专利名称：：紫外分光光度计测定嘌呤的方法
技术领域：
：本发明涉及动物科学，具体说就是一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法。(二)
背景技术：
：奶牛日粮十二指肠代谢蛋白质(Metablizableprotein,MP)包括日粮的过瘤胃蛋白(Rumenundegradableprotein,RUP)、瘤胃微生物蛋白(Microbialcrudeprotein,MCP)和内源蛋白(Endogenouscrud印rotein，ECP)三个部分。瘤胃微生物蛋白占代谢蛋白质的6080%，因此定量瘤胃微生物蛋白合成量至关重要。Zi皿和Owen(1986)所提出的嘌呤氮法因其简便、快捷、试验成本低和易操作而被一些学者采用，同时也因嘌呤回收率比较低而受到了一些学者的置疑(Perezetal，1997;Makkeretal，1999;Gonzalazetal，2003,2004)。这个方法基于高氯酸对瘤胃微生物的水解释放出嘌呤，再用硝酸银沉淀嘌呤，最后用分光光度计260nm测定吸光度值。在该方法中用酵母RNA纯品做为研究的对象，分别与其它物质混合，最后测定嘌呤的回收率在90%以上。但是，用体内法(Invivo)测定瘤胃微生物蛋白十二指肠供给量取得的样品为瘤胃微生物冻干样品(Lyophilizedrumenmicrobes,LRM)。瘤胃微生物冻干样品中的微生物是以菌体的形式存在的，同时又包含了其它物质，成分较为复杂。(三)
发明内容本发明的目的在于提供一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法。本发明的目的是这样实现的所述的紫外分光光度计测定嘌呤的方法，步骤如下步骤一准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内，注意样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全；步骤二加入2.5ml高氯酸(HC104，1M)，紧盖瓶口，然后将其放在9095°C的恒温水浴内培养1小时，此时样本即炭化，形成黑色硬结，将硬结破碎，以利反应完全；步骤三再加入17.5ml乙酸缓冲液(NH4H2P04，0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于9095。C的恒温水浴内培养1015分钟，然后通过Whatman4号滤纸过滤，此时滤液的pH值为2左右；步骤四取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，分别加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲种pH缓冲液(NH4H2P04，0.2M)，然后置于暗处至少30分钟，最好是将其放置过夜(5°C)，可提高分析的准确度；步骤五于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液，注意不要搅动瓶底的沉淀物；步骤六用pH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次，用与步骤五同样的方法离心，弃去上清液；步骤七加入10ml0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止；步骤八用具塞密封离心管，放在9095°C的恒温水浴内培养30分钟；步骤九用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；步骤十酵母RNA标准曲线的制定:准确称取O.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色；步骤i^一数据统计分析采用SAS2003ANOVA进行多重比较。本发明具有方便易学，操作简便，重复性高，数值准确的特点，通过紫外分光光度计测定食糜中嘌呤含量，从而确定十二指肠食糜中微生物蛋白的含量，能够为准确确定奶牛代谢蛋白质含量提供准确的方法学基础。具体实施例方式下面对本发明作进一步说明。实施例1:本发明一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法，步骤如下步骤一准确称取O.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内，注意样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全；步骤二加入2.5ml高氯酸(HC104，1M)，紧盖瓶口，然后将其放在9095°C的恒温水浴内培养1小时，此时样本即炭化，形成黑色硬结，将硬结破碎，以利反应完全；步骤三再加入17.5ml乙酸缓冲液(NH4H2P04，0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于9095。C的恒温水浴内培养1015分钟，然后通过Whatman4号滤纸过滤，此时滤液的pH值为2左右；步骤四取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，分别加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲种pH缓冲液(NH4H2P04，0.2M)，然后置于暗处至少30分钟，最好是将其放置过夜(5°C)，可提高分析的准确度；步骤五于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液，注意不要搅动瓶底的沉淀物；步骤六用pH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次，用与步骤五同样的方法离心，弃去上清液；步骤七加入10ml0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止；步骤八用具塞密封离心管，放在9095°C的恒温水浴内培养30分钟；步骤九用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；步骤十酵母RNA标准曲线的制定:准确称取O.