专利名称：牵涉血红素结合蛋白1的方法和用途的制作方法
牵涉血红素结合蛋白1的方法和用途本发明涉及一种筛选内皮NO合酶(eNOQ表达的调控剂的方法、一种在受试者中诊断心血管疾病的方法、HEBP-I用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病 (特别是心血管疾病)的药物的用途、HEBP-I用于检测eNOS信号转导的成分的用途、及 HEBPl用于调节eNOS启动子活性的用途。氧化氮合酶(EC 1. 14. 13. 39 ；N0S)于1998年被发现，并且在那一时期，不知道其产物氧化氮(NO)的生理学重要性，氧化氮(NO)是哺乳动物中最小的生物活性分子。同时， 发现NO是调节心血管系统中的血管紧张度方面的一种重要的信使，在中枢神经系统中作为第二信使和作为针对细菌和肿瘤细胞的防御机制。在1989年，诺贝尔医学奖授予Robert FurchgottJerid Murad和Luis J. Ignaro，他们将NO鉴定为哺乳动物细胞的信使。NOS是由不同基因编码的相关酶的一个家族的成员。NOS是生物学中最受调节的酶之一。有三种已知的同等型，两种是组成性的(cNOS)，而第三种是诱导型的(iNOS)。NOS 酶的克隆指明cNOS包括脑组成性(N0S1、nNOS或神经元N0S)和内皮组成性(N0S3、eNOS、 cNOS或内皮N0S)基因两者，第三种是诱导型(N0S2、iN0S或诱导型N0S)基因。在脑中，nNOS是一种具有161kDa分子量的可溶性酶，并且代表最大的NOS同等型。 此同等型主要在神经元细胞中和在脑中组成性表达，而且仅生成低量的N0。对酶活性的调节经由钙调蛋白受Ca2+介导。然而，其酶活性还经由Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶2及蛋白激酶A、C和G受磷酸化影响。在脑中，NO对于调节突触处的信号处理(transaction)是重要的。外周血管和平滑肌细胞常常受释放NO并对交感神经系统起拮抗作用的神经神经支配。另外，在骨骼肌中检测出大量的nNOS，其中NO控制肌肉收缩性和局部血流。诱导型NOS在巨噬细胞中表达，但是也在细菌LPS或细胞因子诱导后在其它细胞中表达。与nNOS—样，iNOS是一种具有131kDa分子量的大部分可溶的蛋白质，其释放巨量的NO。iNOS在转录方面受多种刺激调节。诱导其表达后，NO释放起巨噬细胞的细胞毒性原理作用，其通过破坏微生物和寄生物及肿瘤细胞来实现。然而，NO也可以攻击健康体细胞，而且诱导对周围组织的损害。大多数炎性和自身免疫性疾病特征在于巨量活化的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的存在。此外，iNOS在感染性休克的病理学中也是重要的，所述感染性休克特征在于大面积动脉血管舒张、低血压和微血管损伤。最后，内皮NOS负责大部分血管生成的N0，其针对动脉硬化和血栓形成提供保护。 完整的eNOS在血管稳态的生理学维持中构成中枢关键，而且在心血管系统的病理生理学中发挥关键作用。血管内皮中的eNOS释放NO在基础条件由一系列受体激动剂诸如缓激肽、乙酰胆碱和组胺的刺激及流动血液的剪应力介导。NO通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶并提高平滑肌细胞中的cGMP浓度来导致所有类型的血管扩张。因而，来自内皮细胞的NO是交感神经系统或肾素-血管紧张素系统进行血管收缩的一种重要的内源血管扩张对应物。在其血管扩张特性外，内皮NO具有一系列的血管保护和抗硬化特性。向血管腔释放的NO是血小板聚集和粘附于管壁的一种有力的抑制剂。除了针对血栓形成提供保护外， 抑制生长因子自血小板的释放，这可以刺激平滑肌细胞的增殖。在家兔和小鼠中，显示了对 eNOS的遗传或药理学抑制导致进行性动脉硬化。此外，内皮NO可以调控牵涉动脉生成的基因的表达。这特别适用于来自单核细胞的趋化性蛋白质(MCPl)、表面分子诸如⑶11/⑶18、 P-选择蛋白、血管细胞粘附分子I(VCAM-I)和胞内粘附分子(ICAM)l。因而，阻止脂细胞在管壁中的粘附和浸润，由此针对动脉生成的早期阶段提供保护。此外，NO抑制血管平滑肌细胞的增殖、有丝分裂发生和DNA合成。假定抗增殖效果是由cGMP介导的。此外，NO可以通过蛋白质的S-亚硝基化而具有直接效果，诸如通过胱天蛋白酶3的亚硝基化实现的内皮细胞中的抗凋亡效果。已经将一系列心血管疾病与由于NO的合成降低和/或降解增加所致的生物可用性NO缺乏联系起来。其它经典的症状和疾病包括低胆固醇血、糖尿病、高血压和由吸烟介导的不利影响。如上文所详述的，不同心血管疾病的病理学通常基于由于内皮功能异常所致的NO缺乏。NO生物活性可以是由于eNOS的表达和/或活性降低、eNOS解耦、NO降解增加或NO效应器系统的响应性降低。用有机硝酸盐进行的保守疗法由于释放巨量的NO而与多种缺点有关。特别在永久性药疗上，观察到硝酸盐效果的显著降低，这称为“硝酸盐耐受”。6-8小时的无硝酸盐时段是必要的，以获得硝酸盐的全部效果。另外，典型的不利影响是硝酸盐头痛、皮肤变红 (“潮红”)和伴有反射性心动过速的血压强烈降低的风险。因而，鉴定用于永久疗法的新药物(其可以诱导功能性eNOS的表达，而且与硝酸盐形成对比，其可以永久性提高生物可用性NO的量)是一种令人感兴趣的且有价值的研究目标。由于其在动物(包括人)身体中的重要生理学和病理生理学功能，检测调控eNOS活性的新方式是重要的。因而，本发明的一个目的是检测调控eNOS活性的备选机制。令人惊讶的是，发现血红素结合蛋白I(HEBPl)牵涉eNOS表达的激活。具体地，发现在通过RNA技术关闭HEBPl时，eNOS启动子的活性显著降低。因而，可以使用与HEBPl相互作用的手段和方法以调节或改变eNOS启动子活性和 /或eNOS表达。因此，在第一个方面，本发明涉及一种筛选内皮NO合酶(eNOQ表达的调控剂的方法，该方法包括-提供包含血红素结合蛋白1(HEBPl)或其功能活性变体的测试系统，-使所述测试系统与药剂接触，并-检测所述药剂对所述测试系统的影响，由此将所述药剂鉴定为eNOS表达的调控剂。如上文所详述的，eNOS (又称为氧化氮合酶3 (N0S3))在血管中生成N0，而且牵涉调节血管功能。它特异性地在不同动脉和静脉内皮细胞类型中表达。然而，还可以显示， eNOS在人胎盘、肾小管肾上皮细胞和家兔的结肠细胞中表达，而且还在大鼠海马和其它脑区的神经元中检测出eNOS免疫反应。与iNOS相比，eNOS是组成性表达的，并且释放低量的N0。酶eNOS以同二聚体存在，其中每个单体由数个亚基构成(iNOS的示意图显示于 Forstermann 和 Monzen，2006，Circulation 113 :1708-1714)。C 端还原酶域结合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，而且与钙调蛋白结合域及加氧酶域连接。加氧酶域具有前列腺血红素基团，并且结合6(R)-5，6，7， 8-四氢生物蝶呤(BH4)、分子氧和L-精氨酸。