专利名称：新型柱凝集玻璃微珠卡式血型检测试剂的制作方法
技术领域：
项目背景目前国内输血界仍多采用试管法，玻片法等传统手工方法进行血型配型鉴定。从科学的角度上分析存在着明显的方法学上的缺陷，不能保证检测结果的正确，严重危害了受血者的生命安全。一个世纪以来就不断探索和改进输血相关试验的方法，例如发明了低离子介质法、酶法、聚凝胺法、抗人球蛋白法等，但这些方面都存在着明显缺点，现有的技术都有一定的局限性。最经典、最佳抗人球蛋白方法的发现是免疫学上的一个里程碑，但是传统的抗人球方法，要经过洗涤红细胞等步骤，操作繁杂、时间长，结果不易判断和统一，不能满足输血检测及时准确的要求。由于柱凝集鉴定系统具备以上准确性和稳定性高等科学检测优势明显优于传统技术。柱凝集卡式配型是一种用于抗体筛查、交叉配血的方法，在国外输血领域已作为常规应用。最近两年，国内各大医院逐渐开展柱凝集技术(Column agglutination technology, CAT)，该技术用于血型鉴定时，具有标本用量少、操作标准化、重复性好、灵敏度高及结果易保存等优点，克服了血型鉴定的诸多难题，成为血型鉴定的首选方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种AB0/D血型检测卡式血型诊断试剂，是基于柱凝集和抗原_抗体反应的原理而设计的。本发明的试剂盒包括a,反应检测卡，每张卡有6个微柱孔，b，单克隆抗体，抗一 Al，C，单克隆抗体，抗一 B，d，单克隆抗体，抗一 D，f，阴性对照血清g，阳性对照血清
具体实施例方式a,反应检测卡，每张卡有6个微柱孔。反应卡采用waterman公司的H型生化反应PP材质的反应板，应用生化打孔技术每张5X IOcm的卡上制成2X3的6个微孔，孔径 0. 7cm。用PH 9. 0浓度为IOmM磷酸盐缓冲液将玻璃磁珠稀释制成稀释液，将稀释液200ul 每孔加入到6个微孔中，放置4°C冰箱包被过夜。此日取出平衡至室温后，用PH 7. 2浓度 5mM HEPS磷酸盐缓冲液进行平衡洗涤2次，拍干通风橱内放置2小时后。4度。C保存备用。b，单克隆抗体，抗一 Al，取tat-Al 蛋白 28 μ 1，加 0. 02mol/l 的 PBS(ph7. 4) 1. 472ml 使成 1. 5ml 浓度溶液， 加等量福氏完全佐剂用三通器混勻制成油包水的乳化液。在5只balb/c小鼠的颈背部及双侧腹股沟皮下多点注射，剂量为0. 6ml/只，间隔3周后以同样方法(加不完全福氏佐剂乳化)免疫，再间隔2周后取等量蛋白溶于生理盐水中经腹腔进行第3次免疫，最后1次免疫2周后测小鼠血清效价，选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫，3d后取脾细胞进行融合。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，融合剂为相对分子质量1500的 peg。细胞融合及选择性培养均按常规方法进行。以10mg/l的tat蛋白包被聚苯乙烯微板， 用间接elisa法检测杂交瘤细胞培养上清，以正常balb/c小鼠血清作为阴性对照，以免疫 balb/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化，直到克隆生长孔mab阳性率达100%，建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后进行细胞蛋白的提取和纯化，纯化后的蛋白采 用Elisa方法进行效价的检测，并稀释到浓度 0. lmg/ml0c，单克隆抗体，抗一 B，如b相同的方式免疫小鼠，最后1次免疫2周后测小鼠血清效价，选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫，三天后取脾细胞进行融合。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，融合剂为相对分子质量1500的 peg。细胞融合及选择性培养均按常规方法进行。以10mg/l的tat蛋白包被聚苯乙烯微板， 用间接elisa法检测杂交瘤细胞培养上清，以正常balb/c小鼠血清作为阴性对照，以免疫 balb/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化，直到克隆生长孔mab阳性率达100%，建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后进行细胞蛋白的提取和纯化，纯化后的蛋白采用Elisa方法进行效价的检测，并稀释到浓度 0. lmg/ml0d，单克隆抗体，抗一 D，如b相同的方式免疫小鼠，最后1次免疫2周后测小鼠血清效价，选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫，三天后取脾细胞进行融合。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，融合剂为相对分子质量1500的 peg。细胞融合及选择性培养均按常规方法进行。以10mg/l的tat蛋白包被聚苯乙烯微板， 用间接elisa法检测杂交瘤细胞培养上清，以正常balb/c小鼠血清作为阴性对照，以免疫 balb/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化，直到克隆生长孔mab阳性率达100%，建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后进行细胞蛋白的提取和纯化，纯化后的蛋白采用Elisa方法进行效价的检测，并稀释到浓度 0. lmg/ml0f，阴性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂发生不发生反应的成年人血清。且此血清不属于A\B\D血型，采用Rh阴性血清。g，阳性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂发生不发生反应的成年人血清。且此血清分别为A\B\D血型。检测具体操作(1)将稀释液及反定细胞在室温平衡半小时，并做血型板标记。
