利用光谱分离，表征和/或标识微生物的方法

专利名称：利用光谱分离，表征和/或标识微生物的方法
技术领域：
本发明涉及检测，分离和/或标识样品中微生物的方法和系统.具体而言，本发明涉及利用光谱技术快速表征和/或标识微生物的方法。
背景技术：
在生物学流体中检测病原微生物，应该在尽可能最短的时间内完成，具体而言，在败血病这种情况下，尽管对医生而言可利用的抗生素谱很广但是其死亡率仍然保持较高。 生物学活性剂如微生物在患者体液尤其是血液中存在，采用血液培养瓶一般可以检测。血流感染与高发病率和死亡率有关，然而当前的诊断方法，是采用培养之后进行生物化学标识并抗生素药敏测试，这可能要进行几天时间。典型地，基于临床症状开始经验疗法，而当初始疗法失效时测试结果仅仅影响临床决策。在阳性血液培养结果之后在最初几个小时， 优选1个小时内表征血液感染的能力，将会显著地加强提供的诊断信息的临床定性。分子放大方法已经提出而填补了这方面的需要，但是对于这种方法仍保留有严重挑战。阳性血液培养液自身代表天然放大的微生物种群，而潜在地适用于各种快速标识(ID测试。传统自动表型ID测试，如Vitek ，Phoenix 和Microscan 系统，或手动表型测试，如API，需要微生物处于合适的生长阶段并无干涉介质和血液产物，才能提供强有力的结果。这些系统利用平板培养上的18 Mh的阳性培养液的生长集落。然而，在努力获得较快结果中，一些实验室已经报道，采用了具有从阳性血液培养瓶分离的微生物的这些系统。这些来自培养瓶的直接测试并不适合于所有微生物(例如，革兰氏阳性球菌)，通过测试厂商并未批准，而一般要花费3 8小时才能提供结果。较快而更广泛的特异性测试是急需的，这才能在阳性培养结果之后为医师在最初几个小时优选1个小时内提供临床相关结果。光学光谱方法，如内源荧光(IF)、红外光谱(FTIR)或拉曼光谱以及质谱方法如 MALDI-T0F，具有容许非常快速地标识微生物的潜力，但是可能会遇到来自许多存在于液体微生物培养基和临床样品如血液或其组合中的高度荧光和吸收性化合物的干扰。直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两部差速离心和在血清分离器管中离心。分离、表征和/或标识微生物的其它方法已经描述，包括美国专利No. 4，847，198公开了一种利用UV激发拉曼光谱标识微生物的方法。根据'198专利，细菌悬浮液通过紫外光谱范围内的单波长接触。所用的部分光能被吸收而部分光能被发射。发射的光能，共振增强拉曼散射，作为反向散射能量进行测定。这种能量经过处理而产生细菌的特征光谱。
Vo-Dinh的美国专利No. 5，938，617涉及一种通过用几个波长的光激发样品并同步取样发射强度而标识样品中生物学病原的系统。这种系统包括用于将样品暴露于激发辐射并由此产生发射辐射的机制。生物学病原可能是病毒和细菌。美国专利No. 6，177，266公开了一种采用通过矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MQ分析细胞蛋白提取物或整个细胞而产生的属、种和菌株特异性的生物标记而进行化学分类归类细菌的方法。在美国专利No. 7，070，739中，提出了一种通过二维超离心直接从体液或均质化组织中提取、分离和纯化包括病毒的微生物的方法。在第一个离心步骤中，所有沉降速度高于待标识微生物的沉降速率的粒子都被除去。在第二步超离心步骤中，采用特殊交替的离心管，于填充流体中应用等密度分带而形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术能够用于利用核酸特异性染料通过光散射或荧光检测分带的粒子并按照非常小的体积回收分带粒子，用于通过病毒蛋白子单元和完整病毒粒子的质谱以及核酸质量和通过严格酶产生的片段的质量两种的荧光流量细胞计数测定而进行表征。美国专利申请出版物No. 2007/0037135公开了一种用于标识和定量悬浮于液体中的生物学样品的系统。这种系统包括一个具有至少一个激发光源的荧；样品界面模块光激发模块，可选地耦合于荧光激发模块用于定位生物学样品的而接受至少一个激发光源的激发光；荧光发射模块，可选地耦合于样品界面模块并包含至少一个检测仪用于检测生物学样品的荧光激发-发射矩阵；和计算机模块，操作上耦合于荧光发射模块。计算机模块对生物样品的荧光激发-发射矩阵实施多变量分析而标识和定量生物学样品。然而，‘135 申请并未讨论来自复杂生物学样品如血液的微生物的标识和定量。美国专利申请出版物No. 2007/0175278描述了采用液体培养基培养所关注样品， 包括例如，血液、尿液、粪便、脉管支架等，工业生产线，水系统，食物产品，化妆品，药物产品和法医样品。此后，微生物就能够从液体介质中通过本领域内已知的方法，例如，离心而收获。浓缩的微生物随后就可以转移至载体物质，可选地在干燥之后，用于获取振动光谱。该专利申请讨论了各种标识和分类微生物的方法，包括振动光谱如拉曼光谱。然而，这些方法在试图从负载样品如含血液培养基中分离和表征微生物时具有几个缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血球细胞，血小板，质粒，血浆酶和细胞碎片，这都能够导致结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的而由于其步骤能够对用户产生潜在危险的病原的气溶胶暴露而变得不安全。简单的安全的而可靠的方法对于从临床样品(例如，血液培养液)和其它无这些复杂样品中分离出微生物而无这些干扰物质并与快速标识技术相容，仍是所需的。

发明内容
本发明提供了分离，表征和/或标识样品中微生物的方法。所述方法容许比现有技术更快速地表征和/或标识微生物而产生更快的诊断结果(例如，在患有或疑似患有败血症的主体中)并标识污染物质(例如，食物和药物)。在本发明的方法中所涉及的步骤， 从获得样品到表征和/或标识微生物，能够在非常短的时间框架内，例如在不到约120min 内完成而产生临床相关的可行动信息。另外，本发明的方法能够完全自动化，由此降低了处理传染性物质和/或污染样品的危险。
在一方面中，本发明涉一种从测试样品中表征和/或标识微生物的方法，包括(a)已知包含或可能包含微生物获得测试样品；(b)选择性地溶解所述测试样品中的非微生物细胞而产生溶解的样品；(c)从所述溶解的样品的其它组分中分离微生物而形成微生物的分离样品；(d)光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在一方面中，本发明涉及一种从血液培养基中表征和/或标识微生物的方法，包括(a)从已知包含或可能包含微生物的血液培养基中获得样品；(b)选择性地溶解所述样品中非微生物细胞而产生溶解的样品；(c)将所述溶解的样品分层铺层于在密闭容器中的密度垫层上；(d)对所述容器离心而从所述样品的其它组分中分离出微生物并形成微生物的颗粒；(e)光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(f)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在另一方面中，本发明涉及一种表征和/或标识微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)将所述测试样品置于密闭容器中；(c)从所述测试样品的其它组分中原位分离微生物而在所述密闭容器中形成微生物的微生物分离样品；(d)原位光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在一个实施方式中，所述分离通过将测试样品分层铺层于密闭容器(例如，气密性密闭容器)中的密度垫层上并将所述容器离心而使微生物成丸，而同时测试样品介质仍保持在密度垫层的顶部。在另一实施方式中，所述容器在底部和/或侧面上具有一个光学窗口而使微生物颗粒能够进行光谱探询。这些微生物能够通过将颗粒的光谱与已知微生物测定的光谱或预测的光谱性质比较而继续标识。这种不用进一步处理而直接在球粒中标识微生物的能力，显著地提高了这种微生物标识方法的安全值。在一个实施方式中，光谱探询基于微生物的固有特性(例如，内源荧光)。在其它实施方式中，光谱探询部分基于从其它在本发明方法期间加入而与特异性微生物或微生物组发生相互作用的试剂而获得信号。在另一实施方式中，所述方法进一步包括回收微生物粒子，再再悬浮微生物并进行进一步标识或表征测试(例如，抗药性，毒性因素，抗菌谱)。本发明将在本文中结合图和以下提出的描述进行解释。


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图1显示了在肺炎链球菌培养基和阴性培养液上实施本发明的溶解、分离步骤之后的分离容器的照片。图2A 2C显示了在光谱探询之前在溶解步骤中采用溶解缓冲液A、B和C的分离的微生物激发/发射光谱实例。图3显示了采用5中不同溶解缓冲剂和两种密度垫层而实施本发明的溶解和分离步骤之后分离容器的照片。图4是显示溶解含微生物血液培养液的离心后的分离设备照片。在照片中清楚可见的溶解的血液培养基，密度垫层和微生物颗粒。图5 8显示了密闭分离容器中读取的各种微生物的激发/发射光谱的实例。图9是显示从10个缓症链球菌(圆圈)和10个肺炎链球菌(三角)培养基获得颗粒的平均内源应该信号的曲线图。图10是显示从10个缓症链球菌(圆圈)和10个肺炎链球菌(三角)培养基获得颗粒的平均粒径的的曲线图。
具体实施例方式本发明能够按照不同的形式实现而不应该解释为仅限于本文中提出的实施方式。 相反，这些实施方式提供而使本发明公开内容将是更全面而完全的，并将完全对本领域的技术人员传达本发明的范围。例如，有关一个实施方式举例说明的特性能够结合至其它实施方式中，而有关具体实施方式
