专利名称：：一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的定性及定量检测方法，尤其涉及一种生物体内微囊藻毒素MC-RR及其在代谢过程中与还原型谷胱甘肽GSH和半胱氨酸Cys的结合物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的定性及定量检测方法。本发明方法适用于生物体内微囊藻毒素MC-RR及其代谢产物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的定性及定量检测，而且适用于研究微囊藻毒素在生物体中的累积、传递和代谢解毒以及对水产品的安全性进行评估。
背景技术：
：随着人类社会生产力的大幅提高及人口压力的不断增大，水体富营养化引起蓝藻水华频发，并释放有害次生代谢物，其中微囊藻毒素(microcystins，简称MCs)是蓝藻产生的一类对环境和淡水水体中的生物影响较大的肝毒素，肝脏是其主要的靶器官，同时MCs还具有肾毒性、遗传毒性、胚胎及发育毒性(谢平.太湖蓝藻的历史发展与水华灾害.北京科学出版社，2008)。MCs可以通过饮用水，食物累积等途径进入人体，从而对人类健康造成威胁，俞顺章等通过流行病学调查发现饮用水中含有MCs的地区的肝炎和肝癌发病率明显高于饮用无毒素的深井水人群(俞顺章，赵宁，资晓林等.中华肿瘤杂志，2001(23):96-99)。微囊藻毒素直接导致人类死亡的事件1996年发生在巴西Caruaru透析中心，由于该中心使用了受微囊藻毒素污染的水作为肾透析用水，结果导致了116人中毒，52人死亡的严重后果(Jochimsen，E.M.，Carmichael，W.W.，AnJ.，NewEng.J.Med.，1998(338):873-878)。谷胱甘肽是一种小分子肽类物质，广泛存在于生物体内，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸3个氨基酸组成，谷胱甘肽有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽GSH占绝大多数。半胱氨酸(Cys)是一种生物体内常见的氨基酸，可由体内的蛋氨酸转化而来，可与胱氨酸互相转化。MC-RR是亚热带湖泊中最为普遍的一种微囊藻毒素，当生物体内有MC-RR存在时，通过生物体自身的新陈代谢作用，MC-RR可与还原型谷胱甘肽GSH形成MC-RR-GSH结合物，并进一步水解成水溶性更强的MC-RR-Cys结合物(Kondo，F.，Ikai，Y.，Oka，H.，etal.，Chem.Res.Toxicol.1992(5):591，PflugmacherS，WiegandC，BeattieKA"etal.，EnvironmentalToxicologyandChemistry.2001(20):846-852)。目前对于MCs，其代谢产物及其解毒过程的研究多集中于体外实验，同时也局限于定性检测，Kondo等人在1992年首次通过化学方法制备合成了微囊藻毒素-谷胱甘肽以及半胱氨酸结合产物标准品，研究了其毒性，并通过LC-FAB-MS在大小鼠肝脏中首次定性检测到了微囊藻毒素-谷胱甘肽以及半胱氨酸结合产物(Kondo，F.，Ikai，Y.，Oka，H.，etal.，Chem.Res.Toxicol.1992(5):591-596，Kondo，F.，Matsumoto，H.，Yamada，S.，etal.，Chem.Res.Toxicol.1996(9):1355-1359)，Pflugmacher等通过液相色谱和基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱定性鉴定了体外实验中通过酶催化形成的微囊藻毒素谷胱甘肽结合物(Pflugmacher,S.，Wiegand，C.，Obere线A.，etal.，Acta.1998(1425):527-533)。3对于微囊藻毒素及其代谢产物的体内体外定量研究则少有报道，由于MC-RR及其代谢产物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys在生物样品中的浓度通常很低，干扰物质多，目前没有任何方法能同时定性定量检测这三种物质，因而需建立可靠、稳定的定量分析方法，并通过有效的富集、分离和纯化过程实现高灵敏度、高专属性分析，为进一步研究MC-RR在生物体内的代谢及其解毒过程奠定基础。
发明内容本发明的目的在于提供一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，该发明方法能同时定性和定量检测生物样品中的微囊藻毒素MC-RR及其代谢产物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys，检测结果可靠，重现性好，灵敏度高。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，该方案按照以下步骤进行1、微囊藻毒素MC-RR及其代谢产物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的提取生物组织器官样品冷冻干燥后，置于碾钵中磨细，然后在乙酸-乙二胺四乙酸二钠(EDTA)水溶液中，用超声破碎仪使组织器官细胞破碎，释放出待测物，然后在12000r/min下离心lOmin，移取上清液至干净容器中避光保存。