单体的还原酶域与第二个单体的N端加氧酶域连接。所有NOS同工酶催化黄素介导的自C端结合的NADPH至N端域的血红素的电子转移。通过钙诱导的自钙调蛋白结合NOS来增加还原酶域中自NADPH至黄素以及自还原酶域至加氧酶域的血红素的电子转移。在血红素基团上，电子用于还原和活化分子氧。L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸经由生成『-羟基-L-精氨酸(NOHLA)作为中间体的两个连续的单氧合反应发生，由此生成NO。如上文所详述的，内皮NO合酶(eNOS)功能异常牵涉一系列疾病。可以证明，eNOS 表达在多种疾病中是降低的，所述疾病包括心血管疾病诸如心力衰竭和心肌梗死。令人惊讶的是，已经发现了血红素结合蛋白I(HEBPl)是一种特别通过与eNOS启动子相互作用来调控eNOS表达的因子。可以使用此实情以检测eNOS表达的调控剂，其形成潜在的用于治疗以eNOS表达改变为特征的疾病的治疗剂。所要求保护的筛选调控剂的方法包括提供包含HEBPl的测试系统。如本发明的上下文中所显示的，HEBPl是一种与eNOS启动子相互作用，并且由此改变eNOS表达的蛋白质。 HEBPl也称作血红素结合蛋白1、HBP、HEBP或p22HBP。假定HEBPl可以在结合可存在于细胞中的游离卟啉原中起作用，并且如此促进这些潜在地毒性化合物的除去。它以高亲和力结合一分子的血红素或卟啉，其中它对金属卟啉、游离的卟啉和N-甲基原卟啉具有相似的亲和力。人蛋白质的氨基酸序列由189个氨基酸组成，并且于PubMed以登录号NP_057071 可获得。然而，HEBPl蛋白也可以自任何其它物种衍生，而且已经发表了其它物种的 HEBPl蛋白序列。例子包括小鼠(musculus)(登录号NP_038574，称为Hebpl)、黑猩猩 (pan troglodytes)(登录号 XP_5^742，称为 L0C473371)、原鸡(Gallus gallus)(登录号 NP_001025925，称为 RCJMB04_2k3)、家犬(Canis familiar is)(登录号 XP_534884，称为 N0C477690)和褐鼠(Rattus norwegicus)(登录号 XP_342776，称为 HEBP1_ 预测)。在任何天然存在的HEBPl变体诸如物种变体或剪接变体外，也可以使用经修饰的 HEBPl蛋白。应当注意到，经修饰的HEBPl蛋白或HEBPl变体是功能活性变体，因为变体维持其与eN0S启动子相互作用并调控eNOS表达的生物学功能。优选地，生物学功能的维持 (例如调节eNOS表达)定义为具有天然存在的HEBPl的调控剂活性的至少50%，优选地至少60 %，更优选地至少70 %、80 %或90 %，还更优选地95 %。可以如实施例，特别是实施例 1、2、3或4中所描述的那样测定生物学活性(例如通过使用eNOS启动子报告细胞系诸如 EA. crs03或经生物素标记的转录增强剂诸如A012或A013或用于测定mRNA水平诸如eNOS mRNA的RT-PCR或猝灭色氨酸荧光或荧光偏振或动物模型来进行)。变体可以是具有构成天然存在的HEBPl蛋白的域和至少一种别的构件的分子。例如，蛋白质可以与标志物诸如用于纯化目的的标签(例如6 His (或6xHis)标签、Str印标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)偶联。如果例如应当需要高度纯化的HEBPl蛋白或变体，那么可以使用双重或多重标志物(例如上述标志物或标签的组合)。在此情况中，在两个或更多个分开的层析步骤中纯化蛋白质，在每种情况中，利用第一标签的亲和力，然后利用第二标签的亲和力来进行。此类双重或串联标签的例子是GST-His 标签(与多组氨酸标签融合的谷胱甘肽-S-转移酶),BxHis-Strep标签(与Str印标签融合的6个组氨酸残基),6xHis-tagl00-标签(与哺乳动物MAP激酶2的12个氨基酸的蛋白质融合的6个组氨酸残基)、8XHis-HA标签(与血细胞凝集素表位标签融合的8个组氨
5酸残基)、His-MBP (与麦芽糖结合蛋白融合的His标签)、FLAG-HA标签(与血细胞凝集素表位标签融合的FLAG标签)、和FLAG-Strep标签。可以使用标志物以检测加有标签的蛋白质，其中可以使用特定抗体。合适的抗体包括抗HA(诸如12CA5或3F10)、抗6 His、抗 c-myc和抗GST。此外，HEBPl蛋白可以与不同种类的标志物诸如荧光标志物或放射性标志物(其容许检测HEBP1)连接。在又一个实施方案中，HEBPl可以是融合蛋白的一部分，其中可以使用第二部分来检测，诸如具有酶活性的蛋白质构件。在本发明的另一个实施方案中，HEBPl变体可以是HEBP片段，其中该片段仍能够与eNOS启动子相互作用，并调节eNOS表达。这可以包括具有短的C-和/或N端删除(例如至多 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或 1 个氨基酸的删除)的 HEBPl蛋白。另外，可以进一步修饰HEBPl片段，如上文对HEBPl蛋白所详述的。或者/另外，如上文所描述的HEBPl蛋白或其变体可以包含一处或多处氨基酸替代，特别在不牵涉与eNOS启动子相互作用并调节eNOS表达的区域中。然而，优选保守氨基酸替代，其中将氨基酸用化学上相关的氨基酸替换。典型的保守替代在脂肪族氨基酸间、在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸间、在具有酸性残基的氨基酸间、在酰胺衍生物间、在具有碱性残基的氨基酸间、或具有芳香族残基的氨基酸间发生。可以修饰具有替代的HEBPl蛋白或片段或变体，如上文对HEBPl蛋白或片段或变体所详述的。除非另有规定，在本发明的以下描述中，关于HEBPl蛋白给出的所有详情也涉及其功能活性变体。然而，最优选地，HEBPl蛋白是天然存在的HEBPl蛋白，还更优选地，天然存在的人 HEBPl蛋白。如上文所详述的，测试系统包含HEBPl蛋白或其功能活性变体。测试系统还可以包含别的元件诸如用于检测调控剂对测试系统的影响以将药剂鉴定为eNOS表达的调控剂的手段。适合于检测调控剂影响的手段遍及本说明书详述。测试系统可以在细胞系统或无细胞系统中，在占优势的条件下视情况而定。对于本发明的方法，使包含HEBPl或其功能活性变体的测试系统与药剂接触。用本发明的方法测试的药剂可以是具有任何化学性质的任何测试物质或测试化合物。它可以已经被认为是用于疾病的药物或药剂。或者，它可以是在另一个实施方案中尚不知道具有治疗效果的已知化学化合物，并且化合物可以是新的或迄今未知的化学化合物。药剂也可以是测试物质或测试化合物的混合物。在本发明的筛选方法的一个实施方案中，以化学化合物文库形式提供测试物质。 化学化合物文库包括多种化学化合物，而且已经从多种来源(包括化学合成的分子或天然产物)之任一种装配，或者已经通过组合化学技术来生成。它们尤其适合于高通量筛选，并且可以由特定结构的化学化合物或特定生物体诸如植物的化合物组成。在本发明的上下文中，优选地，化学化合物文库是包含蛋白质和多肽或小有机分子的文库。