举例说明的特性能够从那个实施方式中删除。另外，在本文中提出的各种对于这些实施方式的变体和添加依据本发明的公开内容对于本领域的那些技术人员而言将会是显而易见的，这将不会偏离本发明。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的那些普通技术人员理解的相同的普通含义。本文中在本发明的描述中所用的术语是仅仅为了描述具体实施方式
的目的而并非预想限制本发明。定义正如本文中所用的“a”或“an”可能是指一个或不只一个。例如，“一个”细胞可能是指单个细胞或各种各样的细胞。也正如本文中所用的“和/或”是指和涵盖一种或多种相关所列的条目的任何和所有可能的组合，以及在解释备选物时的无组合(“或”)。另外，正如本文中所用的术语“约”，当用于指定可测得的值如本发明的化合物或试剂的用量，剂量，时间，温度等时，意味着涵盖指定量的士20%，+10%, 士5%，士 1%， 士0. 5%，或甚至士0. 的变化。正如本文中所用的术语“微生物”预想用于涵盖一般单细胞的生物，这能够在实验室中进行繁殖和处理，包括但不限于革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，酵母菌，霉菌，寄生虫和柔膜细菌。本发明革兰氏阴性细菌的非限制性的实例包括以下属细菌绿脓杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌，痢疾杆菌，肠杆菌属，克雷白杆菌，沙雷菌属，变形杆菌，弯曲杆菌，嗜血杆菌， 摩根菌属，弧菌属，耶尔森氏菌，不动细君属，嗜根寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，缺陷短波单孢菌属(Brevimdimonas)，青枯菌属，无色菌杆属，梭菌属，普氏菌属，布兰汉氏球菌属，奈瑟菌属，布克氏菌属，柠檬菌属，哈夫尼菌属，爱德华氏菌属，气单胞菌属，莫拉克斯氏菌属，布鲁氏菌属，巴斯德氏菌属，普罗威登斯菌属，和军团病杆菌属。本发明革兰氏阳性细菌的非限制性的实例包括以下菌属肠球菌，链球菌，葡萄球菌，芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌，乳酸杆菌，李氏杆菌，消化链球菌，丙酸杆菌，梭状芽孢杆菌，类杆菌，加德纳菌，克氏库克菌，乳球菌，明串珠菌，微，分支杆菌和棒状杆菌。本发明的酵母菌和霉菌非限制性的实例包括以下菌属的那些假丝酵母，隐球酵母菌，诺卡氏菌，青霉菌，格链孢霉，红酵母，曲霉， 镰刀菌，酵母菌和毛包子菌。本发明的寄生虫非限制性的实例包括以下属的那些锥虫，巴贝斯虫，利什曼原虫，疟原虫，武赫雷尔氏丝虫，布鲁格氏丝虫，盘尾丝虫和纳氏虫。本发明的柔膜细菌非限制性的实例包括以下菌属的那些支原体属和脲原体菌属。在一个实施方式中，正如本文中更详细描述的那些，样品或培养液的微生物能够进行分离和光谱探询而表征和/或标识样品中存在的微生物。正如本文中所用的术语“分离”预想涵盖任何微生物的样品已经被除去、浓缩或另外从其原始状态，或生长或培养介质分开。例如，根据本发明，微生物可以从可能另外干涉表征和/或标识的非微生物或非微生物组分分离开(例如，作为分离的样品)。该术语可以包括两个其它层之间所夹于其间的一层微生物，例如，在离心之后于高密度垫层顶部收集的微生物，或在固体表面(例如，过滤膜)上收集的微生物层。术语也可以包括那已经部分通过层(例如，密度垫层)的微生物集落。同样，分离的微生物样品可以包括粉盒微生物和/或其组分的集落或层，这是比原始样品更浓的，或另外与之分离的，并能够处于微生物的紧密堆积的稠密块至微生物的扩散层之间。能够按照分离的形式或样品构成的微生物组分包括但不限于，菌毛，鞭毛，菌伞和夹膜，以及任意组合。从微生物中分离出的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如，血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。在还有的另一实施方式中，正如本文中更详细的描述，样品或培养液的微生物能够经过分离和探询而表征和/或标识样品中存在的微生物。正如本文中所用的术语“分离” 预想涵盖任何样品的微生物已经从其原始状态，或其生长或培养介质，以及任何其中所含的任何非微生物或非微生物组分。例如，根据本发明，微生物可以从可能另外干涉表征和/ 或标识的非微生物或非微生物组分分离开(例如，作为分离的样品)。从微生物中分离出的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如，血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。在还有的另一实施方式中，正如本文中更详细的描述，样品或培养液的微生物能够经过成丸和探询而表征和标识样品中存在的微生物。正如本文中所用的术语“成丸”预想涵盖任何微生物样品已经压缩或沉淀成微生物团块。例如，样品的微生物能够通过离心， 或本领域内的其它已知方法压缩或沉淀成团块。该术语包括微生物(和/或其组分)离心以后在容器的底部和/或侧面上的集落。在能够构成的球丸中微生物组分包括但不限于， 菌毛，鞭毛，菌伞和夹膜，以及任意组合。根据本发明，微生物可以与可能另外干涉表征和/ 或标识的非微生物或非微生物组分成丸分离开(例如作为基本纯化的微生物颗粒)。从微生物中分离出的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如，血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。正如本文中所用的术语“密度垫层”是指整个具有均勻密度的溶液。本发明提供了分离，表征和/或标识样品中微生物的方法。而且，所述方法可能尤其适用于从复杂样品如含血液培养基中分离，表征和/或标识微生物。这种快速方法也容许比现有技术更快地表征和/或标识微生物，而获得更快速的诊断(例如，在患有或疑似患有败血症的主体中)并表征/标识污染物质(例如，食物和药物)。在本发明的方法中所涉及的步骤，从获得样品到表征和/或标识微生物，能够在非常短的时间框架内完成而产生临床相关的可行动信息。在某些实施方式中，本发明的所述方法能够在低于约120min内，例如低于约110， 100，90，80，70，60，50，40，30，20，15，10，5，4，3，2，或 Imin 内进行实施。本发明的方法的极
度迅速性代表超过现有方法的改进。本发明方法能够适用于表征和/或标识本文中所述的任何微生物。在一个实施方式中，这些微生物是细菌。在另一实施方式中，这种微生物是酵母。 在另一实施方式中，这种微生物是霉菌。在另外的实施方式，这种微生物是寄生虫。在另一实施方式中，这种微生物是柔膜细菌。另外，本发明的所述方法能够完全自动化，由此降低了处理传染性物质和/或污染样品的危险。在一方面中，本发明涉及一种表征和/或标识测试样品中的微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)选择性地溶解所述测试样品中的非微生物细胞而产生溶解的样品；(c)从所述测试样品的其它组分中分离微生物而形成微生物的分离样品；(d)光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在一方面中，本发明涉及一种从血液培养基中表征和/或标识微生物的方法，包括(a)从已知包含或可能包含微生物的血液培养基中获得样品；(b)选择性地溶解所述样品中非微生物细胞而产生溶解的样品；(c)将所述溶解的样品分层铺层于在密闭容器中的密度垫层上；(d)对所述容器离心而从所述样品的其它组分中分离出微生物并形成微生物的颗粒；(e)光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(f)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在还有的另一方面中，本发明涉及一种表征和/或标识微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)将所述测试样品置于密闭容器中；(c)从所述测试样品的其它组分中原位分离微生物而在所述密闭容器中形成微生物的微生物分离样品；(d)原位光谱探询所述分离的微生物而产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过将所述光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质进行比较而表征和/或标识所述分离的样品的所述微生物。在本发明的另一实施方式中，所述方法涉及在探询微生物之前从分离容器中回收分离步骤期间形成的微生物球丸或其部分。例如，在形成球丸之后，流体能够从球丸吸离而
