专利名称：用于诊断/预后心血管疾病/事件的sPLA2活性和OxPL/apoB心血管风险因子的组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用SPLA2活性和OxPL/apoB心血管风险因子的组合来诊断/预后心
血管疾病/事件或监测心血管疾病。
背景技术：
血管疾病治疗中的关键问题是正确诊断。此疾病的第一征兆通常是猝死。举例来说，死于冠状动脉疾病的所有个体中有大约一半都是猝死。此外，对于最终被诊断为患有冠状动脉疾病的患者的40-60%来说，心肌梗塞是此疾病的最先表现。不幸的是，大约有40% 的此类初始事件并未引起患者重视。因为我们在侵入性治疗前提供早期精确诊断的能力很有限，所以心血管疾病(⑶)仍然是全世界范围内发病和死亡的首要原因。⑶患者代表患有以不同速率和截然不同的模式发展的疾病的异源个体群组。虽然对于CD患者存在着适当的循证治疗(evidence based treatment)，但复发和死亡率仍然很高。此外，初级预防的全部益处没有实现，因为我们不能精确鉴别哪些患者将从侵入性风险降低获益。虽然某些疾病标志已经显示可在群体水平上预测结果或对治疗的反应，但它们不够敏感或特异性不够高，从而无法适当地在临床上用于个体患者。因此，超过一半的冠状动脉疾病患者的初次临床表现是心肌梗塞或死亡。身体检查和当前诊断工具无法精确地确定个体罹患⑶并发症的风险。例如高血压、高脂血症、糖尿病、家族史和吸烟等已知风险因子不能确定动脉粥样硬化疾病的诊断。 依赖于解剖数据的诊断方式(diagnosticmodalities)(例如冠状血管造影术、冠状动脉钙化积分、CT或MRI血管造影术)缺乏关于疾病过程的生物活性的信息，且可以是未来心脏事件的不佳预测方法。内皮功能的功能评定可以是非特异性的，且与动脉粥样硬化疾病过程的存在无关，但一些数据已经证实了这些量度的预后价值。单独生物标志(例如脂质和炎症标志)已经显示可预测⑶患者的结果和对治疗的反应，且其中一些被用作动脉粥样硬化疾病发生的重要风险因子。尽管如此，到目前为止，仍没有单一生物标志具有足够的特异性，从而无法提供适当的临床应用以用于个体患者的CD诊断。因此，需要鉴别可提供更精确的CD诊断/预后的生物标志或心血管风险因子或其组合。
发明内容
本发明的一个目的是一种鉴别具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的受试对象的方法，其包括-在从所述受试对象获得的样品中测量至少两个心血管风险因子a) sPLA2 活性和b)载脂蛋白B-100粒子上的氧化磷脂(OxPL/apoB)，-组合所述测量值，SPLA2活性和OxPL/apoB的组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。在本发明的一个实施方案中，将SPLA2活性和OxPL/apoB的所述组合值与参考值比较。在本发明的另一个实施方案中，所述方法进一步包括测量至少一种选自 Framingham 风险评分(FRS)、CRP、apoBlOO 的 IgM IC 或 IgMMDA-LDL、Lp-PLA2 和 sPLA2 质量的心血管风险因子。在本发明的一个实施方案中，所述方法用于鉴定具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的受试对象，所述心血管疾病和/或心血管事件是代谢综合症、X综合症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定性和不稳定性心绞痛、中风、主动脉和其旁支的疾病(例如主动脉瓣狭窄、血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病和任何急性缺血性心血管事件。本发明的另一个目的是一种用于监测心血管疾病的治疗功效的如上所述的方法。本发明的另一个目的是一种用于鉴定受试对象是否具有心血管疾病和/或心血管事件或是否处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的试剂盒，其包含-用于测量SPLA2活性的工具，和-用于测量OxPL/apoB的工具。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于测量至少一种选自Framingham 风险评分(FRS)、CRP、apoB 100 的 IgM IC 或 IgM MDA-LDL、Lp_PLA2 和 sPLA2 质量的心血管风险因子的工具。
具体实施例方式定义如本文所定义的“心血管疾病”或“动脉血管疾病”是通用术语，用于分类影响身体的心脏、心脏瓣膜、血液和脉管系统的许多病症，且涵盖影响心脏或血管的任何疾病，包括 (但不限于)代谢综合症、X综合症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、 稳定性和不稳定性心绞痛、中风、主动脉和其旁支的疾病(例如主动脉瓣狭窄、血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病，且包括(但不限于)任何急性缺血性心血管事件。如本文所用的动脉血管疾病通常是指缺血性或前缺血性(pro-ischemic) 疾病，而一般不指非缺血性疾病。“心血管事件”在本文中与术语“心脏事件”、“急性动脉血管事件”或“动脉血管事件”互换使用，且是指心脏性猝死、急性冠状动脉综合症(例如但不限于，斑块破裂、心肌梗塞、不稳定性心绞痛)以及非心脏性急性动脉血管事件(例如腿部血凝块、动脉瘤、中风和其中动脉血管血流和充氧作用被中断的其它动脉血管缺血性事件)。如本文所用的“动脉粥样硬化”和“动脉粥样硬化血栓形成”是指复杂的动脉血管炎症疾病，其响应于多种刺激和心血管风险因子而发生，且与全身性炎症有关。动脉粥样硬化过程中涉及的细胞包括血管(内皮和平滑肌)细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞(T、 B、NKT)、树突状细胞、肥大细胞和血小板。它们分泌可溶性因子或被可溶性因子刺激，所述可溶性因子包括肽、糖蛋白、蛋白酶和一组细胞因子。它们与炎症反应的永存、动脉粥样硬化的进展和去稳定化(包括斑块蚀损、破裂和血栓形成)有关。动脉因为被称为“斑块”的物质在其内壁上堆积而变硬和变窄。随着斑块形成和尺寸增加，动脉内侧变窄(“狭窄”) 且可流经其中的血液变少。由脉管系统供给的组织因此丧失氧化源(局部缺血)，且可能发生细胞死亡(细胞凋亡/坏死)。“CAD”或“冠状动脉疾病”是当对心肌供血的动脉(冠状动脉)变成动脉粥样硬化性、钙化和/或变窄时所发生的动脉血管疾病。最终，流向心肌的血流减少，且由于血液携带急需的氧，因此心肌不能接收其所需量的氧，且通常经历坏死。CAD是由对心脏供应富含氧的血液的血管的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化性血栓形成而引起，且导致急性冠脉综合症(ACS)、心肌梗塞(心脏病发作)、心绞痛(稳定性和不稳定性)。据估计目前有一千三百万美国人经诊断患有CAD，其中大约七百万是过去急性事件的幸存者。每年新出现超过一百万起急性CAD事件，其中许多导致死亡。40岁后，男性的CAD寿命风险是49%，且女性的CAD寿命风险是32%。临床上被认为具有发生动脉血管疾病(例如CAD)的低风险或无风险的受试对象通常不展现动脉血管疾病的传统风险因子或展现极少传统风险因子， 但仍然可能发生急性动脉血管事件。所有急性CAD事件中有大约20%发生在无传统风险因子的受试对象中，且所有急性CAD中大部分发生在先前没有诊断出CAD的受试对象中。这些受试对象在急性CAD事件实际发生之前通常不展现所述急性事件的症状，即气短和/或胸痛。对于处于急性CAD事件风险下但还没有症状且没有传统风险因子的受试对象，或目前在临床上被认为处于低风险下但还没有诊断出CAD的受试对象，仍然存在实质性的检测间隙。“CVD”或“脑血管疾病”是对面部和大脑供给富含氧的血液的血管的动脉血管疾病， 例如动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓形成。此术语通常用于描述对大脑供血的颈动脉的 “硬化”。其是CAD和/或PAD的常见并存疾病。其也称为缺血性疾病，或引起血流缺乏的疾病。CVD涵盖例如“脑血管缺血”、“急性脑梗塞”、“中风”、“缺血性中风”、“出血性中风”、“动脉瘤”、“轻度认知障碍(MCI) ”和“短暂性脑缺血发作(TIA) ”等疾病状态。缺血性CVD被认为与CAD和PAD密切相关；非缺血性CVD可具有多种病理生理学。