一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法

专利名称：一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法。这种试剂盒的检 测方法，主要是将检测样品用预处理液和液化剂作均相化处理，再使用稀释液稀释后作离 心沉淀制片，得到多张病原菌液基薄层涂片，然后进行鉴别染色，根据病原菌的染色反应、 形态和排列方式就可对样品中多种病原菌作出快速检测。
背景技术：
呼吸系统感染是一种较为常见的疾病。在肺部感染的各种病原中，以细菌占首位 (成人约占80%，儿童约占60% )，其次为病毒、支原体等(丛玉隆主编，医家金鉴，检验医 学卷(下)，军事医学科学出版社，PP 974-981)。在上呼吸道感染中较重要的肺炎链球菌 在人体抵抗力降低时引起疾病，尤其对老人和儿童，最严重可致肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳 炎、鼻窦炎等。在医院内感染所致的细菌性肺炎中，肺炎球菌约占30%，金黄色葡萄球菌约 占10%，而需氧革兰染色阴性杆菌(绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、 肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌等)则增至约50%。其余为耐青霉素G的金黄色葡萄球菌、真 菌和病毒，一些以往较少报道的如军团菌等相继出现，革兰染色阴性杆菌肺炎的病死率仍 高(30-40% )，老年及危重患者尤为难治。近年来肺真菌病发病率也逐渐上升，如白色念珠 菌、曲霉菌、放线菌等。在痰液样品中检查病原菌的传统方法是直接涂片法，因该方法简便易行，是目前 各实验室一个重要的检查手段。该方法是将经部分挑选的痰液样品手工涂在玻片上，然后 通过痰液样品的鉴别染色观察结果。鉴别染色对于大多数病原体的初步分类有极大的帮 助，革兰染色和抗酸染色是鉴别染色的范例，但革兰染色只能用于少数例如肺炎链球菌和 白色念珠菌的鉴定，抗酸染色也仅用于特殊的细菌群如分枝杆菌属等的鉴定。该方法的缺 点是涂片不均勻，背景较脏，检测灵敏度低，这主要是被痰液以及被细胞包裹的病原菌不易 释放，能检测出的病原菌数量较少的原因。因此目前临床诊断治疗时主要还是依靠培养鉴 定方法，但是培养鉴定所需时间较长，不能满足临床的快速需要。在实验室中常用人体脱落细胞液基薄层涂片技术用于肿瘤细胞的形态观察，例如 宫颈癌和肺癌病理细胞的诊断。其通常的操作步骤是先将检测样品例如采样后的宫颈刷或 痰液放入含有酒精成分的细胞保存液中，完成样品中脱落细胞形态的固定和均相化，以防 止脱落细胞的自我降解。再将上述已经均相化的检测样品和粘附剂混合后加入到离心沉淀 制片组合中(离心沉淀制片组合是由中空离心管的底部和在其下面的载玻片无缝连接，并 共同固定在甩片架底座上组成)，并放入吊篮式离心机的吊蓝中，以小于1，000转/分转速 离心进行离心沉淀制片。在离心沉淀制片过程中完成对人体脱落细胞的浓缩并使之黏附在 载玻片上，得到分布均勻的细胞薄层涂片。离心结束后弃上层液并将离心沉淀制片组合倒 扣浙干，卸下载玻片烘干。然后进行鉴别染色，通常一个样品得到一张涂片，做一种染色即 可。例如需要观察宫颈癌细胞常用巴氏染色，肺癌细胞常用HE染色。为了解决目前临床上 存在的不能为含有病原菌的样品快速灵敏地提供病原菌感染检测结果的问题，本发明在上述人体脱落细胞液基薄层涂片技术的基础上进行改进，提供一种病原菌液基薄层涂片检测 试剂盒及其检测方法，可对样品中多种病原菌作出快速检测。

发明内容