优选地，小有机分子在大小上小于500道尔顿，特别是可溶性非寡聚体有机化合物。在本发明的上下文中，使测试系统与药剂接触，其时间和条件适合于调控eNOS表达并对其检测。合适的条件包括合适的温度和溶液以避免例如所牵涉的蛋白质变性或者以维持活细胞(若存在的话)。合适的条件会取决于选择的具体测试系统，并且技术人员基于其一般知识会能够对其选择。使测试系统与药剂接触后，检测药剂对测试系统的影响。在下文中，会更为详细地描述一系列不同检测系统。然而，应当理解，这些是例示性的，并且其它测试系统也可以是合适的。若药剂对测试系统具有特定的且显著的影响，则将药剂鉴定为eNOS表达的调控剂。在本发明的上下文中，eNOS表达调控剂意指改变，即提高或降低eNOS表达的药剂。优选地，提高eNOS表达。在本发明的上下文中，若与调控剂接触的合适细胞中的eNOS表达分别显著低于或高于对照(即没有与调控剂接触的相同细胞)的eNOS表达的话，eNOS表达与对照相比得到修饰，即降低或优选地提高，。本领域技术人员知道用于评估两个数值是否彼此显著不同的统计学规程诸如Student氏t检验或卡方检验。在一个优选的实施方案中，eNOS表达相当于对照的至少110%、优选地至少 125%、更优选地至少150%、160%、170%、180%或190%，还更优选地至少200%，且最优选地至少300%。然而，本发明的方法不要求在所述方法内测定调控剂对eNOS表达的影响。注意到，筛选方法可以涵盖或不涵盖测量eNOS表达的步骤。或者，为了测量eNOS表达，可以使用指明调控eNOS表达的检测方法。尤其对于高通量筛选，使用非常容易且有力的检测系统可以是优选的，所述系统包含尽可能少的成分。在本发明的一个实施方案中，测试系统可以仅包含HEBPl蛋白(或其功能活性变体)和在没有牵涉HEBPl和eNOS的信号转导的别的成分的情况中检测药剂/调控剂结合蛋白质的手段。例如，此类系统可以是如下的系统，其中将要测试的药剂或HEBPl蛋白或其功能活性变体固定化于载体上。可以检测药剂对HEBPl 蛋白或其功能活性变体的结合，由此用可检测标志物标记未固定化的结合配偶。可以将固定化的成分固定化于单一材料上或多种不同材料上，所述材料能够基于其物理特征结合一种生物分子或多种生物分子。此类材料包括但不限于阴离子交换材料、阳离子交换材料、金属螯合剂、肽、抗体、聚合物(合成的或天然的)、纸等。可以使固定化的成分与可移动的(即未固定化的)潜在的结合配偶接触，其中在足以容许结合的时间后除去未结合的可移动结合配偶。可以检测可移动的和固定化的成分的结合，这是由于在固定化的配偶的固定化位置处存在可移动结合配偶的标志物。例如，可以将一系列不同药剂诸如蛋白质固定化于多孔板中，并可以与经标记的HEBPl蛋白一起温育。在那些检测出标志物的孔中，发生药剂与HEBPl蛋白之间的结合。可以将相应的药剂鉴定为潜在的eNOS表达调控剂。可以以多种方式标记成分，特别是蛋白质以容许充分的检测或纯化。可以使用常见的标记方法来标记成分表面上的一种或多种功能基团。对于蛋白质，这些可以是例如伯氨基团，其存在于每条多肽链的N端和赖氨酸残基的侧链；巯基基团，其存在于通过用还原剂处理二硫键或者通过用诸如SATA等试剂修饰赖氨酸残基可获得的半胱氨酸残基上；或碳水化合物基团，其通常存在于抗体的Fc区中，所述碳水化合物基团可以氧化以创建供偶联用的活性醛。可以用一系列不同试剂，诸如生物素(对于亲合素-生物素化学)、酶、用于标记胺、巯基或其它功能基团的活化的荧光染料例如FITC、荧光素、罗丹明、Cy染料或 Alexa fluos来标记成分或蛋白质。也可以使用放射性标记物诸如3H、32P、35S、125I或wC及常见的酶标记物，包括青霉素酶、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。对于本发明的方法，可以使用任何合适的检测。可以根据要测试的药剂和测试系统的特征来选择合适的方法。如上文所详述的，HEBPl牵涉eNOS表达的信号转导。因而，可以测定药剂与HEBPl (或其变体)或HEBPl信号转导中的上游成分的相互作用。可以直接或间接测定相互作用。“直接地”意味着测定药剂对HEBPl的结合(例如，使用标记的标志物以检测HEBPl/药剂复合物来进行)。“间接地”意味着测定信号转导中的下游HEBPl的影响(例如eNOS启动子的活性、eNOS mRNA水平或eNOS蛋白的量)。合适的方法在例如实施例中详述。在第一种情况中，测量药剂蛋白质相互作用。一系列测试是本领域中已知的，其中可以使用测试系统，并可以使测试系统适合所述测试。这可以是异质或同质测定法。如本文中所使用的，异质测定法是包括一次或多次清洗步骤的测定法，而在同质测定法中，此类清洗步骤不是必需的。仅将试剂和化合物混合并测量。在一个实施方案中，测定法是ELISA (酶联免疫吸附测定法)、DELFIA (解离增强镧系元素荧光免疫测定法)、SPA(闪烁亲近测定法)、Flashplate测定法、FRET (荧光共振能量转移)测定法、TR-FRET (时间分辨荧光共振能量转移)测定法、FP (荧光偏振)测定法、 ALPHA(放大发光亲近同质测定法)、EFC(酶片段互补)测定法、双杂交测定法或共免疫沉淀测定法。多家公司提供基于ELISA(酶联免疫吸附测定法)的测定法。它是一种用于检测样品中的抗体或抗原存在的生物化学技术。实施ELISA牵涉至少一种对特定抗原(例如第一或第二蛋白质的区段)具有特异性的抗体。一般地，将样品中未知量的抗原固定化于表面上。然后，用特定抗体清洗表面。此抗体与生成可检测信号诸如颜色变化或荧光的酶连接。 例如，将具有未知量的抗原的样品非特异性(经由对表面的吸附)或特异性(经由对相同抗原特异性的另一种抗体的捕获，在“三明治式”ELISA中)固定化于固体支持物(通常为微量滴定板)上。将抗原固定化后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体可以与酶共价连接，或者自身可以通过经由生物偶联与酶连接的二抗检测。每个步骤之间，通常用温和的去污剂溶液清洗平板以除去任何非特异性结合的蛋白质或抗体。最终的清洗步骤后， 通过添加酶底物来使平板显色以产生可见信号，其指明样品中的抗原数量。较老的ELISA 利用生色底物，虽然较新的测定法采用具有高得多的灵敏度的荧光底物。基于DELFIA (解离增强镧系元素荧光免疫测定法)的测定法是固相测定法。通常用铕或另一种镧系元素标记抗体，并在洗去未结合的经铕标记的抗体后检测铕荧光。SPA (闪烁亲近测定法)和Flashplate测定法通常利用生物素/亲合素相互作用来捕获经放射性标记的底物。一般地，反应混合物包括激酶、生物素化的肽底物和Y-[33P] ATP。反应后，通过链霉亲合素捕捉生物素化的肽。在SPA检测中，将链霉亲合素在含有闪烁体的珠上结合，而在Flashplate检测中，将链霉亲合素结合至含有闪烁体的微板的孔内部。一旦固定化，经放射性标记的底物与闪烁体接近得足以激发光的发射。荧光共振能量转移(FRET)描述了两个生色团之间的放射-自由能转移。