据估计有五百万美国人是过去确诊的急性CVD事件的幸存者，其中每年会发生估计七十万起急性CVD事件。如本文所公开，基于传统动脉血管疾病风险因子的临床评定被认为具有低CVD风险或无CVD风险、或者无例如TIA、MCI或严重头痛等症状的受试对象仍然可能发生急性CVD事件。“PAD”或“外周动脉疾病”涵盖在心脏和大脑外部发生的疾病状态，例如动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓形成。其是CAD的常见并存疾病。基于传统PAD(或动脉血管疾病)风险因子的评定被认为具有低PAD风险或无PAD风险、或者无PAD或动脉血管疾病的症状的受试对象仍然可能发生动脉血管事件，即便是在没有跛行的情况下。跛行可被定义为腿部肌肉疼痛或不适，这是由于外周动脉变窄，导致流向肌肉的血液量减少，产生局部缺血和通常动脉阻塞，从而引起骨骼肌和肢体坏死而引起的。疼痛或不适通常在走路时出现且在静止状态下消失(间歇性跛行)。跛行通常会导致疼痛、紧张、痉挛、疲劳或虚弱。PAD 不仅引起在CAD中常见的血液动力学变化，而且导致骨骼肌的代谢变化。当PAD发展成严重慢性和急性外周动脉阻塞时，外科手术和截肢术通常是唯一的治疗选择。PAD被广泛认为是低诊疾病，其中大部分仅在出现症状后或仅在并发其它动脉血管疾病时才被确诊，且所述缺血性事件已经导致了不可逆的动脉血管损伤。“心血管风险因子”涵盖水平在患有心血管疾病或容易发生心血管疾病或处于心
6血管事件风险下的受试对象中发生改变的一种或一种以上生物标志。本发明上下文中的“风险”涉及历经特定时期将发生事件的可能性，例如在动脉血管事件的转换中，且可指受试对象的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可参考相关时间群组的实际观测后测量(actual observationpost-measurement)，或参考从相关时期内遵循的统计上有效的历史群组产生的指数值来测量。相对风险是指受试对象的绝对风险与低风险群组的绝对风险或平均群体风险的比率，其可根据临床风险因子的评定方式而变化。 通常还使用比值比，其是指定测试结果的阳性事件与阴性事件的比例(比值是根据公式P/ (I-P)，其中P是事件概率，而(I-P)是无事件的概率)，用于非转换(no-corwersion)。本发明上下文中的“风险评估”涵盖预测事件或疾病状态可能发生的概率、几率或可能性、事件的复发率或从一种疾病状态向另一种转变，即从正常状态转变为动脉血管状态或处于发生动脉血管事件的风险下的状态，或从动脉血管事件的风险转变为更稳定的动脉血管状态。风险评估也可包含预测未来临床参数、传统实验室风险因子值或其它动脉血管疾病指数，例如冠状动脉钙化计分、其它成像或踏车计分(imaging or treadmill score)、被动或主动测试结果、动脉血管的狭窄或阻塞百分比和其它斑块负荷和活性的量度，无论是在参考先前测量的群体的绝对方面还是相对方面。本发明的方法可用于对转变为动脉血管疾病和事件的风险进行连续或分类测量，从而诊断和确定被定义为处于动脉血管事件风险下的受试对象的类别的风险谱(risk spectrum)。在分类情形下，本发明可用于区别正常受试对象群组和处于较高动脉血管事件风险下的其它受试对象群组。在其它实施方案中，本发明可用于区别处于发展动脉血管事件的风险下的受试对象与患有动脉血管疾病的受试对象，或患有动脉血管疾病的受试对象与正常受试对象。本发明上下文中的“样品”是从受试对象分离的生物样品，且可包括(例如且不限于)体液和/或组织提取物，例如从受试对象获得的勻浆或溶解组织。组织提取物常规地从组织活检和尸检材料获得。可用于本发明的体液包括血液、尿液、唾液或任何其它身体分泌物或其衍生物。如本文所用的“血液”包括全血、血浆、血清、循环细胞、成分或任何血液衍生物。“临床参数或指数”涵盖受试对象健康状态或其它特征的所有非样品或非分析物生物标志，例如(不限于)年龄(Age)、种族(RACE)、性别(Sex)、舒张压(DBP)和收缩压 (SBP)、家族史(FamHX)、身高(HT)、体重(WT)、腰围(Waist)和臀围(Hip)、身体质量指数 (BMI)以及其它参数，例如I型或II型糖尿病或妊娠期糖尿病(DM或GDM，本文统称为糖尿病)和静息心率。本发明上下文中的“受试对象”优选是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表动脉血管疾病或动脉血管事件的动物模型的受试对象。受试对象可以是雄性或雌性。受试对象可以是先前已被诊断或鉴定为患有动脉血管疾病或动脉血管事件，且任选地已经经历或正在经历针对动脉血管疾病或动脉血管事件的治疗干预的受试对象。或者，受试对象也可以是先前还没有被诊断为患有动脉血管疾病的受试对象。举例来说，受试对象可以是展现动脉血管疾病的一种或一种以上风险因子的受试对象，或不展现动脉血管风险因子的受试对象，或无动脉血管疾病或动脉血管事件的症状的受试对象。受试对象也可以是罹患动脉血管疾病或动脉血管事件或处于发展动脉血管疾病或动脉血管事件的风险下的受试对象。“公式”、“算法”或“模型”是获取一个或一个以上连续或分类输入(本文称为 “参数”)并计算输出值(有时称为“指数”或“指数值”)的任何数学方程、算法、分析或程序化方法、或统计技术。“公式”的非限制性实例包括和、比率和回归算子(regression operator)(例如系数或指数)、生物标志值转换和标准化(包括(不限于)基于例如性别、 年龄或种族等临床参数的那些标准化方案)、法则和准则、统计分类模型和针对历史群体训练的神经网络。在组合心血管风险因子和其它生物标志中尤其使用线性和非线性方程和统计分类分析，以确定在受试对象样品中检测到的心血管风险因子的水平与受试对象的心血管疾病风险之间的关系。在面板和组合构造(panel and combination construction) 中，尤其关注结构和合作统计分类算法，以及风险指数构造方法，其利用模式识别特征，包括公开技术，例如交叉相关、主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)、因素轮换(factorrotation)、逻辑回归(LogReg)、线性判别分析(LDA)、Eigengene线性判别分析 (ELDA)、支持向量机(Support Vector Machines, SVM)、随机森林(Random Forest, RF)、 递归分类树(RPART)以及其它相关决策树分类技术、缩小重心(Shrunken Centroid, SC)、 StepAIC, Kth-最近相邻(Kth-NearestNeighbor)、Boosting、决策树、神经网络、贝叶斯网络(Bayesian network)、支持向量机和隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)等。其它技术可用于事件危险分析的存活和时间中，包括所属领域技术人员众所周知的CoX、ffeibull、 Kaplan-Meier 禾口 Greenwood 模型。“测量(measuring 或 measurement) ” 或者可选地“检测(detecting 或 detection)”意指评定指定物质在临床样品或受试对象来源的样品中的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包括推导所述物质的定性或定量浓度水平，或者以其他方式评估受试对象的非分析物临床参数的值或分类。本发明本发明的一个目的是一种鉴定具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的受试对象的方法，其包括-在从所述受试对象获得的样品中测量至少两个心血管风险因子a) sPLA2 活性和b)载脂蛋白B-100粒子上的氧化磷脂(OxPL/apoB)，-组合所述测量值，SPLA2活性和OxPL/apoB的组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。根据本发明，使用统计分析组合所述测量值可获得组合值，其指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。在本发明的一个实施方案中，受试对象可以是基本上健康的受试对象，其意指受试对象先前没有被诊断或鉴定为具有或罹患心血管疾病，或还没有发生心血管事件。在另一个实施方案中，受试对象也可以是无心血管疾病症状的受试对象。如本文所用的“无症状”受试对象是指不展现心血管疾病或事件的传统症状的受试对象，所述传统症状包括(但不限于)CAD中的胸痛和气短、PAD中的跛行和CVD中的TIAS、MCI和严重头痛。