按照上述步骤重复提取两次，合并三次上清液；2、富集、分离与纯化将步骤1所得上清液用强阳离子交换固相萃取柱(规格为3cc/60mg)实现富集和分离，收集的洗脱液于旋转蒸发仪上蒸干，再用100v/v^的甲醇分三次溶解样品并转入离心管，于旋转蒸发仪上蒸干，得到的固体残渣用去离子水溶解并定容，用于分析测定；3、定性分析HPLC-MS联用，根据MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys标准品的保留时间和特征碎片离子峰的质荷比m/z进行定性；色谱条件流动相A为0.05v/v^的甲酸，B为0.05v/v^的甲酸乙腈溶液；流速020.Omin为0.2mL/min，20.0125.Omin为0.3mL/min;色谱柱C18，100mmX2.lmmID，3.5iim;柱温40.(TC;样品盘温度10.(TC;进样体积为10ilL;洗脱程序Omin:95v/v%A，5%v/v%B，1.Omin:65v/v%A，35v/v%B，17.Omin:55v/v%A，45v/v%B，17.5min:30v/v%A，70v/v%B，18.Omin:5v/v%A，95v/v%B，20.Omin:5v/v%A，95v/v%B，20.Olmin:95v/v%A，5v/v%B，25.Omin:95v/v%A，5v/v%B;质谱条件电喷雾离子化(ESI);正离子模式；喷针电压为4.5KV;透镜电压MC-RR为55.50V，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys为45.50V;自动增益控制打开；鞘气流速为20单位，该单位为美国FinniganLCQ系统定义，从0-100;辅助气关闭；毛细管温度均为250°C;4、定量分析使用外标法，用色谱峰面积定量，配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys混合标样系列水溶液，MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度范围均为0.012.5iig/mL，在与待测物同样的色谱条件下直接进样，分别以MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由其回归方程对待测样品进行定量。本发明方法中所有冷冻干燥条件均为在_651:，真空度为0.lmbar的真空冷冻干燥机中干燥48h。本发明方法与现有技术相比有以下优点和效果1、同时定性和定量检测生物样品中的MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys;2、对MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的定性和定量检测结果可靠，重现性好，灵敏度高；3、首次检测到急性染毒鳙鱼体内MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的存在。图1和图2分别为空白鱼肝脏加标后的提取液和水溶液加标直接进样的总离子流色谱图。图1中自上而下依次为一级总离子流色谱图，MC-RR-GSH，MC-RR-Cys和MC-RR的二级总离子流色谱图，图2中自上而下依次为一级总离子流色谱图，MC-RR-GSH，MC-RR-Cys和MC-RR的二级总离子流色谱图。图3为急性染毒鳙鱼注射入MC-RR后48h内其肝脏中MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的含量变化情况。由图1和图2可以看出，鱼肝脏中的内源性物质不干扰MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的测定；由图3可以看出，注射了MC-RR的健康鳙鱼体内通过代谢作用能自发生成MC-RR-GSH禾口MC-RR-Cys。具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明方法作进一步的详细说明。实施例1:一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，其步骤是1、微囊藻毒素MC-RR及其代谢产物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的提取取冷冻干燥的鱼肝脏样品50mg，于碾钵中磨细后置于离心管中，加入5mL5v/v%的乙酸-EDTA水溶液，其中EDTA浓度为0.01mol/L。于(TC下用超声破碎仪持续超声35min，然后在12000r/min下离心10min，移取上清液至干净容器中避光保存。按照上述步骤再重复提取两次，合并以上三次上清液得溶液I，所用冰乙酸和乙二胺四乙酸二钠均为分析纯；2、待测物的富集、分离与纯化将步骤1获得的溶液I加入已预先活化的强阳离子交换固相萃取柱(规格3cc/60mg)中进行富集，待富集完毕后，依次用3mL2v/v^的甲酸，3mL90v/v^的甲醇淋洗，最后用10mL含15v/v^浓氨水的甲醇溶液洗脱。洗脱液收集于25mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再用lmL100v/v%甲醇分三次溶解样品并转入1.5mL离心管，再次蒸干，得到的固体残渣用去离子水溶解并定容至100i!L，用于分析测定，所用甲酸，甲醇和浓氨水均为分析纯；3、定性分析HPLC-MS联用，根据MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys标准品的保留时间和特征碎片离子峰的质荷比m/z进行定性；本发明方法所用MC-RR为市售环境分析用固体标准品，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys标准品参照文献方法合成(Kondo，F.