处于其激发状态的供体生色团可以通过非放射性远程偶极子-偶极子耦合机制将能量转移至极其接近(通常< lOnm)的受体荧光团。因为这两种分子是荧光性的，所以能量转移经常称为“荧光共振能量转移”，尽管能量实际上不通过荧光转移。FRET是一种检测和量化蛋白质-药剂相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用、和蛋白质-构象变化的有用工具。为了监测蛋白质与药剂、一种蛋白质与另一种或蛋白质与DNA的结合，用供体标记分子之一，并用受体标记另一个，并混合这些经荧光团标记的分子。在它们以未结合状态存在时，在供体激发后检测到供体发射。在分子结合后，使供体和受体接近，并主要观察到受体发射，这是由于从供体至受体的分子间FRET。适合于FRET的邻居是本领域中已知的，而且熟练从业人员会能够选择适合于两种抗体的标记物组合。如本文中关于供体和相应的受体所使用的，“相应的”指具有与供体的激发光谱交叠的发射光谱的受体荧光模块。 然而，这两种信号彼此应当可分开。因而，受体的发射光谱的波长最大值应当比供体的激发光谱的波长最大值大优选至少30nm，更优选地至少50nm，诸如至少80nm，至少IOOnm或至少 150nm(还可参见实施例3. 1)。可以在FRET技术中与各种受体荧光模块一起使用的代表性供体荧光模块包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4_乙酰氨基-4’ -异硫氰酸芪_2，2’ - 二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’ -异硫氰苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚氨基 1-芘丁酸酯、和4-乙酰氨基-4’ -异硫氰酸芪-2，2’ - 二磺酸衍生物。代表性受体荧光模块(取决于所使用的供体荧光模块)包括LC-Red610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5, Cy5. 5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明χ异硫氰酸酯、 赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙烯三胺五乙酸酯或镧系元素离子(例如铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光模块可以获自例如Molecular Probes (Junction City, OR)或Sigma Chemical Co. (St. Louis, M0)。或者，可以对本发明的测试系统使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)。 TR-FRET联合TRF(时间分辨荧光)和FRET原理。此组合将TRF的低背景优点与FRET的同质测定法形式组合。虽然已经在上文描述了 FRET，TRF利用镧系元素或具有长半衰期的任何其它供体的独特特性。适合于TR-FRET的供体包括镧系元素螯合物(穴状化合物)和一些其它金属配体复合物(其可以具有在微秒至毫秒时间范围中的荧光半衰期，并且因此其还容许能量转移在微秒至毫秒量度中发生)等。在20世纪70年代后期已经使用荧光镧系元素螯合物作为能量供体。常用的镧系元素包括钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)和镝(Dy)。 由于其特定的光物理和光谱特性，镧系元素复合物在生物学中在荧光应用上具有主要的兴趣。具体地，在与更传统的荧光团相比时，它们具有较大的斯托克(Stroke)氏位移和极常长的发射半衰期(微秒至毫秒)。通常，使用有机生色团作为受体。这些包括别藻蓝蛋白(APC)。关于TR-FRET及受体的合适的详情记载于WO 98/15830。基于荧光偏振(FP)的测定法是使用偏振光来激发溶液中的荧光底物肽的测定法。这些荧光肽在溶液中是游离的，并翻转，引起发射光变为消偏振。在底物肽结合较大分子时，其翻转速率大大降低，而且发射光保持高度偏振(还可参见实施例4. 3)。在本发明的又一个实施方案中，为放大发光亲近同质测定法(ALPHA)改编本发明的测试系统。ALPHA是一种基于溶液的测定法，其最初由I^ckard Bioscience开发。ALPHA 是一种基于发光的亲近测定法，其中将一个相互作用配偶附着至供体珠，而将另一个与受体珠偶联，这两者都具有仅约250nm的直径。将光敏剂化合物包埋入供体珠中。凭借此化合物，在用约680nm波长的激光照射后，将周围的氧转化成能量丰富的、短寿命单线态氧。 在无受体珠接近时，单线态氧在不产生信号的情况中衰变。若供体和受体珠通过附着的生物分子的生物学相互作用而聚集(约250nm)，则由供体珠释放的单线态氧在邻近的受体珠中启动发光/荧光级联，导致520-620nm范围中的高度放大信号。在合适的阅读器中检测发光信号。关于ALPHA技术的更多详情，参见Ullman等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91,5426-5430 ο特别地，可以使用基于EFC (酶片段互补)的测定法或等同测定法来高通量筛选化合物。EFC测定法基于经工程化改造的半乳糖苷酶酶，其由两种片段，即酶受体(EA)和酶供体(ED)组成。在片段分开时，没有半乳糖苷酶活性，但是在片段在一起时，它们结合(互补)以形成活性酶。EFC测定法利用ED-分析物偶联物，其中分析物可以由特异性结合蛋白诸如抗体或受体识别。在没有特异性结合蛋白的情况中，ED-分析物偶联物能够互补EA以形成活性半乳糖苷酶，这产生阳性发光信号。若ED-分析物偶联物被特异性结合蛋白结合，则阻止与EA的互补，而且没有信号。若(在样品中)提供游离的分析物，则它会与ED-分析物偶联物竞争与特异性结合蛋白的结合。游离的分析物会释放ED-分析物偶联物以与EA互补，产生信号，信号取决于样品中存在的游离分析物的量。双杂交筛选是一种用于通过测试两个蛋白质间的物理相互作用(诸如结合)来发现蛋白质-蛋白质相互作用的分子生物学技术。该测试后面的前提是通过转录因子结合至上游激活序列上来激活下游报告基因。出于双杂交筛选的目的，将转录因子分成两个分开的片段，称作结合域(BD)和激活域(AD)。BD是负责结合UAS的域，而AD是负责激活转录的域。共免疫沉淀可以用于通过沉淀认为在复合物中的一种蛋白质来鉴定蛋白质复合物，也将复合物的别的成员捕获，并且可以对其鉴定。一旦结合特异性抗体，通过用附着至固体支持物诸如琼脂糖珠的抗体结合蛋白捕捉来从大量溶液取出蛋白质复合物。这些抗体结合蛋白(蛋白Α、蛋白G、蛋白L)最初自细菌分离，而且识别极其多种抗体。蛋白质或蛋白质复合物的初始捕获后，将固体支持物清洗数次以除去未经由抗体特异性且紧密结合的任何蛋白质。清洗后，将沉淀的蛋白质洗脱，并使用凝胶电泳、质谱术、Western印迹、或许多用于鉴定复合物中的成分的其它方法来分析。如此，共免疫沉淀是一种用于评估蛋白质-蛋白质相互作用的标准方法。