10将球丸再悬浮于合适的介质(例如，其中微生物可存活的介质)中。再悬浮的微生物能够从分离容器中去除。微生物随后，例如，在悬浮液中或在它们已经再成丸之后进行进行光谱探询而表征和/或标识。在其它实施方式中，再悬浮的微生物能够在分离容器中，例如，在悬浮液中或在它们已经再成丸之后进行光谱探询。在另外的实施方式，从球丸回收的微生物能够直接用于进一步光谱探询(例如，拉曼光谱，质谱)而无需再悬浮。样品通过本发明的方法能够进行测试的样品(即，测试样品)包括其中微生物可以是或疑似存在和/或生长的临床和非临床样品，以及对微生物存在进行常规或偶然检测的物质的样品。所利用的样品量可以由于本方法的通用性和/或灵敏度而大大不同。样品制备能够通过本领域内那些技术人员已知的任何数量的技术完成，但是本发明的一个优点就是复杂的样品类型，如例如血液，体液，和/或其它不透明物质，都可以直接利用该系统进行测试，而很少或无需大范围进行预处理。在一个实施方式中，这种样品取之于培养基。在另一实施方式中，这种样品取之于微生物培养基(例如，血液培养基)。在另一实施方式中，这种样品其中疑似，或已知包含微生物。可以测试的临床样品包括任何临川或研究实验室典型测试的任何类型的样品，包括但不限于，血液，血清，血浆，血液部分，关节流体，尿液，精液，唾液，粪便，脑脊髓液，胃内容物，阴道分泌物，组织勻浆，骨髓抽吸，骨勻浆，痰，抽吸，棉拭子拭样和拭子渣液，其它体液等。在另一实施方式中，临床样品能够进行培养而培养基样品可以使用。本发明在研究中以及兽医和医药应用中找到了用途。样品能够获取的合适主体一般是哺乳动物主体，但是能够是任何动物。正如本文中所用术语“哺乳动物”包括但不限于， 人，非人灵长类动物，牛，绵羊，山羊，猪，马，猫，狗，兔子，啮齿类(例如，田鼠或白鼠)，等。 人主体包括新生儿，婴幼儿，青少年，成年人和老年人主体。样品能够获自的主体包括但不限于，哺乳动物，鸟类，爬行动物，两栖动物和鱼类。可以进行测试的非临床样品包括物质，涵盖，但不限于，食品，饮料，药物，化妆品， 水(例如，饮水，非饮用水，和污水)，压舱海水，空气，土壤，下水道水，植物物质(种子，叶子，茎，根，花，果实)，血液产品(例如，血小板，血清，血菜，白血球部分等)，捐赠器官或组织样品，生物战样品等等。所述方法也尤其十分适合实时测试而监控工业现场的污染水平， 过程控制，质量控制等。在另一实施方式中，非临床样品能够进行培养并能够使用培养的样品。在本发明一个实施方式中，样品获自患有或疑似患有微生物感染的主体(例如， 患者)。在一个实施方式中，主体患有或疑似患有败血症，例如，细菌性或真菌性。样品可以是直接来自主体的血液样品。这种样品可以从来自想、患者血液的样品的血液培养基生长，例如BacT/ALERT 血液培养基。血液培养基样品可以来自阳性学培养基，例如表明微生物存在的血液培养基。在某些实施方式中，这种样品取自于在其转为阳性之后短时间内，例如约Mi之内，例如，约5，4，3，或浊，或在约60min，例如，约55，50，45，40，35，30，25，20，15， 10，5，4，3，2，或Imin的时间内的阳性血液培养基。在一个实施方式中，这种样品取自于其中微生物以对数阶生长的培养基。在另一实施方式中，样品取自于其中微生物处于稳定期的培养基。本发明提供了检测、表征和/或标识微生物的高灵敏度。这能够使检测、表征和/或标识无需首先不得不进行将其生长于固体或半固体介质上并对生长的菌落取样的微生物分离步骤。因此，在本发明一个实施方式中，这种样品不是源自生长于固体或半固体界面上的微生物(例如，细菌，酵母，或霉菌)菌落。因此在本发明一个实施方式中，这种样品不是源自生长于固体或半固体界面上的微生物(例如，细菌，酵母，或霉菌)菌落。样品的体积应该足够大而产生能够在本发明方法的分离/分出步骤完成之后进行光谱探询的微生物分离样品或微生物球丸。合适的体积取决于样品源和样品中微生物的预测水平。例如，阳性血液培养基每体积将含有高于待检测污染的饮水样品的微生物水平， 因此血液培养基介质相比于饮水样品需要的体积较小。一般而言，这种样品大小能够为低于约50mL，例如，低于约40，30，20，15，10，5，4，3，或2mL。在某些实施方式中，这种样品大小能够是约lmL，例如，约0. 75,0. 5，或0. 25mL。在某些实施方式中，其中分离按照微量进行， 样品大小能够低于约200 μ L，例如，低于约150，100，50，25，20，15，10，或5 μ L。在一些实施方式中(例如，当样品预期含有少量微生物)，样品大小能够为约IOOmL或更大，例如，约 250，500，750，或 IOOOmL 或更大。可选的溶解步骤在一些实施方式中，获得样品之后，在本发明的方法中下一步骤是选择性地溶解样品中可能存在的有害细胞，例如血液细胞和/或组织细胞。细胞可以溶解而容许从样品的其它组分分离出微生物。微生物从其它组分分离防止在光谱探询期间产生干扰。如果非微生物细胞预期不存在于样品中或预期不会干扰探询步骤，则溶解步骤可以不需要实施。 在一个实施方式中，待溶解的细胞是样品中存在的非微生物细胞而可以存在于样品中的微生物细胞发生溶解。然而，在一些实施方式中，选择性溶解的特殊类型的微生物可能是所期望的而因此能够更具本文中描述的而也是本领域内众所周知的方法进行实施。例如，一类有害微生物能够选择性被溶解，例如酵母被溶解，而同时细菌并不被溶解或反之亦然。在另一实施方式中，所需卫生被溶解才能分离微生物的特定亚细胞组分，例如，细胞膜或细胞器。在一个实施方式中，所有的非微生物细胞都被溶解。在其它实施方式中，部分非微生物细胞被溶解，例如，被溶解掉足够细胞而防止对光谱探询步骤产生干扰。细胞溶解可以通过本领域内已知任何能够有效选择性溶解细胞而会溶解或不会溶解微生物的方法进行实施， 包括但不限于，加入溶胞溶液，超声波溶解，渗透压震扰，化学处理和/或其组合。溶胞溶液是一种能够溶解细胞的溶液，例如，非微生物细胞(例如，通过溶解整合细胞膜)和/或微生物细胞。在一个实施方式中，溶胞溶液能够包含一种或多种清洁剂，一种或多种酶，或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合，而能够进一步包含其它试剂。在一个实施方式中，所述清洁剂能够是非变性的溶胞清洁剂，如Triton X-100， Triton 'X-100-R, Triton X-114, NP-40，Genapol C_100，Genapol X-100, Ig印al CA 630，Arlasolve 200, Brij 96/97，CHAPS,辛基β -D-葡萄糖苷，皂素和九乙二醇单十二烷基醚(C12E9，聚桂醇)。可选地，变性溶胞清洁剂能够包含在内，如十二烷基硫酸钠，N-月桂酰肌氨酸，脱氧胆酸钠，胆汁盐，十六烷基三甲基溴化铵，SB3-10, SB3-12，氨磺酰基甜菜碱(amidosulfobetaine)-14和C7^0。可选地，增溶剂也能包含在内，如Brij 98，Brij 58, Brij 35, Tween 80, Tween 20，Pluronic L64，Pluronic P84，非-清洁剂磺基甜菜碱(NDSB 201)，氯胺苯醇(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。典型地，非-变性清洁剂和增溶剂以超过其临界胶束浓度(CMC)的浓度使用，而同时变性清洁剂可以按照地域其CMC的浓度加入。例如，非-变性溶胞清洁剂能够按照约0. 010% 约10%，例如，约0. 015% 约 1. 0 %，例如，约0. 05 % 约0. 5 %，例如，约0. 10 % 约0. 30 % (在用样品稀释之后的最终浓度)的浓度使用。在另一实施方式中，可以优选使用聚氧乙烯清洁剂。聚氧乙烯清洁剂能够包含这种结构C12_18/E9_10，其中C12_18表示12 18个碳原子的碳链长度而E9,表示 9 10个氧化乙烯亲水性头基团。例如，聚氧乙烯清洁剂能够选自由Brij 97，Brij 96V， Genapol C-100，Genapol X-100，九乙二醇单十二烷基醚(polidocanol)，或其组合组成的组中。酶能够应用于溶胞溶液中的包括但不限于，消化核酸和其它膜污染物质的酶(例如，蛋白酶XXIII，脱氧核糖核酸酶，神经氨糖酸苷酶，多糖酶，Glucanex 和果胶ex )。其它添加剂能够使用的包括，但不限于，还原剂如2-巯基乙醇Q-Me)或二硫苏糖醇(DTT)和稳定剂如镁，丙酮酸盐和润湿剂。溶胞溶液能够被缓冲于任何适合溶解所需细胞的PH，而这将取决于多种因素，包括但不限于，样品的类型，待溶解细胞和所用的清洁剂。在一些实施方式中，PH能够处于约2 约13，例如，约6 约13，例如，约8 约13，例如，约10 约13 的范围。合适的pH缓冲剂包括任何能够维持pH在所需范围的缓冲剂，例如，约0. 05M 约 1. OM 的 CAPS。在一个实施方式中，样品和溶胞溶液混合而随后培养足够的一段时间进行溶胞和发生细胞膜的溶解，例如，约 1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，40，50，或 60s，或约 2,3,4,5,6, 7,8,9,10，15，或20min或更长，例如，约Is 约20min，约Is 约5min，或约Is 约2min。 培养时间将取决于溶胞溶液的强度，例如，清洁剂和/或酶的浓度。一般而言，更温和的溶胞缓冲剂将需要更长的时间和更多样品稀溶液才能完全溶解非微生物细胞。溶胞溶液的强度能够基于样品中已知是或疑似是的微生物而进行选择。对于更易于溶解的微生物，能够使用温和的溶胞溶液。这种溶胞作用能够在约2 约45°C，例如，约15 约40°C，例如，约 30 约40°C的温度下发生。在一个实施方式中，溶胞溶液能够载入到注射器中而样品能够随后吸入到注射器中而使之在注射器中发生混合和培养。在一个实施方式中，溶胞溶液能够载入到注射器中而样品能够随后吸入到注射器中而使之在注射器中发生混合和培养。在一些实施方式中，溶胞条件(例如，溶液或培养时间)，以及分离he/huo光谱探询步骤，能够足以杀死样品中一些或所有的微生物。本发明的方法是高度通用的而不要求为了分离和标识发生所有微生物都是活体。在某些实施方式中，一些或所有微生物可以是死亡的，死亡可以发生在本发明方法正实施步骤之前、期间和/或之后。分离步骤在本发明的方法中下一步骤(例如，如果溶胞步骤实施时，在样品已经溶解之后的步骤)是分离步骤。分离步骤能够经过实施而从样品的其它组分(例如，非微生物或其组分)中分离出微生物并将微生物浓缩成能够进行光谱探询实现标识和表征目的的球丸。 分离并不是不得不完成的，即，其并非要求进行100%的分离。所有的需要的是从样品的其它组分分离微生物要足以容许微生物进行光谱探询而基本上不会受到其它组分干扰。例如，分离能够产生至少约 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 % , 97 %，98 %，或99 %纯的或更高纯度的微生物粒子。在一个实施方式中，分离通过离心步骤实施，其中样品(例如，溶解的样品)置于分离容器中密度垫层的顶部而容器在容许微生物分离的条件下离心(例如，微生物能够在容器底部和/或侧面上形成球丸)。根据该实施方式，样品的其它组分(例如，在样品介质中可能存在的非微生物或其组分)保持在密度垫层顶上或在密度垫层的上部分。一般而言， 任何已知的容器都可以用于分离步骤。在一个实施方式中，分离容器是在2009年10月30 日提交的题为"Separator Device for Use in theSeparation, Characterization and/