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色；步骤^^一数据统计分析采用SAS2003AN0VA进行多重比较。实施例2:本发明紫外分光光度计测定嘌呤的方法为嘌呤回收率紫外分光光度计法，嘌呤回收率紫外分光光度计法与液相色谱法对比研究如下l样品的制备41.1瘤胃微生物冻干样的制备晨饲后2小时取瘤胃内容物1L。两层棉布过滤保存在4t:充有C02的1L带塞的广口瓶中30分钟。用吸量管吸取中间部分不含有下层比较重的颗粒和上层比较轻的颗粒匀质液体。4°C，20000Xg离心20min。用蒸馏水洗菌球，再离心，最后冻干。1.2中性洗涤纤维的制备采用VanSoesteta1(1991)的方法制备中型洗涤纤维。用热的蒸馏水彻底清洗中性洗涤剂。在烘箱中烘干羊草。1.3未消化羊草和微生物冻干样的制备羊草500mg在体外(Invitro)自制发酵器条件下(Menkeetal.，1979)发酵24h。发酵之后将发酵液在20000Xg下离心30min，弃去上清后冻干。此冻干样品(Undigestedresidue)中含有未消化的羊草和瘤胃微生物。1)Menke液配制方法如下培养液的配制按照Menke等(1979)的方法进行。在试验牛晨饲前，分别从每头牛瘤胃中抽取150ml瘤胃液，混合，用4层纱布过滤，将过滤后的瘤胃液注入持续通入0)2的1L玻瓶中，玻璃瓶保持在39t:水浴中。然后加入600ml混合培养液。混合培养液由400ml水、0.lml培养液A(13.2gCaCl22H20，10.OgMnCl24H20，1.0CoCl26H20，8.0gFeCl361120，溶于100ml水中)。200ml培养液B(39gNaHC03和2gNH4HC03溶于1L水中)。200ml培养液C(5.7gNa2HP04，6.2gKH2P04，0.6gMg2S04*7H20溶于1L水中)，lml树脂天青(0.1%)和40ml还原液(95ml水，4mlNaOH和0.625gNa2S9H20)。混合培养液在使用前通入C02，置于39t:水浴中。每个注射器中吸入30ml瘤胃液与培养液混合液，将吸入的气泡排出，然后将注射器头部用自制堵头密封。然后将注射器置于39t:水浴中，开动摇床，开始发酵。2分析方法2.1采用Zinn(1986)年的方法1)准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内。注意样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全。2)加入2.5ml高氯酸(HC104，12M，70%)，紧盖瓶口，然后将其放在9095°C的恒温水浴内培养l小时。此时样本即炭化，形成黑色硬结。将硬结破碎，以利反应完全。3)再加入17.5ml乙酸缓冲液(NH4H2P04，0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于9095°C的恒温水浴内培养1015分钟，然后通过Whatman4号滤纸过滤，此时滤液的pH值为2左右。4)取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内。分别加入0.5mlAgN03(0.4M)和9ml甲种pH缓冲液(NH4H2P04，0.2M)。然后置于暗处至少30分钟。最好是将其放置过夜(5tO，可提高分析的准确度。5)于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液。注意不要搅动瓶底的沉淀物。6)用pH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次。用与第5步同样的方法离心，弃去上清液。7)加入10ml0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止。8)用具塞密封离心管，放在9095°C的恒温水浴内培养30分钟。9)用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示。酵母RNA(中国科学院上海生物化学研究所)标准曲线的制定准确称取0.05,0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色。2.2HPLC条件下测定腺嘌呤和鸟嘌呤回收率将腺嘌呤和鸟嘌呤(购自Sigma公司)配制为含有腺嘌呤和鸟嘌呤均为1000yM的溶液，取2.5ml加入47.5ml蒸馏水，取15y1进样分析。取瘤胃微生物冻干样品100mg，或者与200mg其它物质混合，样品共分为5组，每组设3各重复。置于25ml带有螺丝帽的试管中。处理分别为1)加入2.5ml12M藍04，90"水浴lh，冷却到室温;2)加入2.5ml1M藍04，90"水浴lh，冷却到室温;3)加入2.5ml2M藍04，90"水浴lh，冷却到室温;4)加入2.5ml12MHC104，12rC水浴2h，冷却到室温。用8MNaOH调整溶液pH值为6.5，加入HPLC溶液A到lOml。3000g离心10min，0.45滤膜过滤后取15iil进样分析。液相色谱条件溶液(A)10mMNH2HP04，用2.86MNH4OH调整pH值为6。溶液(B)乙氰150ml加入到600ml12.5mMNH2HP04溶液中，用2.86MNH40H调整pH值为6。所有的溶液都经0.45ym滤膜过滤，并在超声波震荡器中除气15min。液谱柱溶液梯度条件为30min内将溶液B从OX上升到100%，40min后溶液A在5min后上升到100%，流速为室温条件下0.8ml/min，进样量为15iU。3数据统计分析采用SAS2003AN0VA进行多重比较。4嘌呤回收率紫外分光光度计法与液相色谱法对比研究4.1不同处理温度和时间对瘤胃微生物冻干样品嘌呤回收率的影响表4-l表明，采用Zi皿(1986)的方法测定瘤胃微生物冻干样品与纤维素，中性洗涤纤维和淀粉混合后嘌呤回收率只有50%左右。瘤胃微生物冻干样品与未消化饲料残渣和微生物混合嘌呤的回收率也同样只有50%左右。造成这个结构的原因很有可能是由于所制备的样品在12MHC104，9(TC，lh条件下没有水解完全。因此，本试验同时采用了12rC水解2h的方法。