度。因此，如果峰周围的反射光强度不发生变化则是理想的。如图12中所示，在(a)常规方法，(c)Triton X-100预处理和(d)Tween 20预处 理中的波形中在峰周围观察到反射光强度的上升改变。特别地，在用Tween 20预处理的多 孔性固相中观察到反射光强度的剧烈改变(图12中的(d))。然而，在用根据本发明的表面活性剂预处理的多孔性固相中，没有观察到峰周围 反射光强度的改变(图12中的(b))。图13显示在测试线处反应吸光度的分布。当使用采用根据本发明的表面活性剂 预处理的多孔性固相时，测量的反射吸光度值的差异很小(即，再现性优异)，并且灵敏度 高。另一方面，在其他条件下测量值的差异很大。特别地，当使用Tween 20时，有时甚至不 能计算反射吸光度(即，不可能进行测量)。实施例13 在将表面活性剂结合至多孔性固相的不同方法之间比较防止测量波 形中的扰动的效果(1)含纯化的D 二聚体(DD)的浓缩血浆(DD浓缩血浆)的制备以与实施例12相同的方式制备DD浓缩血浆。(2)固相洗涤溶液的制备正庚基-β -D-硫代葡糖苷，Tween 20，或Triton X-100加入至10mmol/l磷酸盐 缓冲液(pH 7. 2)(终浓度0. 05% (w/v))以制备固相洗涤溶液。(3)测试方法120 μ 1 DD浓缩血浆施加至根据本发明的测试条或由常规方法制备的测试条的样 品垫。在加入DD浓缩血浆后15分钟测量本发明的测试装置的检测窗中的吸光度。对于常规方法的测试装置，在加入DD浓缩血浆后5分钟加入50 μ 1固相洗涤溶液，并且在加入DD 浓缩血浆后15分钟测量检测窗中的吸光度。(4)测试结果当本发明的表面活性剂以固相洗涤溶液的形式加入至多孔性固相中时，不防止测 量波形的扰动(图14(c)中的箭头)。同样，当使用(b)常规方法，(d)含有Triton X-100 的固相洗涤溶液，或(e)含有Tween 20的固相洗涤溶液时，也不防止测量波形的扰动(图 14)。相反，当用根据本发明的表面活性剂预处理多孔性固相时，没有观察到峰周围反 射光强度的变化(图14(a))。图15显示测试线处反射吸光度的分布。当使用采用根据本发明的表面活性剂预 处理的多孔性固相时，测量的反射吸光度值的差异很小(即，再现性优异)，并且灵敏度高。 另一方面，在其他条件下测量值的差异很大。由此证实根据本发明的多孔性固相不仅可以防止测试样品的流动行进不良，而且 可以防止测量波形中的扰动，并且能够以与常规方法或使用固相洗涤溶液相比更高的灵敏 度和更高的再现性进行测定(图15)。实施例14 验证与抗凝剂加入至样品垫相关的改善再现性的效果(1)含纯化的D 二聚体(DD)的全血(DD全血)的制备含有纯化的DD的10mmol/l Tris HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至采集自健康人的全 血中以制备DD终浓度为1. 0 μ g/ml的DD全血。(2)使用含有抗凝剂的样品垫制造免疫色谱装置以与比较例1相同的方式制造免疫色谱装置，不同之处在于样品垫浸渍以加入了 抗凝剂的样品垫浸渍溶液。抗凝剂的类型和终浓度如下。EDTA-2Na (EDTA 1 或 5mmo 1/1)二亚乙基三胺-N，N，N，，N”，N”-五乙酸(DTPA =Immo 1/1)反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N，，N，_四乙酸(CyDTA =Immo 1/1)(3)测试方法120 μ 1 DD全血施加至已经用抗凝剂处理的免疫色谱装置的样品垫，并在15分钟 后，测量测试装置的检测窗中的吸光度。(4)测试结果当使用包含用抗凝剂处理的样品垫的测试条时，与包含未用抗凝剂处理的样品垫 的测试条相比，无论使用哪种类型抗凝剂，再现性均提高(图16)。实施例15 验证与氨基酸加入至缀合物释放垫相关的改善再现性的效果(1)含纯化的D 二聚体(DD)的血浆(DD血浆)的制备含有纯化的DD的10mmol/l Tris HCl缓冲液(pH 8. 0)加入至采集自健康人的血 浆中以制备DD终浓度为1. 0 μ g/ml的DD血浆。(2)氨基酸加入至缀合物释放垫以与比较例相同的方式制造免疫色谱装置，不同之处在于用已经加入氨基酸的缀 合物溶液制备缀合物释放垫。加入的氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丙氨酸。 在每种情形中氨基酸的终浓度均为lOmmol/1。
(3)测试方法120 μ 1 DD血浆施加至具有含氨基酸的缀合物释放垫的免疫色谱装置的样品垫， 并在15分钟后，测量测试装置的检测窗中的吸光度。(4)测试结果当氨基酸加入至缀合物释放垫时再现性提高。特别地，当加入丝氨酸或甘氨酸时 再现性显著地提高(图17)。为了总结实施例的结果，从测试结果得出结论，使用采用根据本发明的表面活性 剂处理的结合测定用多孔性固相能够使甚至高粘度的测试样品在多孔性固相中适当地流 动/行进，抑制测量波形中的扰动，并且能够以高灵敏度和优异的再现性进行测定。还可以 通过将本发明的结合测定用多孔性固相与用抗凝剂处理的样品垫和/或用氨基酸处理的 缀合物释放垫组合来进一步提高再现性。工业应用性根据本发明，通过在其中允许测试样品流动/行进的结合测定用多孔性固相中使 用选自下面(A)-(C)的一种或多种表面活性剂(A)含糖表面活性剂，其包含由通式(I)显 示的化合物，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原 子，和(C)类固醇表面活性剂，能够使甚至高粘度测试样品在多孔性固相中适当地流动/行 进，和以优异的再现性进行测定，同时防止假阴性和假阳性成为可能。符号说明
(a)样品垫
(b)缀合物释放垫
(C)血细胞分离垫
(d)多孔性固相(膜)
(e)俘获试剂(抗体)
(f)吸收体
(g)粘性塑料板
(h)聚酯膜
(j)对照俘获试剂。
权利要求