or identification of Microorganisms”有关美国专利申请序列号_中公开的分离设
备。该分离步骤从样品中的物质，如培养基，细胞碎片，和/或其它或许对微生物光谱探询 (例如，通过内源荧光)产生干扰的组分分离出微生物。在一个实施方式中，密度垫层也用于从死亡微生物(其并不能通过密度垫层)中分离出活体微生物。在另一实施方式中，密度垫层并不含有密度梯度，无论是在离心之前还是在离心之后。换句话说，分离容器并不离心足够长的时间和/或加速进行物质补充密度垫层而形成密度梯度。垫层的密度经过选择而使样品中的微生物穿过垫层而样品的其它组分(例如，血液培养液，细胞碎片)仍保留于垫层的预部或并不是穿过所有的途径通过密度垫层。密度垫层也可以经过选择而从死亡微生物(不通过垫层)中分离活体微生物(其通过垫层)。合适的密度将取决于密度垫层中所使用的物质以及待分离的样品。在一个实施方式中，垫层的密度处于约1. 025 约1. 120g/mL，例如，约1. 030 约1. 070g/mL，约1. 040 约1.060g/mL或约1.025 约1. 120g/mL的任何范围。在另一实施方式中，垫层的密度为约 1. 025，1. 030，1. 035，1. 040，1. 045，1. 050，1. 055，1. 060，1. 065，1. 070，1. 075，1. 080， 1. 085，1. 090，1. 095，1. 100，1. 105，1. 110，1. 115，或 1. 120g/mL。密度垫层的物质能够是任何具有本发明所述方法的合适密度范围的物质。在一个实施方式中，这种物质是硅胶。这种硅胶可以是无涂层的(例如，Ludox (W. R. Grace, CT))或有涂层的，例如，用硅烷(例如，PureSperm (NidacorHnt' 1, Sweden)或 Isolate (Irvine Scientific, SantaAna, CA))或聚乙烯吡咯烷酮(例如，Percoll , Percol 1 Plus(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))涂层。在一个实施方式中，选择了对光谱探询产生最低干涉作用的硅胶，例如，具有最低内源荧光的物质。硅胶可以在任何合适的介质中稀释并形成合适的密度，例如，平衡的盐溶液，生理盐水，和/或0. 25M的蔗糖。合适的密度能够采用浓度约15% 约80% v/v，例如，约20% 约65% ν/ν的硅胶获得。密度垫层的另一合适的物质是碘化造影剂，例如，碘海醇(Omnipaque Nycoft·印，或Nycodenz )和碘克沙醇(Visipaque或Optift·印)。合适的密度对于学业培养基样品能够采用浓度为约10% 约25% w/v，例如，约14% 约18% w/v的碘海醇或碘克沙醇获得。蔗糖对于学业培养基样品以约10% 约30% w/v例如，约15% 约20% w/v的浓度能够用作密度垫层。其它能够用于制备密度垫层的合适物质包括低粘度、高密度油，如显微镜浸油 (例如，Type DF ；Cargilie Labs, New York)，矿物油(例如，Drakeol 5，Draketex 50， Peneteck ；PenrecoCo.，Pennsylvania)，硅油(聚二甲基硅氧烷)，氟硅油，硅凝胶，甲泛影酸盐-Ficol 1 (Lymphoft^p )，例如，对于血液培养基样品浓度约75% 约100%，泛影酸盐-葡聚糖(Polymorphoft·印)，例如，对于血液培养基样品浓度为约25 % 约50 %，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚环氧乙烷(高分子量)，PluroniC F 127,Pluronic F68, Pluronic 化合物的混合物，聚丙烯酸，交联的聚乙烯醇，交联的聚乙烯吡咯烷，PEG甲基醚甲基丙烯酸酯，果胶，琼脂糖，黄原胶，植物凝胶，Phytagel 山梨糖醇，Ficoll (例如，对于血液培养基样品浓度为约10% 约15%的Ficoll 400)，甘油，葡聚糖(例如，对于血液培养基样品浓度为约10% 约15% )，糖原，氯化铯(例如，对于血液培养基样品浓度为约 15% 约25%)，全氟碳流体(例如，全氟正辛烷)，氢氟碳流体(例如，Vertrel XF)等，这在本领域内是众所周知的。在一个实施方式中，这种密度垫层选自硅胶，碘克沙醇，碘海醇， 氯化铯，甲泛影酸盐-Ficoll ，泛影酸盐-葡聚糖，蔗糖，FicOll 400，和/或葡聚糖，及其任意组合中的一种或多种。这种密度垫层也能够由这些物质的组合构成，例如，硅胶和油的组合。上述化合物的某些组合可以对于分离和阅读本发明的步骤是有益的。例如，具有不同UV淬灭性质的化合物的组合，如氯化铯和碘海醇。密度垫层的体积/高度应该足以实现微生物从其它样品组分中分离。体积将取决于分离容器的大小和形状。一般而言，约0. 1 约5mL的体积能够使用，例如，约0. 2 约 ImL,例如，约0. 2mL 约0. 5mL。如果以微量实施分离，则密度垫层的体积能够为约1 μ L 约100μ L，例如，约5μ L 约50 μ L。样品放置或铺层与密度垫层的顶部的体积应该足以提供足够的微生物而产生适合光谱探询的球丸。一般而言，适合容器的任何体积都能够使用。例如，能够使用约0. ImL 约5mL的体积，例如，约0. 2mL 约lmL，例如，约0. 2mL 约 0. 5mL。如果以微量实施分离，则样品的体积能够为约1 μ L 约100 μ L，例如，约5 μ L约 50 μ L0对于样品在容器中的可利用空间将取决于容器的尺寸和形状。在一些实施方式中， 在将样品放置或铺层于顶部之前能够将中间层(液体或固体)放置于密度垫层的顶部而防止密度垫层和样品之间发生的任何混合。在一个实施方式中，中间层能够是聚乙烯珠。在另一个实施方式中，小气泡能够放置于密度垫层和样品之间而防止发生混合。在另外的实施方式中，密度垫层能够铺层于高密度物质(例如，全氟碳流体)的顶部而使微生物在分离和收集期间于密度垫层和高密度物质之间的界面上通过密度垫层。在本发明一个实施方式中分离容器在甩平式转头中进行离心而使微生物直接在容器底部上形成球丸。容器以足以加速度进行离心足够使微生物从其它样品组分中分离出来(例如形成的球丸)。离心加速能够是约1，000 X g 约20，000 X g，例如，约2，500 X g 约15，000 X g，例如，约7，500 Xg 约12，500 X g，等。离心时间能够是约30s 约30min, 例如，约Imin 约15min，例如，约Imin 约5min。离心能够在约2°C 约45°C，例如，约 15°C 约40°C，例如，约20V 约30！温度下进行实施。在一个实施方式中，分离容器包含封套，而封套施用于容器而在离心之前形成气密密封。封套的存在降低了处理属于或可能属于传染性的和/或危险性的微生物的危险，以及污染样品的危险。本发明方法的一个优点，是能够采用微生物在密闭容器(例如，气密性的密闭容器)内实施本发明方法的任意一个或多个步骤(例如，溶胞，分离，光谱探询，和/或标识)。本发明方法，涉及自动系统的使用，避免与处理高毒性微生物相关的健康和安全风险，从直接测试的样品中回收微生物。 在一个实施方式中，容器并未为了在密度垫层中形成密度梯度而离心足够的时间和/或力量。本发明并不涉及样品的超离心，例如，在超过约100，OOOXg下离心。而且，本发明并不涉及等密度线(平衡)沉积或分带。分离容器可以是任何具有足够容纳密度垫层和样品的体积。正如本文中指出， 与 2009 年 10 月 30 日提交的题为 “kparator Device for Use in theSeparation, Characterization and/or identification of Microorganisms"15^ ^iiii^1J
号_中相关公开的分离设备，可以应用于本发明的实践中。在一个实施方式中该容器
啮合或能够啮合至离心转子。容器体积能够为约0. ImL 约25mL，例如，约ImL 约10mL，