结果表明，在紫外分光光度计260nm处，12rC高温处理后的吸光度值比9(TC，lh条件下水解后的吸光度值显著提高，260nm处吸光度值与瘤胃微生物冻干样品的量呈现了良好的线性关系(表4-l)。酵母RNA与中性洗涤纤维和淀粉分别混合后嘌呤的回收率比较高，分别达到了92.2%和98.3%。这各研究结果与Zi皿(1986)报道的结果很相近。6表4-l不同处理温度和时间对瘤胃微生物冻干样品嘌呤回收率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>25mg0.2090.00392.20.2100.00295.9yeastRNA+1001^淀粉25mg0.2170.00298.30.2110.001100.5yeastRNA+100mgNDF1LRMlyophilizedrumenmicrobes瘤胃微生物冻干样品.2AUR经人工瘤胃发酵器24小时发酵经离心后的剩余物.3y=-0.01633+0.00926XmgLRM(R2=0.99，n=3).4y=-0.01433+0.01526XmgLRM(R2=0.99，n=3)4.2不同高氯酸浓度对瘤胃微生物冻干样品嘌呤回收率的影响在相同水解温度9(TC条件下，分别用1M，2M和12MHC104进行水解。结果表明在12MHC104条件下，260nm处的吸光度值偏高(表3-2)。在相同水解温度9(TC条件下，分别用1M，2MHC104进行水解后的吸光度值非常接近。表4-2不同高氯酸浓度对瘤胃微生物冻干样品嘌呤回收率的影响260nm吸光度Absorbanceat260nm1M-HC1042M-HC104MeanSDMeanSD25mgLRM0.170O扁0.1670.00450mgLRM0.333O扁0.3330.00175mgLRM0.4720.0010.466O細25mgLRM+50mg纤0.176O扁0.171O細(103.9)(102.3)50mgLRM+50mg纤0.3260.0040.3310.002(97.8)(99.3)9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1LRMlyophilizedrumenmicrobes,瘤胃微生物冻干样品4.3液相色谱法测定瘤胃微生物冻干样品不同处理条件下的回收率表4-3表明，12MHC104,分别采用90°C，lh和121°C，2h水解和90。C条件下分别采用1M，2M水解lh。用液相色谱(HPLC)测定瘤胃微生物冻干样品与纤维素，中性洗涤纤维和淀粉混合后嘌呤回收率达到了100%左右。然而，12rc条件下，腺嘌呤的绝对回收量偏低。表明高温条件下，腺嘌呤受到了破坏。液相色谱结果表明，在比较低的HC104浓度(1M，2M)和9(TC条件下，核酸的水解是完全的，嘌呤回收率可以达到95^以上。权利要求一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法，其特征在于步骤如下步骤一准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内，注意样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全；步骤二加入2.5ml高氯酸(HClO4，1M)，紧盖瓶口，然后将其放在90～95℃的恒温水浴内培养1小时，此时样本即炭化，形成黑色硬结，将硬结破碎，以利反应完全；步骤三再加入17.5ml乙酸缓冲液(NH4H2PO4，0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于90～95℃的恒温水浴内培养10～15分钟，然后通过Whatman4号滤纸过滤，此时滤液的pH值为2左右；步骤四取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，分别加入0.5mlAgNO3(0.4M)和9ml甲种pH缓冲液(NH4H2PO4，0.2M)，然后置于暗处至少30分钟，最好是将其放置过夜(5℃)，可提高分析的准确度；步骤五于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液，注意不要搅动瓶底的沉淀物；步骤六用pH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次，用与步骤五同样的方法离心，弃去上清液；步骤七加入10ml0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止；步骤八用具塞密封离心管，放在90～95℃的恒温水浴内培养30分钟；步骤九用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；步骤十酵母RNA标准曲线的制定准确称取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色；步骤十一数据统计分析采用SAS2003ANOVA进行多重比较。全文摘要本发明提供一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法。步骤包括准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，置于25ml具塞带刻度的试管内；加入2.5ml高氯酸，放在90～95℃的恒温水浴内培养1小时；再加入17.5ml乙酸缓冲液，重新置于90～95℃的恒温水浴内培养10～15分钟，然后过滤；取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，于4000rpm离心15分钟；放在90～95℃的恒温水浴内培养30分钟；用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；本发明操作简便，重复性高，数值准确，通过紫外分光光度计测定食糜中嘌呤含量，确定十二指肠食糜中微生物蛋白的含量，为确定奶牛代谢蛋白质含量提供方法学基础。文档编号G01N21/33GK101776589SQ20101010251公开日2010年7月14日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者乔国华,单安山申请人:东北农业大学