牵涉共免疫沉淀的合适的测试系统记载于实施例1中。在本发明的另一个优选的实施方案中，可以改编用于检测第一和第二蛋白质之间的相互作用的手段以测量信号级联中HEBPl下游的一种或多种成分。测量可以包括测定 eNOS mRNA或eNOS蛋白或报告蛋白或mRNA的浓度。可以测量响应潜在调控剂的浓度，如上文所描述的。用于测定一种或多种核酸或蛋白质浓度的手段和方法是技术人员公知的，包括此类牵涉RT-PCR、质谱术或FRET的(还可参见实施例)。例示性的测试系统及其用途记载于实施例1至4。优选地，方法改编用于高通量筛选。在此方法中，在无细胞或全细胞测定法中对许多化合物筛选药剂。通常，这些筛选在96孔板中使用基于自动化机器人站的技术或者以较高密度的阵列(“芯片”)形式实施。在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的测试系统进一步包含-eNOS启动子和/或-eNOS启动子的一种或多种转录因子。eNOS启动子是容许基因转录的eNOS基因调节区。如同许多其它组成性表达基因一样，eNOS启动子缺乏经典的TATA框。然而，可以鉴定Spl、Ks、GATA、NF-l、AP-l、剪应力和固醇的一系列保守顺式元件。已知的eNOS转录刺激物是例如经由流动血液的剪应力、缺氧和诸如雌激素和溶血磷脂酰胆碱等药剂。eNOS转录可以由于氧合低密度脂蛋白(oxLDL) 和肿瘤坏死因子α而降低。人eNOS基因中的转录因子结合位点的示意图由karles (Searles, 2006， Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291 :C803_C860)显示。根据对人eNOS基因的近端共启动子 (co-promoter)的详细分析，相对于转录起始，分别在位置-104/-95和-144/-115处鉴定出两种正调节域(PRDI和II)。Ets家族的成员、Spl、Sp3变体、MAZ和YYl鉴定为此区内的调节转录因子。在PRDI和II内，可以检测出就eNOS转录而言正的蛋白质DNA和蛋白质-蛋白质相互作用，这指明eNOS转录受转录因子的复合物相互作用精确调节。此外，GATA结合位点位于位置-230/-227，这对于基础eNOS转录是重要的。在这些顺式元件外，鉴定出在转录起始上游4. 9kB的增强子序列，其功能受核蛋白复合物中的AP2-、MAZ-、Spl-和 Ks-相关因子调节。然而，上文所描述的转录因子大多是遍在表达性蛋白质，其不适合于选择性eNOS调节或控制。可以通过顺式作用RNA元件、钙调蛋白和充当NO合成激活剂的胞内Ca2+来调节转录后eNOS。此外，通过例如由组胺、VEGF或剪应力诱导的热休克蛋白90的变构结合，也可以激活eNOS。eNOS活性也可以通过丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化来调控。所牵涉的蛋白质激酶是例如蛋白质激酶A、蛋白质激酶C、一磷酸腺苷激活的蛋白质激酶、Ca2+/CaM依赖性蛋白质激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶AKT。Serll77的磷酸化可以通过剪应力、VEGF和雌二醇来诱导，而且提高eNOS活性。然而，Thr497的磷酸化招致活性的降低。脱磷酸化过程由磷酸酶PPA2和PPl介导。此外，显示了可以通过蛋白质-蛋白质相互作用，例如经由结合G蛋白偶联受体 (例如缓激肽B2受体)的C端域来负影响eNOS活性。在酵母双杂交测定法中，鉴定出34kDA 蛋白质，并将其称为N0SIP(eN0S相互作用蛋白)。NOSIP结合eNOS的氧域，而且促进酶自胞膜窖(calveolae)移位入胞内区中，导致NO生成降低。使用eNOS的氧域作为诱饵以鉴定eNOS-相互作用蛋白N0STRIN (eNOS运输诱导物)。N0STRIN的过表达导致eNOS自质膜移位至血管结构，而且导致降低的NO释放。可以显示，N0STRIN与eNOS和窖蛋白-1形成三重复合物。此外，它负责募集介导物蛋白质诸如发动蛋白_2。已经克隆了人、牛、鼠和猪的内皮细胞eNOS启动子，而且它们显示出高度序列同源性。eNOS基因由沈个外显子组成，并且涵盖染色体7Q35-36上大约21kB基因组DNA。 4052NT eNOS-mRNA在内皮细胞中组成性表达，而且非常稳定。在HEBPl外，可以存在eNOS启动子的一种或多种转录因子和/或一种或多种实现转录需要的上述因子。本发明的测试系统可以包含细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。合适细胞的例子包括内皮细胞。这些细胞可以是例如原代细胞诸如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(参见实施例1)或细胞系诸如EA. hy926细胞(参见实施例1)。然而，可以使用任何其它细胞或细胞系，任选地经过遗传修饰以包含HEBPl蛋白或效果检测需要的成分。在本发明的一个优选的方法中，通过荧光来测定效果。合适的方法在上文详述，并且可以牵涉荧光标志物、FRET、荧光偏振，如本文中所详述的。在本发明的另一个优选的实施方案中，使用方法来筛选用于预防和/或治疗牵涉 eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病诸如心肌梗死和/或心力衰竭的药物。
上文详述了牵涉eNOS功能异常的例示性疾病。然而，心血管疾病，尤其是心肌梗死和/或心力衰竭是优选的。依照本发明，术语“预防疾病”指降低形成流行病的风险，而术语“治疗疾病”指改善流行病状况的症状，减缓病程等。预防或预防性措施是一种首先用于避免损伤、不适、或疾病的方式。处理或治愈在医学问题已经开始后应用。处理治疗健康问题，而且可以导致其治愈，但是处理更经常仅仅改善问题，只要继续处理。治愈是完全反转疾病或永久终止医学问题的处理子集。本发明的另一个目的涉及一种在受试者中诊断心血管疾病的方法，该方法包括-测定自受试者获得的样品中的HEBP1mRNA或HEBP1蛋白水平，其中HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平相对于对照升高或降低指明心血管疾病。如实施例中所显示的，改变的HEBPl蛋白水平与心血管疾病，特别是心力衰竭和/ 或心肌梗死有关。因而，可以测定自受试者获得的样品中的HEBPlmRNA或HEBPl蛋白水平以检测与对照水平(例如来自健康受试者或者在健康受试者组测定的)不同的水平，其指明上述疾病。术语“来自受试者的样品，，和“测试样品，，指自任何给定的受试者，特别是人分离的所有生物学流体和排泄物。在本发明的上下文中，此类样品包括但不限于血液、血清、血浆、乳头吸出物、尿液、精液、精液流体、精液浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活组织检查、腹水、脑脊液、乳、淋巴、支气管和其它灌洗样品、或组织提取物样品。通常，血液或心血管组织样品是本发明上下文中使用的优选测试样品。