15例如，约2mL 约8mL。如果分离按照微量进行，容器的体积能够为约2 μ L 约100 μ L，例如，约5 μ L 约50 μ L0在一个实施方式中，容器在上部分具有宽的内部直径而容纳样品和主要的密度垫层，在收集微生物球丸的下部分具有更窄的内部直径。窄部分能够具有内径约0. 04 约0. 12in，例如，约0. 06 约0. 10in，例如，约0. 08in。款部分能够具有内径约 0. 32 约0. 40in，例如，约0. 34 约0. 38in，例如，约0. 36in。对于微量分离，内径能够更小。例如，窄部分的内径能够更小。例如，窄部分的内径能够为约0. 001 约0. 04in，例如， 约0.002 约O.Olin。锥形内径部分能够连接上下部分。锥形部分能够具有约20 约70 度，例如，约30 约60度。在一个实施方式中，下部窄部分低于容器的总高度的一半，例如， 低于容器的总高度的约40 %，30 %，20 %，或10 %。容器能够具有一个连接的封套设备或可以通过而接受封套设备(例如，封盖)而使容器能够在离心期间是气密性密闭。在某些实施方式中，容器经过设计而使微生物样品或球丸能够易于回收，或另外在分离之后手动或自动方式(而使技术人员不会暴露于容器内容物)从容器中获得或移出。例如，容器能够包含可移出部分或含球丸和能够从容器其余部分分离出的拆除部分。在另一实施方式中， 容器包含用于在分离之后接近球丸的工具，如一个或多个端口或插入注射器或其它取样器或用于吸出球丸的可渗透表面。在一个实施方式中，该容器能够是管，例如，离心管。在另一个实施方式中，该容器能够是小片或卡片。在一个实施方式中，容器是独立容器，即粉底单样品的器件。在其它实施方式中，容器是包含两个或更大分离容器的器件部分而使多个样品能够同时分离。在一个实施方式中，器件包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，20，25，30， 36，42，48，60，72，84，96，或更多个分离容器。容器能够包含由光学窗口，通过这个窗口能够进行光谱探询。光学窗口可以是在容器的底部、顶部和/或侧面。窗口能够由任何透过光(例如，至少部分近红外(OTR ； 700nm-1400nm)，紫外(UV ； 190nm-400nm)和 / 或可见光(VIS ；400nm-700nm)的光谱)的材料。合适的材料的实例包括，但不限于，丙烯酸，甲基丙烯酸酯，石英，石英玻璃，蓝宝石和/或环烯烃共聚物(COC)。在一个实施方式中，整个容器由光学窗口材质构成。在另一实施方式中，容器可以由两个或更大的分离部件制成(例如，模铸的)，如光学窗口的光学 UV-VIS-OTR透明部件和构成容器区域部分的另一材料(例如，低成本标准模铸塑料)。在一个实施方式中，光学窗口不够薄而容许光谱探询，这将取决于窗口的材质。在另一个实施方式中，光学窗口尽可能薄而降低光谱探询的干涉。例如窗口能够具有低于约0.20in，例如，低于约0. 15，0. 10，或0. 05in的厚度。在另一实施方式中，分离通过其中样品(例如溶解的样品)放置于啮合选择性过滤器或设定保留微生物的孔径的过滤器的器件中。所保留的微生物可以通过微微将何时的缓冲溶液通过过滤器而进行冲洗。冲洗的微生物随后直接在过滤器上进行光谱探询和/或通过直接在过滤器界面上取样或通过用合适的水性缓冲溶液反冲洗过滤器而回收用于光
谱探询ο光谱探询步骤一旦微生物分离、分出和/或成丸，分离的样品，分出的样品胡球丸能够进行光谱探询而标识和/或表征样品中的微生物或球丸。在一个实施方式中，光谱探询按照非侵入性模式进行，即，球丸在探询时仍同时保留于分离容器内。在另一实施方式中，分离容器在整个光谱探询期间保持密闭。按照非侵入性模式标识微生物的能力，可选地在整个分离和标识/表征过程期间与保持容器密闭耦合而自动实现一些或所有过程，避免恒定处理污染的和/或感染的样品而大大提高了整个过程的安全性。另外，通过直接光谱探询而不进一步处理样品或球丸(例如，再悬浮，熨平和菌落生长)进行表征和/或标识微生物的能力， 大大提高了完成标识/表征的速度。在一个实施方式中，样品或球丸在光谱探询之前从分离容器中回收和/或再悬浮和可选地移出。在另一实施方式中，样品或球丸在原位光谱探询之后回收和或再悬浮而随后进一步实施光谱探询。例如，能够应用于分离的微生物而不是球丸微生物的技术如胶乳凝集测试或自动表型标识测试能够在回收的和/或再悬浮的微生物上实施。在一些实施方式中，分离的样品或球丸能够进行光谱探询。在一个实施方式中， 光学光谱方法能够用于分析一种或多种微生物的内源性质，例如，微生物中存在而附加试剂不存在的性质，如染色，染料，结合剂等。在其它实施方式中，光学光谱方法能够用于分析一种或多种微生物的非内源性质，例如，那仅仅能够用附加试剂辅助下检测的性质。光谱探询能够采用，例如，荧光光谱，漫反射光谱，红外光谱，太赫兹光谱，透射和吸收光谱，拉曼光谱，包括表面增强的拉曼光谱(SERS)，空间偏转拉曼光谱(S0RQ，透射拉曼光谱和/或共振拉曼光谱进行实施。为了增强拉曼(SERQ和荧光信号，微生物能够在离心之前用金和/ 或银纳米粒子涂层，和/或内部光学表面能够用具体尺寸和形状的金属胶体进行预先涂层 (参考文献对于荧光Lakowicz，Anal. Biochem. 337 :171 0005)；对于SERS Efrima et al, J. Phys. Chem. B. (Letter) 102 :5947 (1998))。在另一实施方式中，纳米粒子在离心之前存在于密度垫层中并随着微生物通过密度垫层而与微生物缔合。在其它实施方式中，在球丸中的微生物采用质谱技术进行光谱探询，如MALDI-T0F质谱，解吸电喷雾离子化(DESI)质谱，GC质谱，LC质谱，电喷雾离子化(ESI)质谱和选离子流动管(SIFT)光谱(Selected Ion Flow Tube (SIFT) spectrometry)。在一个实施方式中，分离的样品或球丸，进行光谱探询的同时仍保留于分离容器中。分离容器能够通过容器上的光学窗口进行光谱探询。光学窗口可以处于容器的底部和/或任何侧面或多个侧面和/或顶部上。在一个实施方式中，分离容器于光谱探询的合适位置啮合或能够啮合至光度计支架。光谱探询能够通过本领域内那些技术人员已知用于有效实施检测和/标识微生物的一种或多种内源或非内源性质的任何技术进行实施。例如，正面荧光(其中激发和发射光进入和离开都是相同的表面，而如果样品一般光学上较厚时，激发光渗透到样品中的距离非常短(参见，例如，Eisinger，J. ,and J. Flores,"Front-face f luorometry of liquid 样品 s，，，Anal. Biochem. 94 :15 (1983))會邑够用于标识球丸样的微生物。其它形式的测定，如表面萤光，反射，吸收和/或散射测定，也能够应用于本发明中。在另一个实施方式中，如本文中所述，分离的样品或球丸能够移出用于光谱探询(例如，分离的样品或球丸能够移出并制备永固质谱官学探询，这在本领域内是众所周知的)。在还有的另外的实施方式中，分离的样品或球丸能够采用不只一种方式进行光谱探询。例如，分离的样品或球丸能够采用荧光光谱和拉曼光谱进行光谱探询。根据该实施方式，这些光谱探询步骤可以按序或同时进行。样品照射源，激发源，可以选自本领域内那些技术人员已知的任何许多合适的光源。产生可用数据的电磁波谱的任何部分都能够使用。能够在紫外、可见和/或近红外光谱中发射的光源，以及其它部分的电磁波谱，都能够利用而对于本领域内的那些技术人员都是已知。例如，光源可以是连续等如氘灯或氙弧灯，用于产生紫外光和/或卤钨灯用于产生可见/近红外激发。这些光源提供了宽的发射范围而具体激发波长的光谱带宽可以采用光干涉过滤器、棱镜和/或光光栅降低，正如在本领域众所周知。另外，许多窄带光源，如光发射二极管和/或激光，可以空间和/或时域多路传输而提供多波长激发源。例如，光发射二极管从MOnm 超过900nm都是可利用的而该源具有谱带宽20 40nm(在半极大处全宽度)。激光在具体波长中，从紫外至近红外都可利用而能够采用本领域内那些技术人员众所周知的多路传输方法进行应用。任何光源的光谱选择性可以通过采用光谱辨别工具如扫描单色器就能改进。其它分辨的方法可以用于，正如本领域内那些技术人员已知的，如声光滤波器，液晶可调滤波器，光学干涉过滤器阵列，棱镜摄谱仪等，及其任意组合。在选择光谱鉴频器的要素要考虑可调性的范围以及选择性的水平。以举例说明的方式，例如，鉴频器或许利用300-800nm的波长具有IOnm的选择性。这些参数一般决定实现可调范围以及选择性所需的最佳技术。典型地，光源导致样品的激发，接着在预定时间点或连续地测定样品应该的发射。 类似地，从与样品相互作用的激发源的反射光可以进行测定而提供检测和/或表征的相关数据。样品的发射光可以通过任何合适的光谱鉴频方式进行测定，最优选采用分光光度计。分光光度计可以是检测具体发射波长的扫描单色器由此从单色器产生的输出通过光电倍增管和/或分光光度计就可以设置而作为成像光谱照片由此通过成像检测器阵列如电荷耦合器件(CCD)检测器阵列检测输出。在一个实施方式中，鉴频器容许通过光检测工具 (如，光电倍增管，雪崩光电二极管，CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件(EMCCD) 检测器阵列)观察荧光和/或散射信号。光谱技术应用于获得优选作为激发-发射矩阵(EEM)测定结果的测定结果。正如本文中所用的EEM定义为荧光物质作为激发和发射波长的函数的荧光物质的发光光谱发射强度，并包括其全谱或子组，其中子组可以包含单对或多对激发/发射对。另外，EEM与固定激发波长的较差部分可以用于显示出具体激发波长的发射光谱，而与固定发射波长交叉部分用于显示样品的激发光谱。在一个实施方式中，在不只一个特定激发-发射波长对， 例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多特定激发_发射波长对处测定多重EEM0根据本发明的一个具体实施方式