在本发明的另一个实施方案中，受试对象可以是处于具有或发展心血管疾病或心血管事件的风险下的受试对象，如临床和生物指标所定义，例如年龄、性别、LDL浓度、HDL 浓度、甘油三酯浓度、血压、身体质量指数、CRP浓度、冠状动脉钙化计分、腰围、吸烟状况、先前心血管疾病病史、心血管疾病家族史、心率、空腹胰岛素浓度、空腹葡萄糖浓度、糖尿病状况和高血压药疗的使用。在本发明的另一个实施方案中，受试对象可以是先前被诊断或鉴定出心血管疾病或心血管事件的受试对象，例如无心肌坏死的慢性缺血性病症(例如稳定性或劳累性心绞痛)、无心肌坏死的急性缺血性病症(例如不稳定性心绞痛)、有心肌坏死的缺血性病症 (例如ST段抬高心肌梗塞或非ST段抬高心肌梗塞)。组织缺血通常以相对术语定义且当氧需求超过传递到组织的氧量时发生。在组织 (例如心肌)氧需求与供应之间存在不平衡。这种氧缺失情况可伴随有灌注降低后发生的代谢物去除不充分。使用闪烁扫描法，通过分析节段性室壁运动异常或通过使用心电图(ST 段的典型改变、上部或下部ST段偏离、T波的典型变化，例如T波倒置或陡峭对称或高幅度正向T波)，可在临床上(例如胸痛)、生物学上(例如髓过氧化物酶活性增加)、代谢上诊断心肌缺血。无症状缺血典型地使用闪烁扫描法或M小时心电图记录来诊断。稳定性和劳累性心绞痛的典型表现是锻炼期间胸痛和休息时缓慢恢复。其通常反映锻炼期间的组织缺血。不稳定性心绞痛是稳定性心绞痛频率和/或严重性的新近增加、心绞痛首次发作或休息时的心绞痛。心肌坏死典型地通过循环血液中心肌酶(例如肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、CPK)的增加来诊断。在本发明的另一个实施方案中，受试对象可以是由于心血管疾病治疗而显示心血管风险因子改善的受试对象。所述改善包括身体质量指数降低、总胆固醇降低、LDL水平降低、HDLC水平增加、收缩压和/或舒张压降低，或其它前述风险因子或其组合。在本发明的一个实施方案中，在受试对象中没有诊断出缺血症状发作。使用闪烁扫描法，通过分析节段性室壁运动异常或通过使用心电图(ST段的典型改变、上部或下部 ST段偏离、T波的典型变化，例如T波倒置或陡峭对称或高幅度正向T波)，可在临床上(例如胸痛)、生物学上(例如髓过氧化物酶活性增加)、代谢上诊断心肌缺血。在另一个实施方案中，已经在受试对象中诊断出缺血症状发作。在本发明的一个实施方案中，用于测量SPLA2活性和OxPL/apoB和任选其它心血管风险因子的样品是血液样品、全血、血浆、血清。根据本发明，在所述样品中测量SPLA2活性。根据本发明，可通过由Pernas 等人(1991 Biochem Biophys Res Commun 178 1298-1305)改良的根据 Radvanyi 等人(1989 Anal Biochem 177 103-9)的荧光测定法来测量SPLA2活性，这两个参考文献以引用的方式并入。具体来说，使用以下测定法。使用1-十六酰-2-(1-芘癸酰基)-sn-甘油-3-磷酸甲醇钠盐anterchim，Montlucon，France)作为sPLA2的底物。用sPLA2水解此底物可得到1-芘癸酸，其发射397nm的荧光。将0. 03ml体积(E)的被等分血浆和5nmol底物在 IOmM Tris-HCKpH 8. 7)、0. 1 %白蛋白、IOmM CaCl2存在下以2. 5ml的总体积混合，并在1 分钟后于 397nm 下测量荧光(F)。用 0. IU 蜂毒 PLA2 (Sigma Chemical Co.，France)在 1
9分钟内实现底物的100%水解，1分钟反应结束时的荧光值(Fmax)因此对应于2nm0l/min/ ml (Vmax)的活性。样品活性(A)(以nmol/ml/min表示)按以下公式获得A = (Vmax^F)/ (E^Fmax)。当底物水解大于50%时稀释样品。不存在血浆的情况下的底物水解用作阴性对照且是从PLA2活性推导。所有样品都一式两份地测试。最小可检测活性和检测极限是 0. 10nmol/min/ml，且批内分析和批间分析变异系数(intra and interassay coefficient of variation) 1 ^1 10%。根据本发明，可通过改良的荧光测定法，使用自动荧光测量，利用小样品体积、改良的底物/酶比率(lOnmol/U代替50nmol/U)和控制在30°C的恒温器来测量sPLA2活性，从而提供比先前方法(批内变异系数(CV) < 10%，且批间CV < 10%)更高的精密度和灵敏度O. 7%<批内CV < 3.2%，且批间CV = 5.7% )，和基本上更短的分析完成时间。具体来说，使用以下分析法进行自动测量。使用1-十六酰-2-(1-芘癸酰基)-sn-甘油-3-磷酸甲醇钠盐anterchim，Montlucon, France)作为sPLA2的底物。用sPLA2水解此底物可得到1-芘癸酸，其发射405nm的荧光。简言之，将含Inmol荧光底物的0. 2ml 缓冲底物(IOmM Tris-HCl pH 8. 7，0. 1 %白蛋白，IOmM CaCl2)自动分配于黑色Maxisorp 微量滴定板(96孔)中。因为底物的自猝灭性质，首先在配备有搅拌装置和控制在30°C 的恒温器的Fluostar Optima荧光计中记录低荧光(Fmin) 添加30 μ 1 (100U/mL)蜂毒 PLA2 (Sigma Chemical Co.，France)会导致所有底物快速水解(100%水解)和荧光增加至最大值(Fmax)，其对应于5nmol/ml的活性。为了确定未知血液样品中的sPLA2活性，自动分配30 μ 1血清(E)并添加到底物混合物中，并在1分钟时记录荧光(F)。使用两点程序来测量每个样品的经校正荧光强度并评估酶活性(以nmol/min/ml表示)。所有样品都是一式两份地测试。样品活性(A)(以nmol/ml/min表示)按以下公式获得A = (Vmax^F)/ (E^Fmax)。不存在血清的情况下的底物水解用作阴性对照且是从PLA2活性推导。所有样品都一式两份地测试。除非另外说明，本文对于血清sPLA2活性所提供的所有数值都是根据用于自动测量的上述测定法来测量的。可用于进行所述测定的磷脂酶是分泌性磷脂酶或具有已知活性的磷脂酶，且优选是蜂毒磷脂酶。在另一个实施方案中，SPLA2活性可通过基于荧光测定的方法来确定，所述方法包括在约15°C至约40°C范围内且优选30°C的温度下，使含有所述sPLA2且从所述患者获取的生物样品与InM至15nM浓度的底物接触，血清样品体积是5 μ 1至50 μ 1且底物体积是 100μ 1至300μ 1。所用磷脂酶可以是来自蜂毒或类似蛇毒的眼镜蛇毒的磷脂酶，优选蜂毒。其可以是来自任何物种的重组磷脂酶。W02008/015M6(其以引用的方式并入)的实施例2中描述此测定法。所述方法的优势是所用底物的样品体积很小和恒温，从而提供更高的精确度和灵敏度。可选地，可使用如上定义的自动荧光分析测量的变体，其可减轻可能由荧光强度的非特异性增加而引起的不精确性，所述非特异性增加是因为样品中存在其它因子，从而干扰SPLA2活性的测量。此方法和上文定义的自动荧光分析测量方法的唯一区别在于使用以下公式来确定sPLA2活性
A = F*s/[(Fmax-Fmin)*V]其中-A 代表 sPLA2 活性，以 nmol/min/ml 表示；-S代表底物数量，以nmol表示(在200 μ 1体积的工作溶液中通常为lnmol)；-V代表样品体积，以ml表示(通常为0. 30至0. 50ml)；-(Fmax-Fmin)代表在蜂毒PLA2存在下于反应结束时的最大荧光信号与阴性对照之间的差值；-F代表线性范围内的曲线起始斜率，所述曲线代表作为时间函数的荧光发射，以 min 1表不。W02008/015M6(其以引用的方式并入)的实施例4中描述自动荧光分析测量的这种变体。根据本发明，在所述样品中测量OxPL/apoB。US2006/177435(其以引用的方式并入)中描述用于测量OxPL/apoB比率的方法。 所述方法是基于确定样品中的OxPL水平，确定样品中的apoB水平，和然后计算OxPL/apoB比率。在一个实施方案中，从受试对象获得的样品中的OxPL水平和apoB水平是用两种或更多种不同生物分子来测量。第一种生物分子与OxPL特异性地相互作用，且第二种生物分子与apoB特异性地相互作用。在一些方面中，生物分子是抗体，例如单克隆抗体。与 OxPL相互作用的抗体可例如是E06或DLH3。在其它方面中，生物分子是抗原。在一些实施方案中，生物分子经固定以形成阵列，其包含第一组多个第一生物分子和第二组多个第二生物分子。