，Ikai，Y.，Oka，H.，etal.，Chem.Res.Toxicol.1992(5):592)。配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度均为1.0yg/mL的混合标样水溶液作为标准对照品对待测样品进行定性分析。MC-RR及其代谢物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的电喷雾离子化二级质谱裂解特征离子见表1，MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的母离子分别为520.06,673.61和580.56。表1MC-RR及其代谢物MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的ESI二级质谱裂解特征离子5VIC.-RRMC-RR网GSHMC-RR-Cys碎片离7m/z碎片离子m/z碎片离子m/z+1038.12[M+H+1345.73[M+H]+1159.562+673.61[M+2H]2+580.56fM+H.-134]+904.59[M+3H]]+449.49[M—CO+H]+1131.342+608.91[M—C9H0+2H2+513.282+505.21Mdha-S!I+2II产452.38[M—GSH+2H]2+519.87[M—Gly+H20+2H]2+550.232+443.22[M—Cys+2H—CO产504.84+H]+十285.12[MeAsp-Arg+H]+284.72[MeAsp-Arg+H]+285.05135.40[M—C9H0—NH3+H]+im.03[M—CpHnOm+Hf1008.304、定量分析使用外标法，用色谱峰面积定量，配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys混合标样系列水溶液，MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度范围均为0.012.5iig/mL，在与待测物同样的色谱条件下直接进样，分别以MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由其回归方程对待测样品进行定量。实施例2:本发明方法的选择性、准确性、精密度和灵敏度考察1、方法选择性取经HPLC-MS检测的空白鱼肝脏冷冻干燥的样品50mg，将50iiLMC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度均为1PgmL—1的水溶液添加入该空白样品中，依实施例1的方法步骤进行操作，得到与相同浓度的MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys混合水溶液直接进样基本相同的二级总离子流色谱图。该实验结果表明，鱼肝脏样品中的内源性物质不干扰待测物的测定，见图1和图2;2、方法校准曲线取经HPLC-MS检测的空白鱼肝脏冷冻干燥的样品50mg，按实施例1中步骤1和步骤2方法操作，得到一系列提取净化的基质浓縮液样品。在以上样品中依次加入不同浓度的MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys，配制成相当于各待测物在鱼肝脏中的浓度为0.02，0.l，O.2，1.0，2.0，5.Oilg.g—1的系列混合水溶液，建立校准曲线。分别以MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标得到校准曲线。MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys在肝脏的校准曲线结果见表2:表2MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的校准曲线(X:浓度Pgg—、Y:峰面积)6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、加标回收率取经HPLC-MS检测的空白鱼肝脏冷冻干燥的样品50mg，分别加入低、中、高三个浓度(分别为0.2，1.0，5.0iigg-0的三种待测物，每个浓度进行3个样本分析。通过比较，以上处理组色谱峰面积与含待测物量相同的标准溶液直接进样所得峰面积之比计算各浓度点的平均方法回收率，结果见表3。表3MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys在鱼肝脏样品中的加标回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、方法的精密度分别配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys低、中、高三个浓度(分别为0.2，1.0，5.0iig'g—0的鱼肝脏质量控制样品(QC)，同时配制两组样品，一组样品每一浓度分析5次，另一组样品连续测定3天，每天1次。从而求得本测定方法的精密度，以变异系数表示。