，已经发现，正面荧光光谱提供了测定高度散射和高度淬灭样品的荧光和/或反射性质的优点。在一个实施方式中，正面方法可能尤其适用。例如，正面荧光可能尤其适用于高度吸收样品因为激发和发射束并不需要行进通过整个样品，而由此，可能较少地受其中可能含有的干涉组分(例如，血液细胞和微生物培养基)的影响。容器的光学表面可以以这样一个角度照射而提供本发明领域内那些技术人员己知的可接受的结果，(例如，Eisinger，J.，and J. Flores, "Front-face fluorometry of liquid Samples, ”Anal. Biochem. 94 :15-21 (1983))。在一个实施方式中，系统经过设计而使光学系统除了测定最低一个固定角度下的发射荧光之外还测定最低一个固定角度下的漫发射光。根据本发明，对于已知微生物进行了对照测定，由此容许采用本领域内那些技术人员已知的各种数学方法将所测定的测试数据与所关心的微生物的表征进行相关。例如，样品的数据可以与基线或对照测定结果利用本领域内那些技术人员已知的软件系统进行比对。更具体而言，这些数据可以通过许多多变量分析方法，如例如通用判别分析^ (General Discriminant Analysis) (GDA), fH^/Jn ^^lJ ^iJ ^v |/f ^ (Partial Least Squares Discriminant Analysis) (PLSDA),偏最小二乘回归(Partial Least Squares regression)，主成分分析(Principal Component Analysis) (PCA)，平行因素分析 (Parallel Factor Analysis) (PARAFAC)，神经网络分析(Neural Network Analysis) (NNA) 和/或支持向量机器(Support Vector Machine) (SVM)进行分析。这些方法可以用于将所关心的未知微生物基于已存在的命名分类成相关组，和/或基于有机物代谢，病原性和/或毒性分类成天然组而在设计系统中用于如前所述监控，检测和/或表征生物。在还有的另一实施方式中，来自检测系统的非-光谱测定结果，如检测时间和生长速率，能够用于辅助分离的样品或球丸的微生物表征和/或标识。另外从分离设备下部区域的照片图像选取的测定结果能够提供分离物标识的有价值的信息，如粒径，形状，颜色和密度。在本发明的一些实施方式中，分离的样品或球粒中微生物的表征和/或标识并不需要设计精确物种的标识。表征涵盖了生物学颗粒的广泛分类或分级以及单物种的实际标识。从分离的样品或球丸中分类微生物可以包含对微生物的表型和/或形态学特性的测定。例如，生物学颗粒的表征可以基于可观察的差异，如组成，形状，大小，聚集成簇和/或代谢而完成。在一些实施方式中，所关心的生物学颗粒的分类可能不但需要预先知晓咯啶生物学颗粒的特性而且需要与经验测定结果的一致相关性由此使这种方法比基于特异性结合情况或代谢反应的方法更加通用和易于可调。正如本文中所用，“标识”是指确定先前未知微生物所属的科、属、种和/或菌株。例如，将先前未知的微生物标识至科、属、种和/ 或菌株水平。在一些情况下，表征涵盖提供足够采取行动的有用信息的分类模型。正如本文中所用的优选分类模型包含分组成以下一组或多组(1)革兰氏组；( 临床革兰氏组；(3) 治疗组；(4)功能组；和( 天然内源荧光组。(1)革兰氏组在革兰氏组分类中，基于其革兰氏染饩反应和总尺寸，微生物可以归类成三大类中之一，所述组选自以下的一组或多组(a)采用革兰氏染色染色蓝黑色的革兰氏阳性微生物；(b)采用革兰氏染色染色红色的革兰氏阴性微生物；和(C)采用革兰氏染色染色蓝黑色但是其形态学特性和尺寸上与其它细菌有别的非常大的圆形细胞的酵母细胞。(2)临床革兰氏组革兰氏组可以另外分成/L组代表有区别的形杰学特征的子类。这些子类包括由有经验的实验室技师报道的所有相关临床信息，而由此提供比阳性或阴性革兰氏反应水平更高的标识。这种具体的分类是非常有益的，因为其消除了关于依赖革兰氏染色质量和/或技师通过提供与自动化系统提供相当临床相关信息而阅读涂片的技能水平的问题。更具体而言，基于这种分类模型的微生物子类可以选自以下的一种或多种(a)球菌，其是小而圆的细胞；(b)双球菌，起始两个结合至一起的小而圆的细菌；(c) 棒状菌，其是矩形形状；和(d)杆菌，起始杆状形状。这些能够通过其它形态学信息确证的子类实例包括(i)革兰氏阳性球菌；(ii)革兰氏阳性链球菌；(iii)革兰氏阳性簇式球菌 (即，“类葡萄”簇)；(iv)革兰氏阳性双球菌；(ν)革兰氏阳性杆菌；(vi)具有内芽孢的革兰氏阳性杆菌；(vii)革兰氏阴性杆菌；(viii)革兰氏阴性球杆菌；(ix)革兰氏阴性双球菌； (x)酵母；和(xi)丝状真菌。
(3)治疗组治疗组包括多种微生物物种，当从具体样本类型分离时，就用同类抗生素或抗生素混合物治疗(例如，正如描述于“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”中)。在许多情况下，对于能够充初始的经验疗法改变至更靶向疗法的临床医师，种水平的标识并不需要，因为相同选择的抗生素能够治疗不只一个种。这种分类水平正确地将这些“相同治疗”的微生物划归单个治疗类型。这种表征水平的实例包括区分高度抗药性的肠杆菌(EB)种和敏感性EB种(肠杆菌属与大肠杆菌属)，或抗氟康唑的假丝酵母种(光滑念珠菌和C.kruzei)与敏感性假丝酵母种(白色念珠菌和近平滑念珠菌)的能力，等等。(4)功能组根据本发明，微生物也可以基于代谢、毒性和/或表型特性的混合而归类于几个组中。非发酵性生物可以明显有别于发酵类的。而且，产生溶血素的微生物物种可以独立于非溶血物种进行分组。在一些情况下，这些组表示比属水平(例如，大肠杆菌类，革兰氏阴性非发酵杆菌)更宽的类型，一些在属水平(例如，肠球菌，假丝酵母)，和一些具有更近于属水平的区分(例如，凝固酶阴性葡萄球菌，α-溶血链球菌，β-溶血链球菌， 凝固酶阳性葡萄球菌，即金色葡萄球菌)。(5)天然内源荧光(“IF”)组微生物也可以基于其一起分组的天然倾向通过其先天和/或内源荧光特性划分。这些组的一些可能对治疗和功能组类型是共有的。这些分组可以包括单个种，如具有特性IF信号和/或可以包含具有相当保守的IF信号的小组生物的粪肠球菌，化脓链球菌或绿脓杆菌，如肺炎克雷伯菌-催产克雷伯菌或产气肠杆菌-阴沟肠杆菌组。除了为了标识目的测定微生物内源性质(如，内源荧光)，本发明的方法能够进一步包含其它标识剂使用用以辅助分离和/或标识过程。结合至特异性微生物的试剂，如亲合配体，能够用于分离微生物，而标识微生物的类型或物种(例如，通过结合至独特的表面蛋白或受体)和/或标识微生物的特性(例如，抗生素抗药性)。有用的标识剂包括但不限于，单克隆的和多克隆抗体及其片段(例如，对于金色葡萄球菌标识的抗-Eap)，核酸探针， 抗体(例如，青霉素，万古霉素，多粘菌素B)，适配子，肽模拟物，噬菌体衍生结合蛋白，凝集素，宿主先天免疫标记(急性时相蛋白，LPS结合蛋白，CD14，甘露糖结合凝集素，类Toll受体)，宿主防御肽(例如，防御素，杀微生物肽，猪源杀菌肽(proteogrins)，爪蟾抗菌肽)， 细菌素(例如，羊毛硫抗生素，如尼生素，美杀菌素，表皮素，鸡葡萄球菌素，乳杆菌素C和 II型肽)，细菌噬菌体和核酸的选择性染料，脂质，碳水化合物，多糖，胶囊/粘液或蛋白，或其任意组合。如果自身并没有给出可检测信号，则药物能够例如通过将药物配对结合于标记(例如，可见或荧光素)进行标记而提供可检测信号。标记包括，但不限于，荧光素，发光剂，磷光剂，放射活性剂，和/或比色化合物。这些试剂能够在本发明的方法的任何步骤中加入微生物中，例如，当获得样品时，溶胞期间，和/或分离期间。在一些实施方式中，在球丸中存在试剂能够在球丸进行光谱探询期间测定。其它有用的标识试剂包括微生物酶的底物，螯合剂，光敏剂，淬灭剂，还原剂，氧化剂，缓冲剂，酸，碱，溶剂，固定剂，清洁剂，表面活性剂，灭菌剂(例如，醇，漂白剂，过氧化氢)和有毒化合物(例如，叠氮化钠，氰化钾)和代谢抑制剂如环己酰胺等。类似地，许多用于测定微生物细胞的存活性、代谢和/或膜电位的荧光化合物可以用作本发明的标识剂。正如本领域的那些技术人员所易于理解的是，具体微生物对任何影响其物理状态或代谢的化合物，如抗生素的敏感性，能够通过将化合物加入样品、溶胞缓冲液、密度垫层或其任何混合物中而快速确定。
在本发明的一个方面中，所述方法能够进一步包含回收微生物球丸并实施另外测试的步骤。在一个实施方式中，球丸能够通过从样品培养基和密度垫层中吸出而回收。在另一实施方式中，球丸能够通过将注射器插入容器并将球丸吸出而进行回收，同时样品介质和密度垫层仍保持完整。回收的球丸随后能够再悬浮于合适介质中，例如，盐水中。一旦再悬浮，微生物能够进行任何进一步所需的测试，这对于本领域内的那些技术人员而言是众所周知的并如以上的描述。具体而言，任何需要微生物清洁样品的测试都能够进行实施。 标识测试的实例包括Vitek 2，放大和非放大核酸测试(NAT)，发色和乳胶凝集分析，免疫分析，(例如，采用标记的抗体和/或其它配体)，质谱(例如，MALDI-T0F质谱)和/或其它光学技术如红外光谱(FTIR)或拉曼光谱。其它表征测试也能够进行实施，如抗生素和/ 或其它药物抗药性。其它表征可以是在本方法的初始分离和标识步骤期间开始的测试的一部分。例如，检测金色葡萄球菌的甲氧西林抗药性能够通过在分离微生物之前将荧光标记的青霉素加入样品中而开始。一旦球丸回收而再悬浮，结合的青霉素水平就能够进行测定。在本发明的一个方面中，一些或所有的方法步骤能够自动化。本方法的步骤自动化容许大量样品进行更有效地测试而降低了人误操作处理可能包含有害和/或传染性微生物的样品带来的危险。然而，更重要的是，自动化能够将关键结果在该天或晚上任何时候进行递送而不延误。几个研究已经证明导致败血症的微生物较快标识与改进患者护理、较短的住院时间和整个费用降低都是相关的。在本发明某些实施方式中，所述方法也能够用于检测样品中微生物的存在。在这些实施方式中，所述方法包括以下步骤(a)获得样品；(b)可选地溶解所述样品中的细胞而产生溶解的样品；和(c)从所述样品其它组分中分离出微生物而形成微生物的球丸；其中球丸的存在表明微生物存在于样品中。在一个实施方式中，球丸采用裸眼检测。在其它实施方式中，球丸通过光谱探询，例如，利用光谱方法进行检测。在一些实施方式中，检测方法能够用于监控被微生物污染的样品，例如食品，药物，饮水等。在一个实施方式中，所述方法能够以重复模式实施而用于定期监控污染，例如， 一个月一次，每周一次，每天一次，每小时一次或任何其它时间模式。在另一实施方式中，样品能够按需检测，例如，当怀疑受污染时。在另外的实施方式中，检测方法能够用于在临床样品，例如，血液培养基中寻找微生物的存在。例如，样品能够在某时间点从血液培养基中移出并在样品上实施检测方法而确定是否血液培养基是阳性的。在一个实施方式中，样品可以在培养基培养之后于设定时间点取样，例如，培养之后Mh，而确定是否血液培养基是阳性的。在另一实施方式中，样品能够定期从血液培养基中取样，例如，每12，6，4，或池或每60，50，40，30，20，15，10，或5min进行取样，而在可检测阳性的短时间内标识阳性血液培养基。在检测方法的某些实施方式中，检测步骤能够可选地在如本文中描述的标识方法之前进行。在其它实施方式中，检测方法部分或完全自动化，尤其适用于涉及重复监控样品的实施方式。本发明将在以下实施例中进一步详细说明，其通过举例说明的方式提供而非预想以任何方式限制本发明。利用了在本领域内众所周知的标准技术或以下特别描述的技术。实施例实施例1.快速微生物分离和标识方法A.溶胞-离心分离过程