示例性氧化磷脂包括1-棕榈酰基-2-花生四酰基-sn-甘油_3_磷酰胆碱(Ox-PAPC)、1-棕榈酰基-2-氧代戊酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POVPC)、1-棕榈酰基-2-戊二酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(PGPC)、1 -棕榈酰基_2_环氧基异前列腺素-sn-甘油-3-磷酰胆碱(PEIPC)、氧化1-硬脂酰基_2_花生四酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(Ox-SAPC)、1_硬脂酰基-2-氧代戊酰基-sn-甘油_3_磷酰胆碱(SOVPC)、1_硬脂酰基-2-戊二酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(SGPC)、1_硬脂酰基_2_环氧基异前列腺素-sn-甘油-3-磷酰胆碱(SEIPC)、1-硬脂酰基_2_花生四酰基-sn-甘油_3_磷酰乙醇胺(Ox-SAPE)、1-硬脂酰基-2-氧代戊酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(SOVPE)、1-硬脂酰基-2-戊二酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(SGPE)和1_硬脂酰基_2_环氧基异前列腺素-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(SEIPE)的氧化形式。本文所用的术语“生物分子(biological molecules)，，和“生物分子 (biomolecules) ”可互换使用。这些术语旨在广泛解释，且一般涵盖多肽、肽、寡糖、多糖、寡肽、蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核苷酸包括例如DNA和RNA，例如呈适体 (aptamer)形式。生物分子还包括有机化合物、有机金属化合物、有机和有机金属化合物的盐、糖、氨基酸和核苷酸、脂质、碳水化合物、药物、类固醇、凝集素、维生素、矿物质、代谢物、 辅因子和辅酶。生物分子另外包括所述分子的衍生物。举例来说，生物分子的衍生物包括寡肽、多肽、肽和蛋白质的脂质和糖基化衍生物，例如抗体。生物分子衍生物的其它实例包括寡糖和多糖的脂质衍生物，例如脂多糖。
用于鉴定特定蛋白质(例如OxPL和apoB)的示例性生物化学测试利用标准化测试型式，例如酶联免疫吸附测定或ELISA测试，但本文提供的信息可用于其它生物化学或诊断测试的开发且不限于ELISA测试的开发(关于ELISA测试的描述可参看例如 Molecular Immunology :A Textbook, Atassi 等人编辑，Marcel Dekker Inc. , New York 禾口 Basel 1984)。应了解可使用针对各种血浆组分的商业酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。W001/88547(其以引用的方式并入)中描述用于测量OxPL/apoB比率的改良方法。 所述改良方法打算通过使用磷酰胆碱(PC)来标准化测定法。根据所述方法，可通过首先利用与氧化和未经氧化的LDL结合的抗体(例如抗apoB抗体)在微量滴定孔上捕捉LDL，然后用经标记的E06抗体检测OxLDL来进行免疫测定。可选地，E06抗体可结合于微量滴定孔的底部，并使用经标记的抗LDL抗体来确定结合的OxLDL量。OxLDL也可用于涂布微量滴定孔，且可将各种浓度的患者血清(推定含有OxLDL)与恒定且有限量的经标记(例如经生物素标记)的E06或T15混合以竞争结合板上的OxLDL。对于每个测定，在标准条件下，使用PC作为竞争剂来产生标准曲线。可选地，可使用PC作为竞争剂来源代替患者血清来进行一组平行反应。PC可单独使用，或与载体蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH))连接。根据本发明，将针对SPLA2活性和OxPL/apoB和任选其它心血管风险因子所获得的测量值在统计分析中组合，其中sPLA2活性和OxPL/apoB和任选其它心血管风险因子的组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。所属领域技术人员将了解，有多种方法可使用两种或更多种风险因子的测量值以便改进研究中的诊断/预后问题。在一非常简单但通常有效的方法中，如果样品对于所研究的标志中的至少一种呈阳性，那么采用阳性结果。例如，当诊断传染病如AIDS时，情况可能如此。然而，通常评估风险因子的组合。优选地，将针对sPLA2活性和OxPL/apoB和任选其它心血管风险因子所获得的测量值在数学上组合，且使组合值与潜在诊断/预后问题相关联。风险因子测量值可通过适当技术水平的数学方法来组合。用于将标志组合与疾病相关联的众所周知的数学方法利用诸如以下的方法判别分析(DA)(即线性、二次、正则化DA)、Kernel Method(即 SVM)、非参数方法(即k最邻近分类器(k-Nearest-Neighbor Classif ier))、PLS (偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主成分的方法(即SIMCA)、广义相加模型(Generalized Additive Model)、基于模糊逻辑的方法、神经网络和基于遗传算法的方法。所属领域技术人员在选择适当方法以评估本发明的标志组合方面没有问题。优选地，用于将本发明的风险因子组合与具有心血管疾病或心血管事件的风险或处于具有心血管疾病或心血管事件的风险下相关联的方法选自DA(即线性、二次、正则化判别分析)、Kernel Method(即SVM)、非参数方法(即k最邻近分类器)、PLS (偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于这些统计方法的细节见于以下参考文献Ruczinski，I.， Kooperberg C.，LeBlanc, M.，Logic regression，J. of Computational andGraphical Statistics，12(2003)475—511 ；Friedman，J. H.，RegularizedDiscriminant Analysis,J. of the American Statistical Association,84(1989) 165-175 ；Trevor Hastie, Robert Tibshirani and Jerome Friedmann, TheElements of Statistical Learning, Springer Verlag,2001 ；Breiman, L. , Friedman, J. H. , Olshen, R. A. , Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California :ffadsworth ；Breiman, L. , Random Forests, Machine Learning,45(2001)5-32 ；Pepe, Μ. S. , The Statistical Evaluation of Medical Tests forClassification and Prediction, Oxford Statistical Science Series,28(2003)；禾口 Duda, R. 0. , Hart, P. Ε. , Stork, D. G. , Pattern Classification, Wileylnterscience，第 2 版(2001)。在本发明的一个实施方案中，使用风险因子的潜在组合的优化多变量截止值来区分状态A和状态B，例如患病和基本健康。在此类分析中，风险因子不再独立，而是形成风险因子组。与基本健康的受试对象相比，或与已诊断出心血管疾病或事件的受试对象相比，组合sPLA2活性和OxPL/apoB的测量值会显著提高对于心血管疾病和/或心血管事件的诊断
