专利名称：一种鸭疫里默氏杆菌lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的禽类接触性传染病，其血清型复杂，迄今为止，已公认的RA有21个血清型(1 21 型)，各血清型之间缺乏交叉保护的能力。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失，是目前危害禽类养殖业的主要传染病之一。鸭疫里默氏杆菌病多继发其他疾病或与其他传染性疾病并发，其临床症状和病理解剖往往缺乏特征性，增加了疾病的诊断和防治难度，必须通过实验室诊断进行确诊。目前实验室的诊断方法主要包括细菌学方法(如细菌的分离鉴定)、血清学方法(如酶联免疫吸附试验)和分子生物学(如聚合酶联式反应)等方法，但上述方法所需检测时间长、特异性和灵敏性低且必须配备专用设备，操作复杂，常有非特异性出现。近年来，由NotomiT等开发的一种简单、迅速、特异的核酸扩增方法环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，被广泛的应用于多种病毒性疾病和细菌性疾病的诊断中(Notomi，Τ.，Okayama, H.，Masubuchi, H.，et al. Nucleic Acids Res. 2000 (28), e63 ；K.Nagamine, Τ. Hase, Τ. Notomi. Molecular andCellular Probes. 2002(16) :223-229)。该技术使用4条不同引物识别6个不同区域的靶基因，应用链置换扩增反应在恒温条件下完成扩增；具有很高的扩增效率，在15到60min内可将DNA 扩大IO9-IOki倍；不需要特殊试剂和精密设备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒和检测方法。为此，本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其包含3对引物F3 和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ IDN0. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6 所示。在一些实施例中，所述鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒还含有荧光染料、10X反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP(2. 5mM each)、甜菜碱(Betaine solution, 5M) 所述荧光染料为能与双链DNA结合产生荧光的染料，可为溴化乙锭、SYBRGreen I荧光染料或Hoechst 33258，最优选为STOR Green I荧光染料。另一方面，本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，包括下列步骤
a)取禽类的体液或组织液并以此为模板；b)利用3对引物F3和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6所示，反应条件为94°C 5分钟， O0C 20 秒，65°C 20-60 分钟，80°C灭活； c)检测LAMP反应产物。在一些实施例中，所述禽类为鸭、火鸡、鸡或鸟类中任何之一。在一实施例中，步骤b中所述反应条件为94°C 5分钟，0°C 20秒，65°C 20分钟，80°C 灭活；在一些实施例中，步骤c中所述检测LAMP反应产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法、 荧光显色法或分光光度计法。所述荧光显色法为STOR Green I荧光显色法。与现有技术相比，本发明具有如下的优点1) 6条引物对序列的8个特异区域进行识别，扩增反应只有在6条引物完全识别靶序列的情况下才能进行，在很大程度上减少了扩增反应的背景，保证了 LAMP扩增的高度特异性。2)对硬件设备基本无要求，在普通的生物学实验室就可完成检测工作，减少了污染的机会并方便了实验过程中的质控工作。3)检测时间可以缩短到20分钟，最低可以检测出5个细菌，提高了灵敏度。4)可视化鉴定，向反应产物中加入荧光染料，如果有扩增，荧光染料就会和DNA结合，通过肉眼即可观察反应液呈现明亮的橙黄色，如反应液没有橙黄色，则说明呈阴性反应。本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭疫里默氏杆菌检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求，易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
图1本发明设计的LAMP弓丨物对不同细菌的LAMP扩增结果；图2反应产物荧光染料显色示意图；图3LAMP反应产物进行kpnl酶切结果；图4LAMP对不同血清型鸭疫里默氏杆菌检测的结果；图5不同作用时间对LAMP检测鸭疫里默氏杆菌的影响；图6LAMP敏感性实验结果；图7PCR敏感性实验结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。实施例1 鸭疫里默氏杆菌LAMP检测按下列组成配制鸭疫里默氏杆菌LAMP检测反应液(1)反应液A 含有 IOX 反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP(2. 5mM each) ,Betaine solution (5M)、3对引物其序列为F3 :3，CTAAAGATGGGGTTTCTGTG 5，(SEQ ID NO. 1)B3 :3，ATCCATAGGATTAGCTCCAG 5，(SEQ ID NO. 2)FIP :3’ TCGTTGGTTTTAGATGCTACTTCTTTTTTGCTAAAGAGATAGAGCTAGAGG 5’ (SEQ ID NO. 3)BIP :3’ TGGCAGGAGATGGTACCACTTTTTCAGCCACATTTTTAAGACCTT5，(SEQ ID N0. 4)LF :3，ACCATTTGAGCTCCCATATT 5，(SEQ ID N0. 5)LB :3，GCTACCGTATTAGCGCAAGC 5，(SEQ ID N0. 6)(2)反应液 B :10000 X SYBR green I反应液A每管M μ L体系组成为反应组分体积(μ L)IOXThermoPol 反应缓冲液10Bst DNA (8，000U/mL)1dNTP (2. 5mM each)4Betaine solution(5M)5. 5FIP(IOyM)3BIP (10 μ Μ)3F3(10yM)1Β3(10μΜ)1LF(IOyM)1.5LB(IOyM)1.5总体积24(3)鸭疫里默氏杆菌模板制备接种TSA上的鸭疫里默氏杆菌WJ-4株单菌落至TSB液体培养基，37°C摇菌。然后再1 100转接一次，摇菌至0D600 = 0. 6左右，各取ImL菌液12，000r/min离心lmin，去上清，灭菌PBS洗3次，ImL灭菌超纯水重悬，制成模板备用。(4)鸭疫里默氏杆菌WJ-4株LAMP检测结果在反应液A中，加入制备的1 μ L鸭疫里默氏杆菌模板，94°C水浴5分钟，冰浴20 秒，加入IyL Bst DNA,混勻，65°C水浴20分钟，80°C水浴灭活10分钟，将反应产物分为2 份，一份加入IyL荧光染料STOR green I，观察检测结果，另外一份进行电泳检测。结果均呈现特异性的反应，见图1，泳道1-12分别为鸭疫里默氏杆菌、禽大肠杆菌、禽沙门氏菌、 禽巴氏杆菌、禽结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、禽李氏杆菌、禽败血支原体、柔嫩艾美尔球虫，泳道13为阴性对照；图2中A显橙黄色为阳性，B为阴性。(5)鸭疫里默氏杆菌