硅胶悬浮液(0. 2 0. 5mL ；1. 040 1. 050gm/mL密度)加入到几个圆锥形微离心管中。溶解的阳性BacT/ALERT SA血液培养液样品(0. 5 1. OmL)载入到硅胶悬浮液中。 另外，硅胶溶液能够采用针或套管加入溶胞血液培养液之下。来自含以下微生物的培养基的阳性培养液进行测试>大肠杆菌，ATCC 25922>粪肠球菌，ATCC 29212>金色葡萄球菌，ATCC 12600>绿脓杆菌，ATCC 10145将管封盖，而随后在微离心机中以约10，OOOg室温(20 25°C )下旋转aiiin。上清液吸出，随后纯化的微生物球丸再悬浮于0. 45%w/v NaCl中至光学密度@660nm为0. 40。每一悬浮液一部分转移至丙烯酸试管中并在分光荧光剂中扫描(Fluorolog 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc.，New Jersey))而测定微生物的内源荧光(MIF)。第二部分载入到Vitek 2 ID/AST 卡(bioMerieux Inc.，Missouri)上。“直接"Vitek 2结果与来自由阳性培养液亚培养的过夜生长菌落(传统方法)的悬浮液对照。 所有4个物种对直接血液培养基法和标准Vitek 法都给出优异的标识置信水平，证实密度-基分离方法提供的微生物基本上无血液和/或培养液衍生的粒子和蛋白。B.通过内源荧光原位标识的快速过程阳性血液培养瓶在标记阳性的lh，优选标记阳性的IOmin内从BacT/ALERT 微生物检测系统(bioMerieux Inc. , Missouri)中移出。将2. OmL阳性血液培养液样品加入到螺旋加盖的无菌管内 0. 5mL 的溶胞溶液(0. 75% Triton X-100-Reduced(Rohm and Haas, Pennsylvania)+。. 375%蛋白酶XXIII)中。管子简单地涡旋混合并在室温下培养5min。 溶胞培养液样品(0. 5mL)加入到含密度为1.045mg/mL的分离溶液(Isolate 硅胶30% ν/ν于0. 15Μ NaCl中)的定制微离心管(在基部具有0. 5mm厚的石英光学窗口)中。管在配备A-8-11甩头转子(Eppendorf，New York)的Eppendorf 5417R微型离心机内以约 10，OOOrmp在室温QO 25°C )下旋转anin。管从离心机中移出并转移至Fluorolog 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc. , New Jersey)分光荧光光度计的定制正面适配器。在管底部的成丸微生物的荧光立即在以下读取。数据报告于多变量分析的Excel和Matistica软件。实施例2快速微生物纯化和标识方法的评价为了评价实施例1中所描述的快速标识理念的潜力，从阳性血液培养基回收的M 个分离物(含白色念珠菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的4个物种中6个菌株)按照该方法进行测试。SPS-抗凝聚血液从三个捐献者采集并汇集。IOmL新鲜人血加入BacT/ALERT (BTA) SA血液培养基瓶(bioMerieux Inc.，Missouri)中。每一分离物的悬浮液在胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中。每瓶用0.4mL的IO3AiL悬浮液培养并将瓶子置于BTA橱中于36°C 下培养。4个含IOmL血液但是无生物的BacT/ALERT SA瓶作为阴性对照进行培养。阳性瓶在标记阳性的池内从BTA橱中移出。阴性对照瓶以每套阳性瓶移出(按种类)。一个瓶在某时从BTA橱移出以使它们变成阳性。2. OmL的阳性血液培养液的样品采用3mL注射器和18G针移出，而立即加入到无菌螺旋加盖的玻璃管中的5mL溶胞缓冲液 (0. 75% w/ν Triton X-IOO-Reduced(Fluka))中。该管简单地涡旋混合并在室温下培养5min。向预先载入55 μ L分离溶液(30% v/v Isolate 在0. 15M NaCl中)的定制毛细管微离心管(毛细管部分底部含有0. 5mm石英光学窗口)中加入0.5mL的溶胞培养液样品部分。微离心管在配备A-8-11甩头转子 (Eppendorf，New York)的Eppendorf 5417R微离心机中于22°C下以 10，OOOrpm离心2min。 管从离心机中移出并转移至Fluorolog 3(H0RIBA Jobin Yvon Inc.，New Jersey)分光荧光光度计的定制正面适配器。在管底部成丸的纯化微生物的荧光立即采用5min定制程序立即读取。数据报告于化学计量学分析和分离物分类的Excel和Matistica软件。分类模型的优化关于标准化和未标准化的数据而采用留一法交叉验证进行实施。 结果如表1所示。在表中，“#步骤”是指采用“留一法”较差验证方法产生最高灵敏度的区分分析步骤数。在缺乏数据标准化下，正确标识菌株的百分数为82.6%。最佳结果(约 96%的正确标识)在数据标准化成瑞利散射点、胶原区域或吡哆胺峰时获得，但是改进的结构通过标准化至NADH、色氨酸和黄素峰仍能获得。表1
数据标准化原理/荧光团%在X-Val上的正确率#步骤未n/a82. 62320—320散射95. 72320—405胶原95. 76300—400吡哆胺95. 78345—460NADH91. 010285_350色氨酸87. 01465—515黄素87. 03实施例3.溶胞缓冲液的评价实验实施而评价分离效能和用严格和温和溶胞缓冲液处理的新鲜阳性肺炎链球菌WM-43血液培养液的微生物内源荧光(MIF)曲线图。以下溶胞缓冲液制剂进行了测试 (A) 2. 0% TX100-R 在 0. 5M CAPS, pH 11. 7 (严格=LB-A)中；(B) 0. 75 % TX100-R 在 0. 5M CAPS, pH 111. 7(温和=LB-B)中；禾口(C) 0. 45% TX100-R 在 0. 3M CAPS, pH 11.7(温和= LB-C)中。1. OmL溶胞缓冲液A和B与2. OmL溶胞缓冲液C置于螺旋加盖管中并将管放置于37°C水浴中的支架上。样品培养液G.OmL)采用5mL注射器和18G针在BTA系统中在标记阳性的5min内从肺炎链球菌WM43-阳性BacT/ALERT SA培养瓶中取出。培养液快速分散于每一含溶胞缓冲液的管中并将管加盖并涡旋振荡约^。来自溢出(15mL血液)阴性对照BacT/ALERT’ SA瓶的测试培养液也取样测定溶胞和分离步骤效能。管子回到37°C水浴中lmin。管子从水浴中取出并将0. 5mL溶胞液重叠加于含200 μ L的14% w/v的碘海醇密度垫层的预载入分离管中。管子在配备A-8-11甩头转子(Eppendorf，New York)的 Eppendorf 5417R微离心机中于 25°C下以 10，OOOrpm(约 10，OOOXg)离心 2min。采用 LB-B 的分离管下部区域的照片如图1所示。注意当溢出(15mL血液)阴性对照培养液进行处理时不存在任何球丸。在完成离心之后立即在Fluorolog 3(H0RIBA Jobin Yvon Inc. , New Jersey)分光荧光光度计中采用双重30度管适配器，pMTorr检测器和“全EEM”读取管扫描文件Smin扫描)读取管子。来自单个样品的EEM光谱的实例显示于图2A 2C中。图2A 2C中所示的肺炎链球菌球丸的内源荧光EEM曲线与细胞存活力结果相关性充分。阳性培养液用0.40%的含TX100(最后浓度)溶胞缓冲液(LB-Α;严格缓冲液) 处理，尽管在所有的三种球丸中出现类似的色氨酸信号，相比于用较温和的两种含0. 15% 的TX100 (最终浓度)的缓冲液处理导致肺炎链球菌存活力下降30倍而峰NADH荧光下降 5倍。与降低、微生物存活力有关的另一变化是峰黄素荧光的提高(表幻。降低的NADH和提高的黄素荧光在图2A中是显而易见的。表2肺炎链球菌球丸内源荧光信号
权利要求
1.一种从测试样品中表征和/或鉴定标识微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)选择性地溶解所述测试样品中的非微生物细胞以产生溶解的样品；(c)将微生物与所述溶解样品的其它组分分离以形成微生物的分离样品；(d)利用光谱探询所述分离的微生物以产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过比较所述光谱测定结果与已知的微生物所取得的光谱测定结果，或预测的光谱性质表征和/或标识所述分离的样品中的所述微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)和(d)在密闭容器中实施而其中所述探询步骤(d)是非侵入性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱测定结果源自荧光光谱和拉曼光谱。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱选自由荧光光谱，漫反射光谱，吸收和透射光谱，红外光谱，太赫兹光谱，及其任意组合组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中荧光光谱以正面模式进行测定。
