专利名称：一种检测相思子毒素的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的上述相思子毒素免疫层析试纸，其中兔源抗相思子毒素的多克隆抗体制备方法相思子毒素经甲醛减毒处理，分三次免疫家兔，首次免疫剂量为500 i！ g/只，加强免疫于首次免疫2周后进行，剂量为300 ii g/只，加强免疫每间隔2周进行一次，8周后用不含佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫免疫，剂量为800iig/只，一周后心脏穿剌采血，分离血清，血清经50%硫酸铵盐析沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上清，沉淀用PBS(0.02mol/L pH7. 0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用Hitr即rProtein AFF或Hitrap rProtein G FF预装柱制备高纯度的抗体。 本发明涉及的上述相思子毒素免疫层析试纸，其中特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体制备方法相思子毒素用1^甲醛减毒处理，对6 8周龄的Balb/C小鼠免疫，通过细胞融合，ELISA筛选，克隆，并采用Westerblot法鉴定其特异性，取经Westerblot鉴定为能分泌特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的细胞株，采用体外诱导法，将单克隆抗体细胞株扩大培养后注入6 8周龄Balb/C小鼠腹腔内制备腹水，制备的腹水经硫酸铵盐析法粗提后，用Hitr即rProtein A FF凝胶亲和层析柱进一步纯化，即得到高纯度的单克隆抗体。 本发明用特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体制备胶体金探针，用兔源抗相思子毒素多克隆抗体作为检测线，采用双抗体夹心法原理检测相思子毒素，既增强了其检测灵敏度，也保留了其特异性强的特点。 本发明检测相思子毒素的免疫层析试纸的积极效果在于检测特异性高、灵敏度高、稳定性好、方便、快捷。具有操作简单、检测快速、结果易于判断和方便保存，且无需任何
4仪器设备等优点，尤其适合于临床和突发事件的现场检测，适合流行病学调查大规模应用。
图1为相思子毒素单克隆抗体Westerblot鉴定结果图。 其中第l泳道为低分子量Marker ;第2、3泳道为完整的相思子毒素Westerblot检测显色结果；第4、5泳道为相思子毒素经P-巯基乙醇处理后，相思子毒素A链Westerblot检测显色结果。 图2为胶体金试纸条的检测结果图。 1、阴性结果；2、5ng/mL毒素样品检测结果；3、50ng/mL毒素样品检测结果。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1 相思子毒素抗体制备及鉴定
1、相思子毒素的制备 采用5%醋酸抽提粗毒，经高速离心(10，000g，20min)后弃沉淀物，上清液用35% 95%饱和硫酸铵分级沉淀，将沉淀物用PBS充分透析72h，所得毒素粗提物采用S印harose 6B或S印harose 4B琼脂糖亲和层析柱、DEAE-S印harose FF阴离子交换柱及Hiload 26/60Superdex75凝胶过滤层析预装柱进一步分离，结果采用SDS-PAGE电泳法分析分子量，凝胶薄层扫描测定纯度，N末端氨基酸序列测定及质谱肽指纹图谱分析鉴定，结果表明制备得到高纯的相思子毒素。 2、特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的制备 相思子毒素经lX甲醛磷酸盐缓冲液减毒处理24h后，免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体。免疫免疫程序为首次免疫每只取100iiL抗原(50iig)与100iiL完全费氏佐剂混匀，皮下多点注射。加强免疫于首免后2周进行，每只取100iiL抗原(30iig)与等量不完全费氏佐剂混匀后，腹腔注射。此后每2周免疫一次，共免四次，最后一次免疫后7天断尾采血分离血清，以2 ii g/mL原毒(未经醛化减毒处理)包被酶标板，用间接ELISA法检测抗相思子毒素血清抗体效价。若效价高于1X10-4即可用于细胞融合。超强免疫于细胞融合前3 4d尾静脉各注射无佐剂抗原50 ii g， 200 ii L/只。采用小鼠杂交瘤细胞技术制备抗相思子毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株，采用体内诱导法，分别将杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠制备了腹水；用小鼠mAb亚类鉴定试剂盒检测mAb的亚类，腹水经硫酸铵盐析法粗提后，采用Hitr即rProtein A FF亲和层析柱或Hitr即rProtein G FF亲和层析柱纯化，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度，BCA法测定其浓度；间接ELISA法检测腹水效价为1 :3. 2X105，且与相思子凝集素、蓖麻毒素及蓖麻凝集素三种类似物均无交叉反应；采用Westerblot法鉴定其特异性，结果表明所制备得到的单克隆抗体可特异性结合相思子毒素A链，与相思子凝集素、蓖麻毒素和蓖麻凝集素等均无交叉反应，表明该单克隆抗体特异性高。见图1 :图中，第l泳道，低分子量Marker ;第2、3泳道，完整的相思子毒素Westerblot检测显色结果；第4、5泳道，相思子毒素经P -巯基乙醇处理后，相思子毒素A
