专利名称：一种检测有害重金属元素在细胞内分布的方法
技术领域：
本发明涉及一种准确检测有害重金属元素细胞毒性的方法，具体属于大气污染 风险评价技术领域。
背景技术：
大气颗粒物已经成为我国城市大气的首要污染物，而有害金属元素是大气颗粒 物的重要组成部分。对大气颗粒物健康效应的研究已经成为环境毒理学、环境科学等的 研究热点。传统的研究方法，如电感耦合等离子发射光谱(ICP-MS)和透射电子显微镜 (TEM)等都需要将细胞破碎后进行检测，这将破坏细胞膜，使细胞内的物质释放出来， 破坏了有害金属元素在细胞内的分布，对研究有害金属元素在细胞内的分布有显著影 响。所以需要探寻新的方法和手段对有害金属元素在细胞内的分布进行检测。我们经多年探索发现同步辐射技术(synchrotron radiation，SR)可以成为了研究 有害重金属元素在细胞内分布的理想工具。同步辐射是以接近光速运动的带电粒子放出 的具有独特性质的电磁辐射，基于同步辐射产生的X荧光分析方法具有高灵敏度、低检 出限、可同时检测多种元素(理论上可以检测出Na — U之间的所有元素)，并可以实现 直接、无损检测样品等优点，可以用来分析大气可吸入颗粒物中金属元素组成及含量。 而微束X射线荧光分析(μ -XRF)具备原为分析样品的元素组分、化学特性及二维分布的 能力，元素分析的灵敏度达到ppb级，所以利用μ-XRF研究元素在细胞内的分布已经成 为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细胞内重金属元素分布的方法。本发明检测细胞内重金属元素分布的方法，其特征在于具有以下的过程与步 骤a.将经过用75%体积比酒精消毒和紫外线照射过的Si3N4晶片放入到6孔培养板 中；b.用含10%体积比的胎牛血清培养基配成单个细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴加 到Si3N4晶片膜上，再加入4 5ml培养基，放入到37°C、体积比为5% CO2的培养箱 中，24h后观察；c.将配成的颗粒物溶液与含牛胎血清的培养基混合，配成染毒溶液，将染毒溶 液滴加到Si3N4晶片上，放入到培养箱中中，4h后观察，加入体积比为95%的无水乙醇进 行固定，15min后观察，包装好样品；d.将Si3N4晶片固定到样品台上，设定扫描时间、步长值后，利用微束X射线扫 描Si3N4晶片；e.扫描结束后利用Plot软件将mad格式数据成像，得出结果。通过上述技术方案，本发明的优点是
(1)细胞制片快速简单，原材料容易购买；(2)细胞检测方法对细胞膜无损害，不会破坏有害金属元素在细胞内的分布；(3)具备原为分析样品元素组分、化学特性及二维分布的能力，元素分析的灵敏 度达到ppb级；(4)结果显示为图像，使有害金属元素在细胞内的分布直观形象；(5) 一次可以检测Na U之间的所有元素。
图1为利用微束X射线荧光分析(μ-XRF) Ni在细胞内的分布位置；图2为利 用微束X射线荧光分析(P-XRF)Zn在细胞内的分布位置；图3为利用微束X射线荧光 分析(P-XRF)Cu在细胞内的分布位置；图4为利用微束X射线荧光分析(y-XRF)Fe 在细胞内的分布位置。图1、图2、图3、图4均为实例1所描述的利用微束X射线扫描 Si3N4晶片后，用Plot软件将mad格式数据成像后的图片，图5为实验原理图(大气颗粒 物内重金属元素在细胞内分布检测方法示意图)。图5中的标号数字表示如下1.细胞培养皿，2.制片，3.Si3N4片，4.固定，5.样品台，6.微束X射线，7.细
胞膜8.成像，9.金属元素，10.细胞核。
具体实施例方式现将本发明的实例具体叙述于后。实施例1在本实例中，将Si3N4晶片放入到6孔培养板中，用含体积比为10%的胎牛血清 培养基配成单个细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴加到Si3N4晶片膜上，再加入4ml培养基， 放入到37C、体积比为5% CO2的培养箱中；24h后，将配成的颗粒物溶液与含牛胎血清 的培养基混合，配成浓度为50 μ g/ml的颗粒物染毒溶液，将染毒溶液滴加到Si3N4晶片 上，放入到培养箱中；4h后，加入体积比为95%的无水乙醇进行固定；将样品固定在样 品架上，设置扫描时间2s，扫描步长为3 μ m，扫描总长为20um，利用微束X射线扫描 Si3N4晶片。结果显示，所有这些重金属元素都可以进入细胞，并积聚细胞核的周围，但不 同重金属元素在细胞内的分布有差异，Ni比其他元素更容易被细胞摄入，而对细胞的生 长发育存在不利影响。实施例2在本实例中，细胞制片与实施例1 一致，染毒过程略有不同，不同之处在于配 成25 μ g/ml的染毒溶液。将样品固定在样品架上，设置扫描时间2s，扫描步长2 μ m， 扫描总长为15 μ m，利用微束X射线扫描Si3N4晶片。结果显示，所有这些重金属元素都可以进入细胞，并积聚细胞核的周围。但不 同金属元素的分布存在差异。
权利要求
1. 一种检测有害重金属元素在细胞内分布的方法，其特征在于它的操作顺序和步 骤，如下a将经过用体积比为75%酒精消毒和紫外线照射过的Si3N4晶片放入到6孔培养板中；b用含体积比为10%的胎牛血清培养基配成单个细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴加到 Si3N4晶片膜上，再加入4 5ml培养基，放入到37°C、体积比为5% CO2的培养箱中， 24h后观察；c将配成的颗粒物溶液与含牛胎血清的培养基混合，配成染毒溶液，将染毒溶液滴加 到Si3N4晶片上，放入到培养箱中中，4h后观察，加入体积比为95%的无水乙醇进行固 定，15min后观察，包装好样品；d将Si3N4晶片固定到样品台上，设定扫描时间、步长值后，利用微束X射线扫描 Si3N4晶片。
全文摘要
本发明涉及一种检测有害重金属元素在细胞内分布的方法，属于大气污染风险评价技术领域。本发明重要步骤如下(1)细胞制片，将细胞种到Si3N4晶片上，放入培养箱中，24小时后加入染毒溶液，再放入培养箱中，4小时后加入体积比为95％的无水乙醇进行固定；(2)用样品架将样品固定到样品台上，利用同步辐射产生的微束X射线(μ-XRF)荧光分析样品，设置扫描时间为2～4s，扫描步长为2～4μm。扫描总长为15～20μm；(3)扫描结束后利用Plot软件将mad格式的数据成像。得出的图像显示所有这些重金属元素都可以进入细胞，并积聚在细胞核周围，但不同重金属元素在细胞内的分布有差异。
文档编号G01N23/223GK102012380SQ20101029075
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者冯满, 吕森林, 安静, 尚羽, 张睿, 李爱国 申请人:上海大学