可以通过一系列方法来测定HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平，所述方法包括本文中所描述的，特别是也在本发明筛选方法的上下文中和实施例中所描述的。或者，可以使用质谱术。术语“质谱术”指使用电离源来从表面上的样品生成气相离子，并用质谱仪检测气相离子。术语“激光解吸质谱术”指使用激光作为电离源来从表面上的样品生成气相离子，并用质谱仪检测气相离子。用于生物分子诸如HEBPl的质谱术的一种优选方法是基质辅助激光解吸/电离质谱术或MALDI。在MALDI中，分析物通常与基质材料混合，所述基质材料在干燥后与分析物共结晶。基质材料自能量来源吸收能量，否则所述能量来源会碎裂不稳定的生物分子或分析物。另一种优选的方法是表面增强激光解吸 /电离质谱术或SELDI。在SELDI中，分析物应用的表面在分析物捕捉和/或解吸中发挥积极作用。在本发明的上下文中，样品包括可以已经经历层析或其它化学加工的生物学样品和合适的基质底物。在质谱术中，“表观分子量”指检测离子的分子量(按道尔顿计)比电荷值，即m/ ζ.表观分子量如何推导取决于所使用的质谱仪类型。凭借飞行时间质谱仪，表观分子量是自电离至检测的时间的函数。术语“信号”指由所调查的生物分子产生的任何响应。例如， 术语信号指由撞击质谱仪检测器的生物分子所产生的响应。信号强度与生物分子的量或浓度相关联。信号以两种数值定义如所描述的那样产生的表观分子量数值和强度数值。质量值是生物分子的基本特征，而强度数值与具有相应表观分子量数值的生物分子的某种量或浓度一致。如此，“信号”总是指生物分子的特性。或者，可以使用本领域技术人员已知的常规技术来获得并量化HEBPl在测试样品中的存在和量。例如，用于量化测试样品中的抗原或抗体的方法是本领域技术人员公知的。 例如，可以使用免疫测定法来测定HEPBl在测试样品中的存在和量化。免疫测定法通常包括(a)提供特异性结合生物标志的抗体(或抗原)；(b)使测试样品与抗体或抗原接触；并 (C)检测与测试样品中的抗原结合的抗体的复合物或与测试样品中的抗体结合的抗原的复合物的存在。实施例中描述了例示性的抗体。然而，可以依照熟练从业人员已知的方法来生成备选的抗体。提供抗体后，可以使用许多公认的免疫学结合测定法之任一种来检测和/或量化HEBP1。可以在本发明中使用的测定法包括例如酶联免疫吸附测定法(ELISA) (其又称为“三明治式测定法”)、酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、计数免疫测定法(CIA)、过滤介质酶免疫测定法(filter media enzyme immunoassay，MEIA)、荧光联接免疫吸附测定法 (fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA)、凝集免疫测定法和多重荧光免疫测定法(multiplex fluorescent immunoassay)(诸如 Luminex LabMAP)等。关于通用免疫测定法的综述，还可参见 Methods in Cell Biology =Antibodies in Cell Biology，第 37 卷(Asai 编 1993) ；Basic and Clinical Immunology (Mites 和 iTerr 编，第 7 版 1991)。—般地，可以使自受试者获得的测试样品与特异性结合抗原的抗体接触。任选地， 可以将抗体固定至固体支持物，之后使抗体与测试样品接触以便于清洗和随后分离复合物。固体支持物的例子包括例如微量滴定板、玻璃显微镜载玻片或盖片、棒(stick)、珠、微珠形式的玻璃或塑料。将样品与抗体一起温育后，清洗混合物，并可以检测形成的抗体-抗原复合物。这可以通过将清洗的混合物与检测试剂一起温育来实现。此检测试剂可以是例如用可检测标记物标记的二抗。就可检测标记物而言，可以使用本领域中已知的任何可检测标记物。 例如，可检测标记物可以是放射性标记物(诸如例如3H、125I、35S、14C、32P、和33P)、酶标记物 (诸如例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记物(诸如例如，吖啶酯(acridinium ester)、吖啶硫酯、吖啶磺酰胺、菲啶酯(phenanthridinium ester)、鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)等)、荧光标记物(诸如例如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6_羧基荧光素、5 (6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温标记物、或免疫聚合酶链式反应标记物。贯穿整个测定法，试剂的每次组合后，可以需要温育和/或清洗步骤。温育步骤可以自约5秒变化至数小时，优选地自约5分钟至约M小时。然而，温育时间会取决于测定形式、生物标志(抗原)、溶液体积、浓度等。通常，会在环境温度实施测定法，尽管它们可以在温度范围诸如10°C至40°C里进行。 优选地，自受试者获得的样品中的HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平相对于对照是降低的。样品可以是适合于检测HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平变化的任何样品。然而，优选地，在心血管样品诸如内皮细胞，特别是心血管系统的内皮细胞，或心细胞中测定水平。如本文中所详述的，eNOS功能异常和HEBPl变化在心血管疾病方面是特别相关的。优选地，心血管疾病是心力衰竭和/或心肌梗死。依照本发明，可以使用HEBPl来鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病的药物。因此，本发明的另一个主题涉及HEBP-I用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病的药物的用途。然而，由于内皮细胞中的氧化氮减少所致的内皮功能异常是血管疾病的主要机制之一，而且经常导致动脉粥样硬化。这在糖尿病、高血压或其它慢性病理生理学状况患者中是非常常见的。因而，可以在预防或治疗与内皮功能异常有关的慢性病理生理学状况诸如糖尿病或高血压的副作用中使用调控剂。优选地，药物改变，优选地提高eNOS表达。还是依照本发明，可以使用HEBPl来检测eNOS信号转导的成分。因此，本发明的又一个主题涉及HEBP-I用于检测eNOS信号转导成分的用途。可以使用实施例中所描述的方法诸如使用HEBPl作为诱饵、蛋白质微阵列、siRNA、报告系统、质谱术、亲和纯化、SDS PAGE 等来实施别的成分的检测(特别参见实施例1和2，其中要使用HEBPl作为诱饵)。在这些方法中，优选地，HEBPl是人HEBPl。可以使用HEBPl以检测尚不知晓的结合配偶和/或上游或下游信号转导的成分。根据成分，可以使用上文在本发明筛选方法的背景中描述的方法以量化或检测要检测成分的效果。