6.根据权利要求1所述的方法，其中标识基于所述微生物的内源荧光。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述光谱包括测定激发-发射矩阵(EEM)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述EEM与已知微生物的EEM数据库进行比较。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物基于一种或多种表型特性和/或形态学特性进行表征。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物基于检测时间，生长速率和微生物颗粒粒径，形状，颜色和/或密度中的一种或多种测定结果进行表征。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物表征到一种或多种选自由革兰氏组， 临床革兰氏组，治疗组，功能组和天然内源荧光组组成的组的分类模型中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物标识至属的水平，种的水平，或菌株水平。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性的溶解步骤(b)通过超声波溶解，渗透压震扰，化学处理，或其组合实施。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性的溶解步骤(b)采用包含一种或多种清洁剂的溶胞溶液实施。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种清洁剂选自由Triton X-100， Triton X-100-R, Triton X-114, NP-40，Genapol C-100, Genapol X_100，Ig印al CA 630，Arlasolve 200, Brij 96/97，CHAPS，辛基 β _D_ 葡萄糖苷，皂素，九乙二醇单十二烷基醚(C12E9，聚桂醇)，十二烷基硫酸钠，N-月桂酰肌氨酸，脱氧胆酸钠，胆汁盐，十六烷基三甲基溴化铵，SB3-10, SB3-12，氨磺酰基甜菜碱(amidosulfobetaine)-14, C7Bz0, Brij 98, Brij 58, Brij 35, Tween 80, Tween 20, Pluronic L64, Pluronic P84,磺基甜菜碱(NDSB 201)，氯胺苯醇(PMAL-C8)，以及甲基-β-环糊精组成的组。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述清洁剂是包含结构C12_18/E9_1(i的聚氧乙烯清洁剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述聚氧乙烯清洁剂选自由Brij 97，Brij 96V, Genapol C-100, Genapol X-IOO 和聚桂醇组成的组。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述溶胞溶液进一步包含一种或多种酶，所述一种或多种酶包含一种或多种蛋白酶和一种或多种核酸酶的混合物。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述溶胞溶液包含一种或多种缓冲剂。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤(c)是过滤实现的，而所述过滤产生分离的微生物样品。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶解的样品在所述容器内以密度垫层分层， 而其中所述容器进行离心而形成微生物颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述密度垫层包含硅胶，含碘造影剂，蔗糖，显微镜浸油，矿物油，硅油，氟硅油，硅凝胶，甲泛影酸盐-Ficoll ，泛影酸盐-葡聚糖，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚环氧乙烷(高分子量)，Pluronic F127, Pluronic F68，聚丙烯酸，交联的聚乙烯醇，交联的聚乙烯吡咯烷，PEG甲基醚甲基丙烯酸酯，果胶，琼脂糖，黄原胶，植物凝胶，Phytagel ，山梨醇，Ficoll ，甘油，葡聚糖，糖原，氯化铯，全氟碳流体，和 /或氢氟碳流体中的一种或多种。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品是已知包含微生物的培养基样品。
24.—种从血液培养基中表征和/或标识微生物的方法，包括(a)从已知包含或可能包含微生物的血液培养基中获得样品；(b)选择性地溶解所述样品中非微生物细胞以产生溶解的样品；(c)将所述溶解的样品在密闭容器中以密度垫层分层；(d)将所述容器离心，以将所述微生物与所述样品的其它组分分离并形成微生物颗粒；(e)利用光谱探询所述分离的微生物以产生所述微生物的光谱测定结果；和(f)通过将光谱测定结果与已知微生物测定的光谱测定结果，或预测的光谱性质比较来表征和/或标识所述分离的样品中的所述微生物。
25.一种表征和/或标识微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)将所述测试样品放置于密闭容器中；(c)将所述微生物与所述测试样品的其它组分原位分离以在所述密闭容器中形成所述微生物的分离样品；(d)光谱探询所述原位分离的微生物以产生所述微生物的光谱测定结果；和(e)通过比较光谱测定结果与已知的微生物检测的光谱测定结果，或预测的光谱性质来表征和/或标识所述分离的样品中的所述微生物。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱测定结果源自荧光光谱和拉曼光谱。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述光谱选自由荧光光谱，漫反射光谱，吸收和透射光谱，红外光谱，太赫兹光谱，及其任意组合组成的组。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述标识基于所述微生物的内源荧光。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述光谱包括测定激发-发射矩阵(EEM)并且其中所述EEM与已知的微生物的EEM数据库进行比较。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述分离步骤(c)是通过离心或过滤实现的。
31.根据权利要求25所述的方法，其中，所述样品在所述容器内以密度垫层分层，其中所述容器进行离心以形成微生物颗粒。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述密度垫层包含硅胶，含碘造影剂，蔗糖，显微镜浸油，矿物油，硅油，氟硅油，硅凝胶，甲泛影酸盐-Ficoll ，泛影酸盐-葡聚糖，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚环氧乙烷(高分子量)，PluroniC F 127，PluroniC F68，聚丙烯酸，交联的聚乙烯醇，交联的聚乙烯吡咯烷，PEG甲基醚甲基丙烯酸酯，果胶，琼脂糖，黄原胶，植物凝胶，Phytagel 山梨糖醇，Ficoll ，甘油，葡聚糖，糖原，氯化铯，全氟碳流体， 和/或氢氟碳流体中的一种或多种。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物基于一种或多种表型特性和/或形态学特性进行表征。
34.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物基于检测时间，生长速率和微生物颗粒粒径，形状，颜色和/或密度中的一种或多种测定结果进行表征。
35.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物表征为一种或多种选自由革兰氏组，临床革兰氏组，治疗组，功能组，以及天然内源荧光组组成的组的分类模型。
36.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物标识至属的水平，种的水平，或菌株水平。
37.根据权利要求25所述的方法，其中所述测试样品是已知包含微生物的培养基样 O
全文摘要
本发明涉及用于分离，表征和/或标识测试样品中的微生物的方法。本发明的方法包括一个用于溶解可能存在于测试样品中的非微生物细胞的可选溶解步骤，接着的一个后续分离步骤。所述方法可用于从复杂样品如含血液培养基中分离，表征和/或标识微生物。本发明进一步提供了所述分离的微生物样品的光谱探询而产生所述微生物的测定结果并采用所述光谱测定结果表征和/或标识所述样品中的所述微生物。
文档编号G01N21/65GK102203588SQ200980143430
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月30日 优先权日2008年10月31日
发明者克里斯多夫·罗恩斯克, 布拉德福德·克莱, 琼斯·海曼, 瑟曼·索普, 约翰·沃尔什 申请人:生物梅里埃公司