结果见表4:表4鱼肝脏中MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys测定的精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5、方法检测限和定量限在经HPLC-MS检测的空白鱼肝脏中加标，测定7个重复的低浓度空白加标，加标浓度一般为预期方法检测限(MDL)值的15倍，并按照方法的全过程进行处理和测定，再计算7次测定浓度的标准差SD，加标浓度为0.02iigg—、计算方法如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中置信度t(n—la=。.。d为99%，自由度为n-l时的t值查表可得，为2.896，n为重复分析的样品数，结果见表5:表5.加标肝脏样品中的MC-RR，MC-RR-GSH及MC-RR-Cys的检测限和定量限分析物MC-RR(ng.g-')MC-RR-GSH(ng.g")MC-RR-Cys(ngf1)ML)L475LOQ101813实施例3:健康鳙鱼急性染毒实验—批健康鳙鱼禁食48h后从腹腔注射入MC-RR水溶液，MC-RR的注射剂量为50iig/kg体重，分别收集注射后1、3、12、24和48h的鳙鱼肝脏样品。收集的样品于_20°C下密封保存，随后冷冻干燥备用。按照本发明方法建立的定性和定量分析方法分别测定不同时间急性染毒的鳙鱼肝脏中的MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys，结果见图3。权利要求一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，其步骤是①、称取冷冻干燥的生物组织样品，于碾钵中磨细后置于离心管中，按照0.1mL/mg的比例加入5v/v％的乙酸-EDTA水溶液，其中EDTA浓度为0.01mol/L，于0℃下超声破碎3～5min，然后在12000r/min下离心，移取上清液至干净容器中避光保存，再重复提取两次，合并得溶液I；②、将溶液I加入已预先活化的强阳离子交换固相萃取柱中进行富集，待富集完毕后，依次用2v/v％的甲酸，90v/v％的甲醇淋洗，最后用含15v/v％浓氨水的甲醇溶液洗脱，洗脱液收集于圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再用100v/v％的甲醇分三次溶解样品并转入离心管，于旋转蒸发仪上蒸干，得到的固体残渣用去离子水溶解并定容，用于分析测定；③、定性分析HPLC-MS联用，根据MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys标准品的保留时间和特征碎片离子峰的质荷比m/z进行定性；色谱条件流动相A为0.05v/v％的甲酸，B为0.05v/v％的甲酸乙腈溶液；流速0～20.0min为0.2mL/min，20.01～25.0min为0.3mL/min；色谱柱C18，100mm×2.1mmID，3.5μm；柱温40.0℃；样品盘温度10.0℃；进样体积为10μL；洗脱程序0min95v/v％A，5％v/v％B，1.0min65v/v％A，35v/v％B，17.0min55v/v％A，45v/v％B，17.5min30v/v％A，70v/v％B，18.0min5v/v％A，95v/v％B，20.0min5v/v％A，95v/v％B，20.01min95v/v％A，5v/v％B，25.0min95v/v％A，5v/v％B；质谱条件电喷雾离子化；正离子模式；喷针电压为4.5KV；透镜电压MC-RR为55.50V，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys为45.50V；自动增益控制打开；鞘气流速为20个单位；辅助气关闭；毛细管温度均为250℃；④、定量分析使用外标法，用色谱峰面积定量，配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys混合标样系列水溶液，MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度范围均为0.01～2.5μg/mL，在与待测物同样的色谱条件下直接进样，分别以MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由其回归方程对待测样品进行定量。全文摘要本发明公开了一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，该方法包括下列步骤1、将冷冻干燥的生物组织样品磨细，然后加入提取液超声破碎以提取待测物；2、将步骤1所得提取液经强阳离子交换固相萃取柱进行富集，洗脱，然后将洗脱液处理成待测物的水溶液，用于分析测定；3、HPLC-MS联用对待测物定性；4、外标法对待测物进行定量。本发明方法能同时定性和定量检测生物样品中的MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys，检测结果可靠，重现性好，灵敏度高，应用该方法首次检测到了急性染毒鳙鱼体内MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的存在。文档编号G01N30/02GK101788538SQ20101002895公开日2010年7月28日申请日期2010年1月11日优先权日2010年1月11日发明者何君,吴来燕,张伟,梁高道,谢平,邓旭伟,陈隽,马志梅申请人:中国科学院水生生物研究所