本发明的又一个主题涉及HEBPl用于调节eNOS启动子活性的用途。依照本发明， 可以使用HEBPl以调节eNOS启动子活性。调节包括提高、促进降低、抑制、和阻断eNOS启动子活性。可以使用eNOS启动子活性的调节以调节细胞、组织或器官中的eNOS表达。任选地，别的成分可以牵涉调节诸如特异性调节HEBP-I或eNOS启动子的化合物诸如AVE3085、 AVE9488或物质9257(参见实施例)。然而，eNOS启动子也可以与不同基因(例如报告基因或任何其它基因)可操作连接(例如通过遗传工程化改造进行)以通过eNOS启动子和 HEBPl来调节所述基因的表达。这可以进行使用以为了研究目的、医学目的或任何其它目的而模拟心血管(特别是内皮)细胞中的eNOS表达。例如，可以在心血管疾病的模型中使用此构建体以研究eNOS表达或eNOS启动子活性及其调节。可以使用eNOS启动子和HEBPl 作为具有基础活性的诱导型或组织特异性启动子，如熟练从业人员已知的。本发明不限于本文中所描述的具体方法、方案、和试剂，因为它们可以有所变化。 此外，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围。如本文中和所附权利要求书所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数提及物， 除非上下文另有明确规定。类似地，词语“包含”、“含有”和“涵盖”应当包含性而非排他性解释。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩略词与本发明领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实践中使用与本文中所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了优选的方法和材料。本发明通过以下附图和实施例进一步例示，尽管应当理解附图和实施例仅为了例示而包括在内，而且并不意图限制本发明的范围，除非另有具体指明。附图简述
图1显示了在mRNA水平验证不同HEBPl-siRNA。EA. csr03细胞(96孔形式，η = 4)转染后M小时通过定量RT-PCR用特异性TaqMan 探针来测定相对于GAPDH标准化的相对HEBPl表达(*p < 0. 05对siLV2-对照)。siRNA昍BP125能够抑制HEBPl基因转录。图2显示了使用siRNA关闭HEBPl和随后测量AVE3085的启动子激活。以96孔形式(η = 4)实施此实验。相对于总细胞蛋白质含量标准化测量的化学发光。siRNAHEBP125 能够抑制eNOS启动子激活。图3显示了通过色氨酸猝灭进行的氯高铁血红素和PPIX对人6xhis-HEBPl的结合研究。以30nM至10 μ M的浓度向0. 5 μ M HEBPl溶液添加血红素和ΡΡΙΧ。10分钟温育后， 测量色氨酸荧光(λ激发=295nm/ λ发射=340nm)。显示了 6次实验的均值士SD，*p < 0. 05 对30nM氯化高铁血红素/PPIX。血红素和PPIX能够以剂量依赖性方式猝灭人6xhis_HEBPl 的色氨酸荧光。图4显示了来自色氨酸猝灭测量的eNOS转录增强剂9257对氯化高铁血红素结合 6xHis-huHEBPl的影响。将0. 5 μ M HEBPl溶液与9257 (10 μ Μ) 一起在冰上预温育10分钟。 以不同浓度添加血红素后，测量色氨酸荧光(λ激发=295nm/ λ发射=340nm)。显示了 6次实验的均值士SD，*p < 0. 05对DMSO对照。9257影响血红素对6xhis_HEBPl的结合。图5显示了通过荧光偏振测量调查A300对HEBPl的特异性结合。于室温将物质 A300 (30nM)与多个浓度的6xhis-HEBPl或BSA —起温育10分钟。随后，测量荧光偏振(λ 激发=53Onm/λ娜=585nm)。显示了 5次实验的均值士SD，*p < 0. O5对没有蛋白质的DMSO 对照。eNOS物质A300特异性结合6xhis_HEBPl。图6显示了心肌梗死后患有慢性心力衰竭的大鼠的心脏组织中的HEBPl预测表达。将大鼠分成三组。对一组进行假手术(组1)，而在组2和组3中，通过心肌梗死诱导慢性心力衰竭。仅后一组用AVE3085(10mg/(kg天))处理9周。随后，在心脏组织中测量 mRNA表达(HEBP1与GAPDH相比)。显示了 7次实验的均值士SD，*p < 0. 05对假手术的。 此实验提示了 HEBPl牵涉慢性心力衰竭的发病机制。
实施例实施例1使用亲和层析纯化潜在的eNOS靶物以如下方式进行潜在靶蛋白的亲和纯化的原理，其中依赖化学偶联(所谓的接头)将要纯化其靶蛋白的药效团在基质上固定化。若将来自细胞培养物的蛋白质溶胞物添加至特定的亲和材料，则药效团充当一种“诱饵”，并“钓出”对药效团具有亲和力的蛋白质。 在本工作中使用此方法来纯化/扩增靶分子。使用药效团的活性和无活性构象的特定柱材料(参见下文)。使用3xl07个EA. csr03细胞(参见下文)来进行亲和层析，并于_70°C以细胞沉淀物贮存。为了溶胞，将沉淀物在具有0. 5% Tween 20的DPBS缓冲液(lml/100mg 细胞沉淀物)中重悬，并超声破坏(3x30秒，脉冲5，强度20%)。通过显微术实现细胞溶胞的控制。通过两个离心步骤(首先以1000xg/4°C的10分钟，然后以70000xg/4°C的30分钟)来分开细胞碎片。通过BCA方法来测定上清液中的蛋白质浓度。自3xl07个获得大约 5mg蛋白质。随后在特异性、S^harose偶联的柱材料上用EA. csr03细胞溶胞物实施制备亲和层析，并通过质谱术鉴定结合的蛋白质。数个清洗步骤后，通过添加SDS来洗脱结合的蛋白质，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离。凝胶的银染色后，将所有洗脱蛋白质的全部痕迹切成大约60块凝胶。将这些单独地用胰蛋白酶消化成蛋白质片段，在C18-柱上分离，并使用 MS-MS/MS来鉴定。