链Westerblot检测显色结果。 3、兔源抗相思子毒素多克隆抗体的制备 相思子毒素经甲醛减毒处理，制备得相思子毒素类毒素。用此类毒素经皮下及肌肉注射免疫家兔，首次免疫剂量为500iig/只，取等体积完全弗氏佐剂与类毒素溶液混合并完全乳化后经皮下注射免疫，强化免疫于首次注射2周后进行，免疫间隔时间为两周，剂量为300 g/只，取等体积不完全弗氏佐剂与类毒素溶液混合并充分乳化后经皮下或肌肉注射免疫，免疫8周后，用不含佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫，最后一次免疫1周后经心脏采血制备抗血清。血清经50X硫酸铵沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上清，沉淀用PBS(0.02mol/L pH7. 0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用Hitr即rProtein A FF或Hitr即rProtein G FF凝胶亲和层析制备高纯度的抗体。兔源抗相思子毒素多克隆抗体采用琼脂免疫扩散试验及ELISA法进行鉴定，结果表明与相思子凝集素、蓖麻毒素和蓖麻凝集素均无交叉反应。
实施例2
胶体金探针的制备
1、胶体金颗粒的制备 取硅化过的250mL三角瓶一个，加100mL去离子水及lmL 1%氯金酸，加热沸腾；搅动下准确加入1. 5mLl^柠檬酸三钠，继续煮沸15min，冷却后用去离子水恢复到原体积即可得到粒径25nm的胶体金颗粒。通过调节加入1 2mLl%柠檬酸三钠的量可制备出粒径15 40nm的胶体金颗粒。 2、胶体金标记特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体
取硅化过的250mL三角瓶一个，加入100mL粒径25nm胶体金；加入适量0. 2mo1/LK2C03把pH调整为8. 7，慢慢逐滴加特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体至抗体终浓度为lmg/mL，室温摇床上放置15 25min ;加入10% BSA至终浓度为5%，防止抗体蛋
白和胶体金聚合和沉淀。
3、金标垫的制备 把玻璃纤维素膜在生物安全柜内剪成0.8X30cm/条，4t:真空抽干后待用。将纯化好的胶体金探针按4mL/条的量均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在生物安全柜内通风干燥过夜，干燥条件下保存备用。
实施例3 检测相思子毒素的免疫层析试纸组装及测试
1、硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备 将纯化好的兔源抗相思子毒素多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体用PBS(O. Olmol/mL. pH7. 5)溶液分别稀释至终浓度为lmg/mL、 1. 5mg/mL。将稀释好的兔源抗相思子毒素多克隆抗体溶液装入BI0D0T划膜机喷头2，固定在距硝酸纤维素膜下边缘1. lcm的位置上，稀释好的羊抗鼠IgG多克隆抗体装入BIODOT划膜机喷头1，固定在距硝酸纤维素膜下边缘1. 6cm的位置上。参数均为1. 0 P L/cm喷在硝酸纤维膜上。将已喷好的硝酸纤维膜真空干燥2小时(24t:相对湿度40X以下)，经检查外观、长度和干燥情况等，合格后铝箔袋密封，标明半成品批号，放置材料暂存区保存。
2、免疫层析试纸的组装 免疫层析试纸的组装方法一切操作均在无灰尘、无菌、无大颗粒的情况下进行，取大小为30cmX80mm的PVC底板，将包被抗体的硝酸纤维素膜(30cmX25mm)组装到粘性PVC底板上，要求其下边缘一定要对齐模具上的黑色标记线，并小心抹平膜面。将吸水垫(30cmX35mm)紧靠模具上边缘组装到粘性底板上，并小心抹平。将包被有金标抗体玻璃纤维素膜(30cmX8mm)紧靠标尺下边缘组装到粘性底板上，并小心抹平。将样品垫(30cmX25mm)紧靠模具下边缘组装到粘性底板上，并小心抹平。用切条机切成4. 5mm宽的试纸，在装配区将切好的试纸合并0. 5g干燥剂一包放入包装袋内，-2(TC保存。
3、测试结果
(1)样品处理 检测液体乳样品视样品浓度及粘稠度用0. Olmol/L PBS(pH7. 5)溶液做适当稀释，所得溶液即可作为检测液。 检测血液样品1体积血液样品加入1体积的0. Olmol/L PBS(pH7. 5)溶液，混匀