/预后精确度。在本发明的一个实施方案中，SPLA2活性和OxPL/apoB和任选其它心血管风险因子的的测量值的统计分析是基于使用标准程序的比值比(oddsratio ；0R)测定。比值比是通过将测试组中的比值除以对照组中的比值来计算。事件的比值是计算为事件数除以非事件数。如果事件的比值大于1，那么所述事件比非事件更有可能发生(确定会发生的事件的比值是无穷大)；如果比值小于1，那么所述事件将不会发生(不可能事件的比值是0)。一般来说，关联强度(strength of association)被报道为比值比(OR)(具有95%的置信下限(LCL)和置信上限(UCL))，表明指示具有疾病或处于具有或发展疾病的风险下的因子增大(0R> 1)。95%置信区间(95% Cl)是我们可以确信(在计算概率上，本文是95% )将发现正评估的群值的数值范围。置信区间指示证据力度；当置信区间很宽时，其对效果估算值的指示不够精确。试验的样本量越大，结果事件的数量就越大，且越确信真实相对风险减小接近于所述值。因此置信区间变窄且“精确度”提高。为了安心地接受所计算的OR是可靠、重要或临床上显著的，如果0R> 1，那么置信区间的下限或置信下限应> 1，或者若OR < 1，那么置信区间的上限应< 1。在本发明的另一个实施方案中，诊断/预后方法的精确度可由其接受者操作特征(receiver-operating characteristics, ROC)最好地描述(特另ll参看 Zweig, Μ. H.,禾口 Campbell,G.，Clin. Chem. 39(1993)561-577)。ROC曲线是通过在所观察数据的整个范围上连续改变决策阈值而产生的所有灵敏度/特异性对的图。实验室试验的临床表现取决于其诊断精确度，或将受试对象正确地分类为临床相关子群的能力。诊断精确度衡量试验正确地区分所研究受试对象的两种不同状态的能力。 所述状态例如是健康和疾病。在每种情况下，ROC曲线通过对于决策阈值的完全范围将灵敏度与1-特异性作图来描绘两种分布之间的重叠。y轴是灵敏度，或真阳性率[定义为(真阳性测试结果数)/ (真阳性测试结果数+假阴性测试结果数)]。这在疾病或病症存在下已被称为阳性。其是从患病子群单独计算而来。χ轴是假阳性率，或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)]。其是特异性指数且完全从未患病子群计算而来。因此真阳性率和假阳性率是使用两个不同子群的测试结果完全分开计算，所以ROC曲线与样品中的疾病发病率无关。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。 利用完全判别(两个结果分布无重叠)的测试具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性率是1.0或100% (完全灵敏)，且假阳性率是0(完全特异)。无判别(两组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极限之间。(如果ROC曲线完全低于45°对角线，那么这容易通过将“阳性”标准从“大于”颠倒为 “小于”或从“小于”颠倒为“大于”来校正)。定性地，曲线越接近于左上角，总测试精确度就越高。用于量化实验室试验的诊断精确度的一个适宜目标是用单个数字表达其表现。最常用的全局量度是ROC曲线下面积。根据惯例，此面积总是为0.5(如果不是，那么可颠倒决策规则以使其如此)。值在1.0(两组测试值完全分开)与0.5(两组测试值之间无明显分布差异)之间。面积不仅取决于曲线的特定部分，例如最接近对角线或90%特异性下的灵敏度的点，而且取决于整个曲线。这是ROC曲线有多接近完美曲线(面积=1.0)的定量描述性表达。在本发明的一个实施方案中，将SPLA2活性与OxPL/apoB和任选其它风险因子的组合值与参考值比较。在一个实施方案中，参考值可以是指数值，或可自一个或一个以上心血管疾病和/ 或心血管事件的风险预测算法或计算指数获得。参考值可相对于自群体研究获得的数字或值(包括(不限于)具有类似的身体质量指数、总胆固醇水平、LDL/HDL水平、收缩压或舒张压的受试对象、相同或类似年龄范围的受试对象、相同或类似种族群的受试对象、具有动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成或CAD、PAD或CVD的家族史的受试对象)，或相对于经历动脉血管疾病(例如动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、CAD、PAD或CVD)治疗的受试对象的起始样品。所述参考值可获自从动脉血管疾病的数学算法和计算指数获得的群体统计分析和/或风险预测数据，例如但不限于Framingham研究中报道的算法、NCEP/ATP III 等。心血管风险因子参考值也可使用算法和其它统计和结构分类方法来构建和使用。在本发明的一个实施方案中，参考值是从衍生自一个或一个以上如上文所定义的基本健康的受试对象的对照样品中OxPL/apoB和sPLA2活性和任选其它心血管风险因子的组合获得。此类基本健康的受试对象缺少心血管疾病的传统风险因子例如，那些受试对象的血清胆固醇水平小于200mg/dl，收缩压小于或等于120mm Hg，舒张压小于或等于80mm Hg，目前不吸烟，无诊断出的糖尿病病史，先前未诊断出急性冠脉综合症或高血压，以及上述其它风险因子，或可通过所属领域中已知的心血管疾病的另一种侵入性或非侵入性诊断测试来验证，例如但不限于心电图(ECG)、颈动脉B型超声波(用于内中膜厚度测量)、电子束计算机断层摄影术(EBCT)、冠状动脉钙化计分、多层高解析度计算机断层摄影术、核磁共振、运动负荷试验、血管造影术、血管内超声波(IVUQ、其它相衬和/或放射性同位素成像技术或其它激发测试技术。在另一个实施方案中，在所述测试之后的诊断上相关的时期(“纵向研究”)内监测和/或周期性再测试所述受试对象以验证心血管疾病或急性脑血管事件(无疾病或事件生存)的持续不存在。所述时期可以是从确定参考值的起始测试日期算起的1年、2年、2 到5年、5年、5到10年、10年、或10年或以上。此外，可使用适当累积的历史受试对象样品中的OxPL/apoB和sPLA2活性水平的追溯测量来产生这些参考值，从而缩短所需研究时间，假定受试对象在产品诉求(product claim)的预期水平的干预期间已被适当跟踪。
在另一个实施方案中，参考值也可从自一个或一个以上下列受试对象获得的样品中的OxPL/apoB和sPLA2活性和任选其它心血管风险因子的组合获得(1)先前通过一种上述侵入性或非侵入性技术已被诊断或鉴定出心血管疾病或心血管事件，或罹患心血管事件或斑块破裂的受试对象，和O)尚未经历复发心血管事件的受试对象。在另一个实施方案中，参考值也可从自一个或一个以上下列受试对象获得的样品中的OxPL/apoB和sPLA2活性和任选其它心血管风险因子的组合获得处于发展心血管事件的高风险下的受试对象，或处于发展动脉粥样硬化或动脉粥样硬化血栓形成斑块破裂的高风险下的受试对象。在本发明的另一个实施方案中，参考值也可从自一个或一个以上因为心血管疾病的治疗和/或疗法而显示心血管风险因子改善的受试对象获得的样品中的OxPL/apoB和 SPLA2活性和任选其它心血管风险因子的组合获得。所述改善包括身体质量指数减小、总胆固醇减少、LDL水平降低、HDLC水平增加、收缩压和/或舒张压降低或其它上述风险因子或
其组合。在本发明的一个实施方案中，参考值是指数值或基线值。指数值或基线值来源于一个或一个以上不具有心血管疾病(例如动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、CAD、PAD 或CVD)的受试对象，或无心血管疾病症状的受试对象。基线值也可来源于已经显示心血管风险因子改善(因为心血管治疗或疗法)的受试对象。所述改善包括(不限于)身体质量指数减小、总胆固醇减少、LDL水平降低、HDLC水平增加、收缩压和/或舒张压降低或其组
I=I O在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括组合SPLA2活性和OxPL/apoB与临床和生物指数，例如年龄、高血压病史、糖尿病、心肌梗塞、心脏衰竭、冠脉造影术或血管成形术、Killip分级、ST段偏移、冠状动脉血运重建(血管成形术或冠状动脉搭桥手术)和肌酸酐。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括-测量在从所述受试对象获得的样品中至少两个心血管风险因子a)sPLA2 活性，和b)载脂蛋白B-100粒子上的氧化磷脂(OxPL/apoB)，和至少一个选自Framingham 风险评分(FRS)、CRP、apoB100 的 IgM IC (IgM 免疫复合物)或IgM MDA-LDL(IgM丙二醛LDL)、Lp-PLA2活性和sPLA2质量的心血管风险因子，-组合所述测量值，组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。根据所述实施方案，FRS是使用先前报道的算法计算而来，所述算法考虑年龄、 性别、总胆固醇、HDL-C、收缩压和舒张压、吸烟情况和糖尿病的存在(Wilson P. W.等人， Circulation. 1998 ；97 :1837_1847，其以引用的方式并入)。根据所述实施方案，CRP可通过所属领域中已知的方法来测量，例如Arima等人 (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 年 7 月；28 (7) :1385-91)和 Ridker 等人(New England Journal of Medecine，2000，342 :836-843)中所述的方法，所述文献以引用的方式并入。