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变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种可以依照其分子量分离各种蛋白质的凝胶电泳方法。此可能性源自将阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDQ添加至要分离的蛋白质混合物。SDS附着至蛋白质，并掩盖蛋白质的固有电荷。形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，具有大约1.4g SDS/g蛋白质(约1分子SDS/3个氨基酸)的恒定荷质比。经由再加热样品，破坏蛋白质的二级和三级结构。另外，将还原剂(例如β-巯基乙醇和DTT) 添加至样品以切割二硫桥。SDS-PAGE中所使用的分离介质是聚丙烯酰胺的凝胶基质，其源自丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的交联。在应用电场后，SDS-蛋白质复合物迁移通过分离基质，并经由所谓的“分子筛效应”依照其大小分离。为了生成不同细胞样品来进行凝胶电泳，用DPBS(37°C )小心地清洗细胞两次， 然后用 Ix SDS 样品缓冲液(50mM Trizma 碱(pH 6. 8),1.6% (w/v) SDS ；4% (w/v)甘油、 0.01% (w/v)溴酚蓝、5% (ν/ν) β-巯基乙醇、325UBenzonase 、蛋白质抑制剂和至IOml 的水)裂解。然后，添加酶Benzonase ,并于37°C摇动样品15分钟。Benzonase 是一种经遗传工程化改造的内切核酸酶，其降解细胞溶胞物中的RNA和DNA，如此相当大地降低样品的粘度，而且确保蛋白质混合物在电泳中更好的分离。然后，通过于70°C加热20分钟来使蛋白质样品变性。将样品直接在电泳中使用或者于_20°C贮存，直至使用。在关于MAP 激酶的磷酸化状态的实验中，另外将比率1 100的磷酸酶抑制剂(混合物1和2、添加至 DPBS和样品缓冲液。采用来自hvitrogen (Karlsruhe，德国)的Novex Midi凝胶系统来进行凝胶电泳。凭借此现成的凝胶系统，有可能应用每块凝胶多至沈个样品。另外，在相关的)(Cell4 SureLock Midi-细胞室中，多至四块凝胶可以同时进行电泳。使用具有 26个样品袋的4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶。它们是所谓的“梯度凝胶”，即聚丙烯酰胺浓度随着分离路径增加而升高，并且如此容许同时分离小的和大的蛋白质。在所有实验中，还运行合适的蛋白质标准品以评估所调查的蛋白质的分子量。根据要求的分离范围，在 MES-SDS与MOPS-SIDES运行缓冲液间进行选择。另外，将每块凝胶435 μ 1 NuPAGE 抗氧化剂添加至上部室的运行缓冲液。然后以200V的恒定电压实施凝胶电泳，在MES-SIDES 运行缓冲液的情况中持续40分钟，而在MOPS-SIDES运行缓冲液的情况中持续55分钟。对于蛋白质凝胶的银染色，用银溶液对蛋白质染色典型地基于如下原理，即Ag+离子与谷氨酸、天冬氨酸、和半胱氨酸残基形成复合物。Ag+离子的还原给出元素银，生成蛋白质条带的呈褐色的染色。银染色相对于其它方法(例如考马斯染色)的优点在于方法的高灵敏度。如此，即使自5ng蛋白质/0.5cm条带开始的蛋白质量也可以被显现，这尤其对于定性研究是相当大的优点。为了在聚丙烯酰胺凝胶中定性分析蛋白质，使用来自公司 Pierce (Rockford, USA) WSlverSNAP 染料试剂盒Π遵循制造商的标准指令来实施银染色。此规程的原理基于依靠乙醇乙酸溶液(30% (ν/ν)乙醇，10% (ν/ν)乙酸)固定凝胶中的蛋白质。这之后与银盐溶液一起温育，并将银离子还原成元素银，其对蛋白质条带染色。"Western印迹”意指在凝胶电泳中分离后将蛋白质转移至聚合物支持物层。因此，使蛋白质对于随后免疫检测中的抗体而言更容易接近。基本上，多种聚合物作为支持物材料是合适的，例如尼龙、PVDF和硝酸纤维素。垂直应用于凝胶和膜的电压引起蛋白质自凝胶迁移至膜。在此过程中保留前述分离的条带样式。在用硝酸纤维素作为支持物材料的所使用的印迹方法中，蛋白质与膜的结合基于疏水性。为了制备供凝胶电泳后的印迹用的凝胶，将其在h转移缓冲液(50ml 20x NuPAGE 转移缓冲液、50ml甲醇、 500 μ 1 NuPAGE 抗氧化剂和至500ml的水)中平衡20分钟。将硝酸纤维素膜用水短暂清洗，并与^转移缓冲液中的每块凝胶的6片滤纸一起温育。转移自身在“半干印迹仪 (Semi-Dry-Blotter) ” (Biost印，Jahnsdorf，德国)中实施。按“三明治式原理”将凝胶和膜在上方和下方的浸渍滤纸之间包埋，并将20V的恒定电压应用60分钟。在先前的研究中，两种具有相关结构的小分子量化合物以浓度依赖性方式增强 eNOS启动子活性
权利要求
1.一种筛选内皮NO合酶(eNOQ表达的调控剂的方法，该方法包括 -提供包含血红素结合蛋白I(HEBPl)或其功能活性变体的测试系统， -使所述测试系统与药剂接触，并-检测所述药剂对所述测试系统的影响，由此将所述药剂鉴定为eNOS表达的调控剂。
2.权利要求1的方法，其中所述测试系统进一步包含 -eNOS启动子和/或-所述eNOS启动子的一种或多种转录因子。
3.权利要求1或2的方法，其中所述测试系统包含细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中通过荧光来测定所述影响。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中使用所述方法来筛选用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病的药物。
6.一种在受试者中诊断心血管疾病的方法，该方法包括-测定自所述受试者获得的样品中的HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平，其中相对于对照升高或降低的HEBPl mRNA或HEBPl蛋白水平指明心血管疾病。
7.权利要求6的方法，其中所述水平相对于所述对照是降低的。
8.权利要求6或7的方法，其中在心脏细胞中测定所述水平。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述心血管疾病是心力衰竭和/或心肌梗死。
10.HEBPl用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病的药物的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述药物改变，优选提高eNOS的表达。
12.HEBPl用于检测eNOS信号转导的成分的用途。
13.权利要求10至12中任一项的用途或权利要求1至9中任一项的方法，其中HEBPl 是人HEBPl。
14.HEBPl用于调节eNOS启动子活性的用途。
全文摘要
本发明涉及一种筛选内皮NO合酶(eNOS)表达的调控剂的方法、一种在受试者中诊断心血管疾病的方法、HEBP-1用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病(特别是心血管疾病)的药物的用途、HEBP-1用于检测eNOS信号转导的成分的用途、及HEBP1用于调节eNOS启动子活性的用途。
文档编号G01N33/68GK102239414SQ200980148597
公开日2011年11月9日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年12月4日
发明者乔琴.克鲁伊普, 亚历山大.克鲁格, 亚历山大.费里尔, 保罗斯.沃尔法特, 克里斯琴.维斯科夫, 凯瑟琳.西尔迈耶, 哈特穆特.斯特罗贝尔, 娜塔莉.卡斯特, 约翰.加森胡伯 申请人:赛诺菲-安万特