对中LAMP反应产物进行kpnl酶切，酶切产物电泳检测出现预期大小的2条特异性条带，测序结果表明上述2片段与GroEL序列100%同源，结果进一步表明本发明建立的方法可对GroEL基因进行特异性扩增，见图3。(6)鸭疫里默氏杆菌不同血清型的LAMP检测为验证本发明对不同血清型鸭疫里默氏杆菌检测的效果，运用本发明对鸭疫里默氏杆菌血清1、2、6、8、10、12、15以及未定型等11株细菌分别为模板，进行LAMP检测，试验步骤同上，琼脂糖凝胶电泳结果表明本发明对上述血清型都可进行特异性检测。见图4 泳道1-2 血清1型；泳道3-4 血清2型；泳道5 血清6型；泳道6 血清8型；泳道7_8 血清10型；泳道9 血清12型；泳道10 血清15型；泳道11 未定型；泳道12 阴性对照。(7) LAMP反应时间的确立 为验证本发明的最短检测时间，对65 °C水浴步骤分别作了不同时间点的反应(分别为0、15、20、25、30、35、40、45、60分钟)，其它试验步骤同(4)所述，琼脂糖凝胶电泳结果表明65°C水浴步骤作用20分钟，即可进行结果判定，见图5，图中泳道1-10分别为0、15、 20、25、30、35、40、45、60分钟和阴性对照。实施例2 =LAMP检测鸭疫里默氏杆菌的灵敏度(1)鸭疫里默氏杆菌模板制备接种鸭疫里默氏杆菌WJ4株至TSB液体培养基中，37 °C摇菌至OD6tltl = 0. 6左右， 取ImL菌液12，000r/min离心Imin,弃上清，灭菌PBS洗3次，ImLPBS重悬，制备的菌液浓度为 5 X IO5CFU/μ L，再用 PBS 分别稀释成5 X IO4CFU/μ L、5 X IO3CFU/μ L、5 X IO2CFU/μ L、 lOOCFU/μ L、50CFU/y L、25CFU/y LUOCFU/μ L、5CFU/y L。(2) LAMP和PCR对鸭疫里默氏杆菌灵敏度的检测比较在反应液A中，加入上述实施例1制备的不同浓度的鸭疫里默氏杆菌1 μ L作为模板，94°C水浴5分钟，冰浴20秒，加入1 μ L Bst DNA,混勻，65°C水浴20分钟，80°C水浴灭活 10分钟，进行电泳检测。结果表明本发明建立的LAMP检测方法最低可以检测出5个CFU的鸭疫里默氏杆菌见图6，图中泳道1-9检测的鸭疫里默氏杆菌个数分别为5X10S、5X104、 5X103、5X102、100、50、25、10、5 ；泳道 10 阴性对照。依据GroEL序列，设计1对特异性的引物GroEL-F 5' TCAAGAGACGCACTTAAAAGAGGTG 3’GroEL-R :5，TGTACCTTTAGCCTCTTCCACAGTA 3，，加入上述实施例制备的不同浓度的鸭疫里默氏杆菌1 μ L作为模板，按照下列反应体系进行PCR
权利要求
1.一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于其包含3对引物F3和B3 ；FIP 和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ IDN0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4 所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于其还含有荧光染料、10 X反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱。
3.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为能与双链DNA结合产生荧光的染料。
4.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为溴化乙锭、SYBR Green I荧光染料或Hoechst 33258中之一。
5.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为STOR Green I荧光染料。
6.一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，包括下列步骤a)取禽类的体液或组织液并以此为模板；b)利用3对引物F3和B3；FIP和BIP ；LF和LB进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ IDN0. 2所示，所述FIP的核酸序列如 SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID N0. 5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID N0. 6所示，反应条件为94°C 5分钟，0°C 20秒， 650C 20-60 分钟，80°C灭活;c)检测LAMP反应产物。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述禽类为鸭、火鸡、鸡或鸟类中任何之一。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤b中所述反应条件为94°C5分钟， O0C 20 秒，65°C 20 分钟，80°C灭活。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤c中所述检测LAMP反应产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法、荧光显色法或分光光度计法。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于所述荧光显色法为STORGreenI荧光显色法。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其特征在于其包含3对引物，它们的核酸序列如SEQ ID NO.1-6所示。本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭疫里默氏杆菌检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求，易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
文档编号G01N21/64GK102409084SQ20101029068
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者丁铲, 于圣青, 仇旭升, 宋翠萍, 胡青海, 陈鸿军, 韩先干 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所