根据所述实施方案，apoBlOO的IgM IC和IgM MDA-LDL可通过所属领域中已知的方法来测量，例如根据 iTsimikas 等人(2004，Circulation, 110 :1406-1412 和 2003 J.Am. Coll. Cardiol. 41 =360-370)的方法，所述文献以引用的方式并入。根据所述实施方案，Lp-PLA-2活性可通过所属领域中已知的方法来测量，例如根据 Kiechl 等人(2007，Atherioscler. Thromb. Vase. Biol. 27 :1788-1795)的方法，所述文献以引用的方式并入。举例来说，Lp-PLA2活性可使用市售试剂盒(Azewell Inc)基于Kosaka 等人(2000 Clin. Chim. Acta 296 :151_161，其以引用的方式并入)的方法来测量。LpPLA2 活性也可通过W02005074604中所述的方法来测量，所述文献以引用的方式并入。根据所述实施方案，SPLA2质量可使用免疫分测定法，利用对SPLA2-IIA具有特异性的单克隆抗体(Cayman Chemical Company)来测量。在一个实施方案中，本发明的方法包括组合SPLA2活性、OxPL/apoB和FRS测量。在另一个实施方案中，本发明的方法包括SPLA2活性、OxPL/apoB、FRS和CRP测量。在另一个实施方案中，本发明的方法包括SPLA2活性、OxPL/apoB、FRS和sPLA2质
量测量。根据本发明，上文所述的方法是用于鉴别受试对象是否具有心血管疾病和/或心血管事件或是否处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。在本发明的一个实施方案中，所述心血管疾病和/或心血管事件是代谢综合症、X 综合症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定性和不稳定性心绞痛、 中风、主动脉和其旁支的疾病(例如主动脉血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病和任何急性缺血性心血管事件。任选地，选择被鉴定为具有心血管疾病或心血管事件或处于发展心血管疾病或心血管事件的风险增加下的受试对象来接受治疗方案以减缓心血管疾病的进展，或降低或预防发展心血管疾病或心血管事件的风险。根据本发明，上文所述的方法是用于在有需要的受试对象中监测心血管疾病或事件，所述心血管疾病或事件是代谢综合症、X综合症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定性和不稳定性心绞痛、中风、主动脉和其旁支的疾病(例如主动脉血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病和任何急性缺血性心血管事件。在本发明的一个实施方案中，上文所述的方法是用于在有需要的受试对象中评定心血管疾病的进展。在本发明的另一个实施方案中，上文所述的方法是用于监测心血管疾病的治疗效率。治疗功效将由心血管风险因子的测量值的变化来反映。如果治疗具有期望效果，那么与在治疗前获得的测量值和组合值相比，心血管风险因子的测量值将降低和因此组合值将降低。在本发明的另一个实施方案中，上文所述的方法是用于针对被诊断为具有心血管疾病或处于心血管疾病风险下的受试对象选择治疗方案。本发明的另一个目的是一种鉴定受试对象是否具有心血管疾病和/或心血管事件或是否处于具有或发生心血管疾病和/或心血管事件的风险下的试剂盒，其包含-用于测量SPLA2活性的工具，和
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-用于测量OxPL/apoB的工具。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于组合测量值以便获得组合值的工具。用于组合心血管风险因子的测量值的所述工具是允许统计分析的算法，例如 DA(即线性、二次、正则化判别分析)、Kernel Methods (即SVM)、非参数方法(即k最邻近分类器)、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。在另一个实施方案中，用于测量SPLA2活性的所述工具是-sPLA2 缓冲液，-易于由sPLA2水解的化合物，其水解产物可直接或间接定量，-对照SPLA2活性样品。根据所述实施方案，易于由SPLA2水解的化合物是所述酶的天然或非天然底物。 在水解产物无法独立定量的情况下，可使用可与这些产物反应且得到可定量化合物的化合物，这样的方法是间接定量法。一般来说，容易由SPLA2水解的化合物是包含荧光或发色部分的磷脂或磷脂类似物。举例来说，所述磷脂是在2位经荧光酰基取代的甘油磷脂，例如 1-十六酰-2-(1-芘癸酰基)-sn-甘油-3-磷酸甲醇或荧光酰基1-芘癸酰基，辣根过氧化物酶的底物是例如3，3’，5，5’四甲基-联苯胺(TMB)。根据本发明容易使用的荧光酰基是例如经所属领域中众所周知的荧光基团(例如芘或荧光素)取代的酰基。可选地，可使用放射性甘油磷脂，例如在2位经放射性酰基取代的甘油磷脂，或放射性磷脂酰乙醇胺。对照sPLA2活性样品包括例如蜂毒sPLA2。在另一个实施方案中，所述用于测量OxPL/apoB的工具是-与OxPL特异性地相互作用的抗体，例如E06、T15或DLH3，和-与apoB特异性地相互作用的抗体，例如MB47，-任选地，对照OxPL样品。根据此实施方案，所述对照OxPL样品可以是含有磷酰胆碱(PC)的样品。PC可单独使用，或与载体蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH))连接。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可进一步包含用于测量至少一种选自 Framingham 风险评分(FRS)、CRP、apoBlOO 的 IgM IC 或 IgMMDA-LDL 和 LpPLA-2 的心血管风险因子的工具。根据所述实施方案，Framingham风险评分(FRS)是通过所属领域中已知的方法来确定，例如 Wilson PW 等人(Circulation. 1998 年 5 月 12 ；97 (18) :1837-47)和 D，Agostino 等)κ (JAMA :The Journal of the AmericanMedical Association. 2001 ；286 :180-187) ψ 所述的方法，所述文献以引用的方式并入。根据所述实施方案，用于测量CRP的所述工具是例如-CRP 缓冲液，-与CRP特异性地相互作用的单克隆抗体，-对CRP具有特异性的酶交联抗体，-对照CRP水平。根据所述实施方案，用于测量apoBlOO的IgM IC的所述工具是例如
-apoBlOO 的 IgM 缓冲液，-化学发光试剂，-对人apoBlOO具有特异性的单克隆抗体，-经碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体，-apoBlOO的IgM IC水平对照样品。根据所述实施方案，用于测量IgM MDA-LDL的所述工具是例如-MDA-LDL 缓冲液，-化学发光试剂，-经碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体，-apoBlOO 的 IgM MDA-LDL 水平对照样品。根据所述实施方案，用于测量Lp-PLA-2的所述工具是例如-还原样品中的活性硫醇的化合物，和-在酶活性Lp-PLA2存在下被转化为游离硫醇产物的底物。任选地，所述工具可进一步包括与Lp-PLA2特异性地相互作用的抗体，例如单克隆抗体 2C10、4B4、B200、B501、90D1E、90E3A、90E6C、90G11D 或 90F2D。举例来说，还原活性硫醇的所述化合物和在酶活性Lp-PLA2存在下被转化为游离硫醇产物的所述底物描述于W02005074604，其以引用的方式并入。根据所述实施方案，用于测量SPLA2质量的所述工具是例如-SPLA2质量缓冲液，-与SPLA2-IIA特异性地相互作用的单克隆抗体，-对sPLA2IIA具有特异性的酶交联抗体，-对照sPLA2质量水平。