(2)做正定型(前四孔)，用稀释液(或生理盐水)将样本配制成5%红细胞悬液， 用专用加样枪取上述悬液分别依次加人Cd，A，B, D孔中，离心看结果并记录。
(3)做反定型，分别在第5，6孔中加人0. 8%标准反定细胞(Al，B)50ul再加人样本血清，离心看结果并记录。发明原理正常具有抗原的人红细胞将与相应的抗体发生凝集反应，本卡式检测系统应用的柱凝集技术是将玻璃珠装入微柱中，玻璃珠之间的间隙起到了分子筛的作用，用于阻挡已经凝集的红细胞，使凝集红细胞被阻挡在玻璃珠柱的上面，而未凝集的游离红细胞则会在离心力的作用下通过玻璃珠之间的间隙到达微柱的底部，从而起到彻底分离凝集与非凝集红细胞、区分阴性与阳性实验结果的目的。进行血型鉴定时，样品加至每个柱子顶端的反应仓中，以专用离心机离心10分钟。发生凝集的红细胞会被阻挡在玻璃珠的上面，视为“阳性反应”；而未凝集的游离红细胞则会在离心力的作用下通过玻璃珠之间的间隙到达微柱的底部。根据以上结果，可以从正定型鉴定出血型。本发明用于临床输血、移植等快速高效准确进行血型鉴定。发明的优势技术的先进性，结果稳定；实验方法简便，易于标准化；更好的灵敏度和特异性；可以在全自动仪器上配套使用，提高实验室效率。实施例1 尿毒症病人交叉配血血型检测1)从冰箱中取制备好的柱凝集试剂卡平衡至室温，撕去封条。2)从冰箱中取制备好的单克隆抗体，抗一 A，B, D和阴性血清及阳性血清，平衡至室温。3)在卡反应室中加入3% -5%的红细胞悬液50ul和对应的血清50ul，标明主测
管和次测管。4)在反应卡内1，2，3孔分别加入阴阳性血清和抗一 A，B, D混合液0. 5ml,4-6孔中分别加入病人的新鲜抗凝血标本，并在每孔中分别加抗一 A，B，D。5)置孵育箱37°C 15min孵育。6)取出置专用离心机离心2000rpm，lOmin，观察结果并记录。发生凝集的红细胞会被阻挡在玻璃珠的上面，视为“阳性反应”；而未凝集的游离红细胞则会在离心力的作用下通过玻璃珠之间的间隙到达微柱的底部。此检测的结果为第 4孔为阳性反应，此患者的血型为A型。实施例2 尿毒症病人交叉配血抗体分型1)将该患者新鲜抗凝血标本配成3 % -5 %的红细胞悬液待用。2)取制备好的血型检测卡平衡至室温，撕去封条，取200ul 3% 的红细胞悬液注入血型检测卡的空白微柱。3)从冰箱中取出抗IgG和C3免疫试剂(爱尔兰生物工程公司提供)，平衡至室温。
4)分别加入相应的抗IgG和抗C3各50ul，直接置于离心机离心IOmin观察结果。发生凝集的红细胞会被阻挡在玻璃珠的上面，视为“阳性反应”，此检测的结果为第4孔为阳性反应，IgG阳性，无单独C3阳性。实施例3 检测新生儿溶血病的临床应用1)血型鉴定按操作规程分别测定母婴ABO和Rh血型。2)直抗试验取抗IgG卡一张(用一孔)加患儿3% 5%红细胞悬液10，专用离心机离心5min。3)游离和放散试验取抗IgG卡一张(1-6孔)，前三孔分别编AC、BE、0C，后三孔分别编AC、BE、0C。游离试验用前3孔各加患儿血清或母亲血清40ul ；放散试验用后3孔各加患儿热放散液40ul (附患儿热放散液提取法用生理盐水充分洗涤患儿红细胞3次，压积， 取压积红细胞加1/2量或等量生理盐水，56 ClOmln，其间不断摇动，离心，上清即为热放散液)。按标记分别加入IOul 3% 5%々(、8(、0(悬液，置专用孵育箱121^^1，专用离心机离心5min，观察并记录结果。发生凝集的红细胞会被阻挡在玻璃珠的上面，视为“阳性反应”，此检测的结果为第患儿的血型为B型，母亲的血型为B型。
权利要求
1.一种新型柱凝集玻璃微珠卡式血型检测试剂，其特征是a、U型6孔反应板其内孔内表面已经包被抗人球A、B、D单克隆抗体蛋白试剂；b、指示细胞表面已致敏IgG细胞。。 C、低离子介质能增强抗原抗体反应。d、阴性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂发生不发生反应的成年人血清。且此血清不属于A\B\D血型，采用Rh阴性血清。e、阳性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂发生不发生反应的成年人血清。且此血清分别为A\B\D血型。
2.根据权利要求1所述的新型柱凝集玻璃微珠卡式血型检测试剂用于检测血型抗原抗体以及进行血液输注前交叉配血。
全文摘要
本发明公开了一种新型的血型检测试剂通过柱凝集和固相卡式的方法检测人类的血型和配血的方法，属于生物技术领域。本发明的方法首次将柱凝集和固相卡式的方法相结合用于检测血型和配血，并且所述方法检测灵敏度高，只需要普通的数码相机或肉眼就可以分辨出血型卡上的血型和配血数据，从而大大降低血型检测的成本，减少了检测的时间，提高了检查灵敏度并且具有可溯源性。
文档编号G01N33/80GK102445549SQ20101050038
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月8日 优先权日2010年10月8日
发明者曹相斌, 陈曦 申请人:上海博冠生物技术有限公司