静止10分钟，离心处理后取上清即可作为检测液。 检测食物样品将食物做粉碎处理后加入适当量的0. Olmol/L PBS(pH7. 5)溶液混匀，室温下静止30min，离心处理后取上清即可作为检测液。
(2)样本检测 取一滴待检毒素样本滴加在制备好的试纸条的加样区，样品开始在硝酸纤维素膜上扩散，待金标垫释放完全后，硝酸纤维素膜上出现清晰的T线和C线。当样品中不含相思子毒素时，用该试纸条检测时检测线无色而质控线有颜色。见图2。 图2中，试纸1 :阴性对照；试纸2 :5ng/mL ;试纸3 :50ng/mL。其中a为检测线；b
为质控线。 实施例4 相思子毒素免疫层析试纸性能的测定及实践
1、检测相思子毒素免疫层析试纸特异性的测定 应用制备的检测相思子毒素免疫层析试纸检测与相思子毒素分子结构的性质较近的相思子凝集素、蓖麻毒素、蓖麻凝集素时，结果均为阴性，表明与它们之间没有交叉反应，试纸条特异性良好。 2、检测相思子毒素免疫层析试纸敏感性 应用上述两种抗体，采用双抗体夹心ELISA法检测相思子毒素样品时，最低检测限为lng/mL。用本发明检测相思子毒素免疫层析试纸，样品中相思子毒素浓度低于5ng/mL时试纸条检测显色不清晰；当毒素样品浓度在5 40ng/mL之间时检测线显色清晰但比质控线颜色浅；当毒素样品浓度在40ng/mL以上时检测线的颜色比质控线颜色深。免疫层析试纸的灵敏度略低于ELISA法。
3、检测相思子毒素免疫层析试纸重复性 取同一样品进行五次重复试验，检测结果相一致，说明该方法具有可重复性。
4、检测相思子毒素免疫层析试纸稳定性 (1)同一批次的免疫层析试纸于37t:破坏试验期间，每天都进行试纸条的检测，在第12天时试纸条颜色的强度有所降低。说明试纸条在37t:可保存11天。
(2)同一批次的免疫层析试纸于fC保存6个月期间，每周测定的结果显色条带的颜色均很清晰，在第六个月时颜色强度有所降低；说明试纸条在fC可保存5个月，第6个月后灵敏度有所下降。 (3)同一批次的免疫层析试纸于-2(TC保存ll个月期间，分别每半个月一检测，在第IO个月时颜色强度有所降低；说明试纸条在-2(TC可保存IO个月，第ll个月后灵敏度有所下降。 5、检测相思子毒素免疫层析试纸人工模拟样本检测 对人工模拟香肠毒素样品检测用ELISA试验和制备的免疫层析试纸进行鉴别试验，结果显示当毒素样品浓度大于5ng/mL时，两种检测方法的符合率为100%。
对人工模拟牛奶毒素样品检测用ELISA试验和制备的免疫层析试纸进行鉴别试验，结果显示当毒素样品浓度大于5ng/mL时，两种检测方法的符合率为100%。
权利要求
一种检测相思子毒素的免疫层析试纸，其特征在于以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体标记胶体金制备金胶垫，将兔源抗相思子毒素的多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(T线)，用羊抗鼠IgG的多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为质控线(C线)。
2. 权利要求1所述免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤(1) 将从相思子中纯化制备得到的相思子毒素用1^甲醛减毒处理后免疫Balb/C小鼠 制备单克隆抗体；(2) 采用Westerblot方法从步骤(1)中制备得到的单克隆抗体中筛选出特异性结合相 思子毒素A链的单克隆抗体；(3) 用(2)得到的单克隆抗体标记胶体金，制备成胶体金探针，把它喷在玻璃纤维膜上 制成胶体金垫；(4) 将从相思子中纯化制备得到的相思子毒素用1%甲醛减毒处理后免疫家兔制备兔 源抗相思子毒素多克隆抗体；(5) 用兔源抗相思子毒素的多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(T线)；(6) 用羊抗鼠IgG的多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为质控线(C线)；(7) 将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸按从上到下依次固定于PVC膜板上，制 备成免疫层析试纸。
全文摘要
本发明公开一种检测相思子毒素的免疫层析试纸及其制备方法，用特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体标记胶体金制成本发明中免疫层析试纸条的金胶垫，将兔源抗相思子毒素的多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(T线)，同金胶垫一起装备成本发明的免疫层析试纸条。本发明试纸条适合于临床和突发事件的现场检测，适合流行病学调查，具有操作简单，灵敏度高、稳定性好、方便、快捷等特点，对相思子毒素中毒的鉴别诊断和及时救治具有重要意义和实际应用价值。
文档编号G01N33/531GK101738482SQ201010030819
公开日2010年6月16日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者刘国文, 刘磊, 唐佳, 孔涛, 孙佳, 宋文学, 张燚, 李小兵, 杨威, 王哲 申请人:吉林大学