图1 研究参与者的基线特征。图2 根据SPLA2活性或Lp_PLA2活性和OxPL/apoB的组合三分位(tertiles)，在跟踪期间的相关冠状动脉疾病的未经调整的比值比。图3 根据SPLA2活性或Lp_PLA2活性和OxPL/apoB的组合三分位，在跟踪期间的相关冠状动脉疾病的经调整的比值比。图4 =FRS和FRS与OxPL/apoB、Lp_PLA2活性、sPLA2活性和CRP中的至少一种的组合的ROC下面积。图5 基于OxPL/apoB和sPLA2活性、sPLA2质量和Lp_PLA2的三分位的CAD比值比。OxPL/apoB 的三分位截止值是< 1150 RLUU151-2249 RLU 和 > 2249RLU，sPLA2 活性水平的三分位截止值是< 4. 05nmol/min/ml、4. 05-4. 83nmol/min/ml 和> 4. 83nmol/ min/ml, sPLA2 质量水平的三分位截止值是< 6. 80mg/dl、6. 80-11. 29mg/dl 和> 11. 19mg/ dl，且 Lp-PLA2 活性的三分位截止值是< 44. 05nmol/min/ml、44. 05-56. 23nmol/min/ml 和 > 56. 23nmol/min/mlο图6 =FRS和FRS与OxPL/apoB、Lp_PLA2活性、sPLA2活性和CRP中的至少一种的组合的ROC下面积。图 7 每个 Framingham 风险评分组内的 OxPL/apoB ( < 1150、1151-2249 和 > 2249 RLU ； (A))、SPLA2 活性(< 4· 05、4· 05-4. 83 和 > 4. 83nmol/min/ml ； (B))、SPLA2 质量(< 6. 80,6. 80-11. 29 和> 11. 19mg/dl ； (C) )、Lp-PLA2 活性(< 44. 05,44. 05-56. 23 禾口 > 56. 23nmol/min/ml ； (D))和未来CAD风险的三分位组之间的关系。Framingham风险评分被计算为低风险(10年后的事件风险< 10%)、中等风险(10%至20%)和高风险(> 20% )。图中的ρ值代表对应生物标志的每个三分位与每个生物标志的低FRS分类中的最低三分位的比较。
实施例方法先前已经公开了欧洲癌症和营养前瞻性调查(EPIC-Norfolk)跟踪研究的详细描述(Day N.等人，Br. J. Cancer, 1999 ；80 增刊 I :95-103)。简言之，设计 25，663 名男性和女性的此项前瞻性群体研究以研究癌症的饮食和其它决定因素，所述男性和女性是从诺福克(Norfolk)的全科诊所的年龄-性别登记簿招募而来，年龄在45和79岁之间。参与者完成基线问卷调查，在1993年与1997年之间就诊，且被跟踪到2003年11月，平均达到约 6年。在英国国家统计局存在死亡证明的所有个体被做上标记，其中确定整个群组的生存状态。此外，使用参与者独特的国家健康服务号码，通过与东部诺福克卫生局数据库(fest Norfolk Health Authority database)的数据联系(其鉴别出诺福克居民在英格兰和威尔士的所有医院联系)，可鉴别出住过院的参与者。此项研究获得诺里奇卫生局伦理委员会 (NorwichHealth Authority Ethics Committee)批准，且所有参与者都签署了书面知情同息。研究群体(图1)在Epic-Norfolk研究的参与者中进行巢式病例(nested-case)对照研究。病例确定在其它地方已有详细描述(BoekhoIdt, S. Μ. , Circulation, 2004 ；110 :1418-1423)。简言之，从诺福克的全科诊所的年龄-性别登记簿招募年龄在45与79岁之间的25，663名健康男性和女性。参与者完成基线问卷调查，在1993年与1997年之间就诊，且被跟踪平均6年。 排除在基线就诊时报道有心脏病发作或中风病史的个体。病例确定先前已有描述。在英国国家统计局存在死亡证明的所有个体被做上标记，其中确定整个群组的生存状态。此外，使用参与者独特的国家健康服务号码，通过与东部诺福克卫生局数据库的数据联系(其鉴别出诺福克居民在英格兰和威尔士的所有医院接触)，可鉴别出住过院的参与者。如果参与者住过院和/或因CAD作为潜在原因而死亡，那么他们可在跟踪期间被鉴别为具有CAD。根据国际疾病分类法第9修订版，CAD被定义为编码410至414。这些编码涵盖CAD的临床范围，例如不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛和心肌梗塞。对照是在跟踪期间持续不出现任何心血管疾病的研究参与者。排除在基线就诊时报道有心脏病发作或中风病史的个体。依据性别、年龄(5年内)和登记时间(3个月内)，对每个病例匹配两个对照。尚未收集到关于非心脏事件的数据。此项研究获得诺里奇卫生局伦理委员会批准，且所有参与者都签署了书面知情同意书。研究测量
生物样品由剑桥大学临床生物化学系储存在-80 °C。用RA 1000 (BayerDiagnostics, Basingstoke, UK)测量新鲜样品中的总胆固醇、HDL-胆固醇(HDL-C)和甘油三酯的血清水平，并用Friedewald公式(Friedewald WT.等人，CHn Chem. 1972 ；18 =499-502)计算LDL-胆固醇(LDL-C)水平。用先前所述(Bruins P.等人 Circulation. 1997 ；96 :3542-3548)的夹心型 ELISA 测量 CRP 水平。通过由Pernas 等人(Biophys Res Commun. 1991 ；178 :1298-1305)改良的 Radvanyi等人(Anal Biochem. 1989 ；177 :103-109)的选择性荧光测定法来测量血清sPLA2 活性。如先前所述(Mallat Z.等人 J Am Coll Cardiol. 2005 ;46 1M9-1257)使用荧光底物I-十六酰-2-(1-芘癸酰基)-sn-甘油-3-磷酸甲醇钠盐(Interchim, Montlucon, France)来测量 sPLA2 活性。使用 0. 1 单位蜂毒 PLA2 (Sigma Chemical Co. , France)测量到荧光底物100%水解。使用不存在血浆情况下的底物水解作为阴性对照，且所述水解是从 PLA2活性推导。所有样品都一式两份地测试，且血浆活性以nmol/min/ml表示。最小可检测活性是 0. 10nmol/min/mlo 通过测量具有低(1. 25nmol/min/ml)和高(9. 5nmol/min/ml) sPLA2活性的样品来确定sPLA2活性荧光测定法的不精确性。批内CV在2. 7% (低活性样品)到3. 2% (高活性样品)范围内，且批间CV是5. 7%。如Tsimikas 等人(Current Opinion in Lipidology，2008，19 :369_377，其以引用的方式并入)所述，用抗体E06测量OxPL/apoB水平。随机分析所有样品以便避免系统偏差。研究者和实验室人员对辨别信息不知情， 且仅可通过数字辨别样品。统计分析考虑病例与匹配对照之间的匹配，比较它们之间的基线特征。对于连续变量使用混合效应模型，且对于分类变量使用条件逻辑回归。因为甘油三酯、CRP、OxPL/apoB, sPLA2 抗原水平和SPLA2活性具有偏斜分布，所以值在用作统计分析中的连续变量之前经过对数变换；然而，表格中显示未变换中值和对应的三分位间范围(intertertile range) 0三分位是基于对照中的分布。对于性别特异性分析，使用性别特异性三分位，且对于汇集分析，使用基于性别组合的三分位。此外，计算皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)以评定作为连续变量的sPLA2活性与风险的其它连续生物标志之间的关系。使用条件逻辑回归分析来计算比值比和对应的95%置信区间(95% Cl)，其作为相关CAD的相对风险的估算值。最低 sPLA2活性或最低Lp-PLA2活性和最低OxPL/apoB三分位用作参考分类。调整以下心血管风险因子的比值比身体质量指数、糖尿病、收缩压、LDL-C、HDL_C 和吸烟(从未、曾经、当前)。也调整FRS评分的比值比。