1.一种用于结合测定的多孔性固相，其中在加入测试样品之前已经结合了至少一种表 面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物， R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具有5 或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度，且R1 和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性剂(A) 是正辛基-β -D-葡糖苷和/或正庚基-β -D-硫代葡糖苷。
3.根据权利要求1所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性剂(B) 是蔗糖单己酸酯和/或蔗糖单月桂酸酯。
4.根据权利要求1所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述类固醇表面活性剂 (C)是胆酸钠和/或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPS)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述结合测定 是免疫测定。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述结合测定 是侧流形式、浸渍片形式、或流通形式膜测定。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相，其中俘获试剂固定 在所述多孔性固相上。
8.根据权利要求7所述的用于结合测定的多孔性固相，其中所述俘获试剂是抗体、特 异性俘获物质或抗原。
9.一种结合测定条，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的用于结合测定的多孔性 固相。
10.根据权利要求10所述的结合测定条，其还包含缀合物释放垫，所述缀合物释放垫 包含检测试剂。
11.根据权利要求10所述的结合测定条，其中所述检测试剂是标记的抗体、标记的特 异性俘获物质或标记的抗原。
12.根据权利要求11所述的结合测定条，其中所述标记包括粒径不同的两种类型的胶体金。
13.根据权利要求10-13中任一项所述的结合测定条，其中所述缀合物释放垫包含氨基酸。
14.根据权利要求8所述的结合测定条，其还包含样品垫和/或血细胞分离垫。
15.根据权利要求14所述的结合测定条，其中所述样品垫包含抗凝剂。
16.一种用于侧流形式结合测定的结合测定条，其包括(1)样品垫；(2)缀合物释放垫，其包含检测试剂并且放置在所述样品垫下方且与所述样品垫接触；(3)血细胞分离垫，其放置在所述缀合物释放垫和多孔性固相之间；和(4)多孔性固相，俘获试剂固定在所述多孔性固相上，其中所述多孔性固相是根据权利要求1-8中任一项所述的用于结合测定的多孔性固相。
17.一种装置，其包括根据权利要求9-16中任一项所述的结合测定条。
18.—种结合测定法，其包括使用根据权利要求1-8中任一项所述的用于结合测定的 多孔性固相。
19.一种结合测定法，其包括使用根据权利要求9-16中任一项所述的结合测定条。
20.一种结合测定法，其包括测试检测试剂和分析物的复合物的存在，其中所述复合物 在测试样品通过根据权利要求1所述的多孔性固相移动和/或经过时形成，所述分析物来 自于所述测试样品并且被固定在所述多孔性固相上的俘获试剂俘获。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的结合测定法，其中所述测试样品是全血。
22.—种在侧流形式或浸渍片形式结合测定法中防止测试样品的流动行进不良的方 法，所述方法包括使用用于结合测定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述测试 样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组成 的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具有5 或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度，且R1 和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述测试样品具有50%或更高的Ht值。
24.一种在侧流形式或浸渍片形式结合测定法中防止测试样品的测量波形中的扰动的 方法，所述方法包括使用用于结合测定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述测 试样品之前已经结合了至少一种表面活性剂，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组 成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由下列通式(I)显示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10个碳原子的直链或支链烷基，G代表由具有5 或6个碳原子的还原糖衍生的残基，并且χ是1-3的数，其表示所述还原糖的缩合度，且R1 和G经由氧原子或硫原子通过醚键连接，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂。
全文摘要
公开了一种用于结合测定法的多孔性固相，其能够使测试样品诸如全血在不需要预处理的条件下快速地、方便地、准确地和低成本地分析，以及使用所述多孔性固相的结合测定法。在加入测试样品之前，至少一种表面活性剂结合到用于结合测定的多孔性固相中，所述至少一种表面活性剂选自由下列各项组成的组(A)含糖表面活性剂，其包含由通式(I)代表的化合物，(B)含糖表面活性剂，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中构成脂肪酸具有5-14个碳原子，和(C)类固醇表面活性剂。
文档编号G01N33/543GK102077091SQ20098012512
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者丹野真志, 吉水美和子, 近藤万友美 申请人:积水医疗株式会社