本发明涉及一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法。本发明病原菌液 基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液，液化剂，稀释液，鉴别染色液和耗材组成。这种病原 菌液基薄层涂片检测试剂盒的检测方法，是在检测样品中加入强碱性液基细胞学病原菌样 品预处理液和液化剂，通过搅拌实现样品的均相化。再使用稀释剂对已液化的样品进行稀 释后，作离心沉淀制片，得到多张分布均勻的病原菌液基薄层涂片。然后进行鉴别染色，根 据病原菌的染色反应、形态学和排列方式就可对检测样品中多种病原菌作出快速灵敏的检 测。本发明病原菌液基薄层涂片检测试剂盒的检测方法包含下列步骤(1)取样取含病原菌的样品。样品可以是痰液、支气管灌洗物、胸腹水、脓液和创伤感染组 织、脑脊液、关节液、尿液或粪便。如果是痰液，则可取其全部作为样品。如果是体积较大的 液态样品，则可取其部分作为检测样品。粪便则在去污萃取后，和尿液一样再通过高速离心 取得病原菌样品。样品中含有的病原菌主要是二类(a)细菌例如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、 结核杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、军团菌、B型流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆 菌、肺炎克雷伯菌、肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌等；(b)真菌例如白色念珠菌、曲霉菌、放线 菌等。(2)样品的均相化处理在样品中以样品和预处理液1 3-20的体积比加入预处理液，以样品和液化剂 1 0-5的体积比加入液化剂，和磁力搅拌子一起放在磁力搅拌仪上加热45-65°C搅拌5-30 分钟，转速为1，000-2，000转/分，进行样品的均相化处理，加热搅拌能加速液化。预处理 液是取之于由5-50ml氨水(密度0. 88g/ml) U-IOg氯化钠及余量为水配制的IOOml混合 液。液化剂可以是蛋白酶，例如0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶，也可以是 巯基还原剂，例如浓度为3. 0-30. Omg/ml巯基乙醇、浓度为4. 0-40. Omg/ml β -巯基乙醇、 浓度为3. 5-35. Omg/ml 1,4- 二巯基丁二醇、浓度为4. 5-45. Omg/ml 二硫赤藓糖醇、浓度为 5. 0-50. Omg/ml 二硫苏糖醇等。样品的均相化处理使样品发生物理变性和化学变性。物理变性主要是对粘稠液例 如痰液、脑脊液等样品进行加热搅拌剪切实现勻浆化。液化剂作为化学变性剂，能打开样品 中蛋白间的化学键，特别是肽键、氢键和二硫键，增加样品的水溶性，让被蛋白包裹的病原 菌从中释放。强碱性的预处理液能裂解样品中的脱落细胞特别是肺泡巨噬细胞膜和中性粒 细胞等白细胞，让被细胞包裹的病原菌从中释放，例如结核杆菌和军团菌。可依样品的粘稠 程度加入液化剂，如果粘稠程度高体积大，可多加些液化剂，如果是胸腹水或尿液，液化剂 的使用量可适当减少或不加。所述的预处理液和液化剂分开包装，并在使用时混合，是为了 防止液化剂失活。(3)液基离心沉淀薄层制片
取上述已均相化的样品和稀释液按1 0-6的体积比混合，加入离心沉淀制片组 合中的离心管中。稀释液为0.5-5重量％的氯化钠溶液，能使背景干净和有利于样品中病 原菌的形态固定和检测，但对于已经很稀薄的样品，例如支气管灌洗物，就不需用稀释液稀 释。离心沉淀制片组合是由中空离心管的底部和在其下面的载玻片无缝连接，并共同固 定在甩片架底座上组成。然后将离心沉淀制片组合分别放入吊篮式离心机的吊蓝中，以 1，000-3, 000转/分转速离心5-15分钟，在离心沉淀制片过程中完成对病原菌的浓缩和形 态固定并使之黏附在载玻片上，得到多张分布均勻的薄层涂片。