Framingham风险评分是使用先前报道的算法来计算，所述算法考虑年龄、性别、总胆固醇、HDL-C、收缩压和舒张压、吸烟和糖尿病的存在(ffiIsonP. W.等人，Circulation. 1998 ；97 :1837-1847)。使用 SPSS 软件(版本12. 0. 1 ；Chicago, III)进行统计分析。P值< 0. 05被视为指示统计显著性。结果组合测量SPLA2活性和OxPL/apoB以评定相关CAD的风险我们选择了在跟踪期间发生CHD的病例，以及持续不出现心血管疾病的对照，并依据性别、年龄和登记时间将它们匹配。增高的sPLA2和Lp-PLA2活性和增高的OxPL/apoB显著提高CHD事件的风险。OxPL/apoB和LpPLA2活性的最高三分位中的人的比值比是2. 22(1. 51-3. 27)，且OxPL/apoB和sPLA2活性的最高三分位中的患者的比值比是 4. 34(2. 84-6. 64)(此两者与其最低三分位相比，ρ < 0. 0001)(图2和图3表示针对FRS评分调整的0R)。图5所示的结果是基于763个病例和1397个对照，其中可获得表1中列举的所有受试对象特征。图5显示SPLA2活性和OxPL/apoB的最高三分位中的受试对象具有显著升高的未来CAD风险，与最低三分位中的受试对象相比，OR是3. 46 (2. 22-5. 42)。对于sPLA2质量和 OxPL/apoB记录到类似但更弱的关系(0R2. 39(1. 58-3. 61))。接受者操作曲线下面积揭示通过向传统风险因子和FRS中添加OxPL/apoB和 sPLA2活性而显著增加的值(图4)。图6所示的结果是基于763个病例和1397个对照，其中可获得表1中列举的所有受试对象特征，且这些特征证实向传统风险因子和FRS中添加OxPL/apoB和sPLA2活性可增加预测值。为了评定氧化生物标志是否将额外预测值提供给FRS，在每个FRS风险估算值内评估OxPL/apoB、sPLA2质量、sPLA2活性和Lp_PLA2活性的三分位(图7)。在低FRS分类中，OxPL/apoB量度不提供额外预测值，但sPLA2质量和活性显示比值比几乎增加至三倍。 然而，在高FRS估算值中，OxPL/apoB使用于预测新心血管事件的比值比增加至两倍以上， sPLA2质量和活性的预测能力略低。OxPL/apoB与sPLA2活性的组合尤其适用于反映FRS分类中的风险调整。举例来说，在低FRS分类中，与最低三分位相比，OxPL/apoB与SPLA2活性的最高三分位与8. 48(2. 98-24. 16,P < 0. 001)的OR(95% Cl)相关，在中间FRS分类中OR 是 5. 01(2. 28-11. 41, P < 0. 001)且在高 FRS 分类中 OR 是 14. 35(6. 2133. 17, P < 0. 001)。在前瞻性跟踪的EPIC-Norfolk群组内的此项巢式病例-对照研究证实了 OxPL/ apoB的基线水平升高与未来致命和非致命CAD事件的风险增加强烈相关。此外，OxPL、尤其 sPLA2活性的代谢中涉及的磷脂酶水平升高会增加由OxPL/apoB介导的致命和非致命CAD 事件的风险。在Bruneck研究中，通过Lp_PLA2活性，由OxPL/apoB水平介导的心血管疾病的危险比从约 2 增加至 4(Kiechl et al.，Arterioscier Thromb Vasc Biol. 2007 ；27 1788-1795)。然而，在此EPIC-Norfolk研究中记录到微弱相关。该解释并不明显，但可能由方法学的差异(前瞻性对比病例对照)引起，或更可能由研究规模(Brimeck研究中有82 个事件，而在EPIC-Norfolk研究中有763个事件)引起。
权利要求
1.一种鉴定具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的受试对象的方法，其包括-在从所述受试对象获得的样品中测量至少两个心血管风险因子a)sPLA2活性和b)载脂蛋白B-100粒子上的氧化磷脂(OxPL/apoB)，-组合所述测量值，sPLA2活性和OxPL/apoB的组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将sPLA2活性和OxPL/apoB的所述组合值与参考值比较。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括测量至少一个选自Framingham风险评分(FRS)、CRP、apoBlOO 的 IgM IC 或 IgMMDA-LDL、Lp-PLA2 和 sPLA2 质量的心血管风险因子。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中测量sPLA2活性、OxPL/apoB 和 FRS。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中测量sPLA2活性、OxPL/apoB、 FRS 禾口 CRP0
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述样品是血液样品。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述心血管疾病和/或心血管事件是代谢综合症、X综合症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、 稳定性和不稳定性心绞痛、中风、主动脉和其旁支的疾病(例如主动脉血栓形成或主动脉瘤)、外周血管疾病、脑血管疾病和任何急性缺血性心血管事件。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中OxPL/apoB是利用与OxPL相互作用的抗体和与apoB相互作用的抗体以免疫测定法来测量。
9.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中SPLA2活性是利用SPLA2的底物以荧光测定法来测量。
10.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，用于监测心血管疾病的治疗功效。
11.一种用于鉴定受试对象是否具有心血管疾病和/或心血管事件或是否处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的试剂盒，其包含 -用于测量SPLA2活性的工具，和 -用于测量OxPL/apoB的工具。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其进一步包含用于组合测量值以便获得组合值的工具。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述用于测量SPLA2活性的工具是 -sPLA2缓冲液，-易以由sPLA2水解的化合物，其水解产物可直接或间接定量，例如1-芘癸酰基， -对照sPLA2活性样品。
14.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述用于测量OxPL/apoB的工具是 -与OxPL特异性地相互作用的抗体，例如E06、T15或DLH3，和-与apoB特异性地相互作用的抗体，例如MB47， -对照OxPL样品。
15.根据权利要求11至14中任一权利要求所述的试剂盒，其进一步包含用于测量至少一种选自 Framingham 风险评分(FRS)、CRP、apoB 100 的 IgM IC 或 IgM MDA_LDL、Lp_PLA2 和sPLA2质量的心血管风险因子的工具。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下的受试对象的方法，其包括在从所述受试对象获得的样品中测量至少两个心血管风险因子a)sPLA2活性和b)载脂蛋白B-100粒子上的氧化磷脂(Ox PL/apo B)，组合所述测量值，sPLA2活性和Ox PL/apo B的组合值指示具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发展心血管疾病和/或心血管事件的风险下。
文档编号G01N33/68GK102239412SQ200980148523
公开日2011年11月9日 申请日期2009年10月2日 优先权日2008年10月3日
发明者A·特奇, Z·马勒特, 索蒂里奥斯·齐米卡斯, 约瑟夫·魏茨滕 申请人:加利福尼亚大学董事会, 国立健康与医学研究所, 巴黎大学迪德罗特第七分校