离心结束后弃上层液，将离 心沉淀制片组合倒扣浙干水分，卸下载玻片30-70°C烘3-10分钟。样品中的细菌个体很小， 不容易沉淀黏附在玻片上，因此需要较高的离心转速(1，000-3, 000转/分)。如同一样品 一次所需离心制片的数量超过吊蓝能存放的数量，可作两次以上离心即可得到。(4)鉴别染色在含同一样品的多张载玻片上鉴别染色使用何种染色液进行反应，依据细菌种类 和可检出的特点，例如特有的形态、特有蛋白或抗原，鉴别染色可采用常规的化学染色法或 免疫染色法。化学染色法例如依据革兰染色呈阳性的肺炎链球菌有荚膜和白色念珠菌有念珠 状典型形态和排列特点，采用革兰染色就可检出；结核杆菌可通过抗酸染色检出。免疫染色法主要是指直接抗体染色法，它包括抗原和辣根过氧化物酶(HRP)标记 抗体特异结合的直接抗体染色法，就是HRP标记的单抗或多抗的Fab段和病原菌抗原特异 结合，例如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、军团菌、B型流感嗜血杆菌、鲍曼不动 杆菌、曲霉菌、放线菌等可通过特异性的酶标单抗或多抗，采用直接抗体染色法检出；也包 括病原菌的特殊蛋白和HRP标记的IgG抗体Fc段非特异结合的直接抗体染色法，HRP标记 的IgG抗体是兔IgG抗体或鼠IgG抗体，例如利用金黄色葡萄球菌A蛋白能和HRP标记的 兔IgG抗体Fc段结合的特点，可通过直接抗体染色法检出金黄色葡萄球菌。采用和辣根过 氧化物酶相对应的显色剂，它包含三种液体(a)浓度为0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3’ - 二氨 基联苯胺)底物液、(b)浓度为0. 33-1重量％。双氧水和(c)浓度为2. 00-15. 00mg/ml氯化 钴溶液(或浓度为5. 00-20. 00mg/ml硫酸镍氨溶液)，反应产物呈蓝色，有利于病原菌的观 察。染色次序举例对痰液中病原菌的鉴别可以先做革兰染色，依据染色反应、形态学 特征和排列方式就可检出革兰染色阳性的如肺炎链球菌和白色念珠菌，同时如发现革兰阳 性球菌，则可再通过直接抗体染色，例如针对金黄色葡萄球菌的鉴别染色，使样品中的金黄 色葡萄球菌显出蓝色，和其它细菌及背景的颜色不同。(5)观察与计算结果在完成染色后，按常规通过显微成像系统，较佳用油镜对样品中病原菌的染色反 应、形态学和排列方式进行观察，并计算得出结果，就可对样品中多种病原菌作出快速检 测。本发明一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒是由下列组成1、预处理液，是由5_50ml氨水(密度0. 88g/ml)，I-IOg氯化钠及余量为水配制成 的IOOml混合液。该液基细胞学病原菌样品的预处理液能裂解样品中的肺泡巨噬细胞、中 性粒细胞等白细胞，让被细胞包裹的病原菌从中释放，并有利于样品的液化；
2、液化剂，可以是蛋白酶，例如0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶， 也可以是巯基还原剂，例如浓度为3. 0-30. Omg/ml巯基乙醇、浓度为4. 0-40. Omg/ml β -巯 基乙醇、浓度为3. 5-35. Omg/ml 1，4-二巯基丁二醇、浓度为4. 5-45. Omg/ml 二硫赤藓糖醇、 浓度为5. 0-50. Omg/ml 二硫苏糖醇等。该液化剂主要用于液化痰等黏液，打开样品中蛋白 间的化学键，特别是肽键、氢键和二硫键，增加样品的水溶性，让被蛋白包裹的病原菌从中 释放；3、稀释液，为0. 5-5重量％的氯化钠溶液。用于对已均相化的样品进行稀释，能使 背景干净和有利于样品中病原菌的形态固定和检测；4、鉴别染色液，是常规用的，可分为化学染色液和免疫染色液。化学染色液由一瓶或多瓶不同成分的试剂组成，例如革兰染色液包括结晶紫、碘 液、脱色剂和复染剂四种试剂；抗酸染色液包括石炭酸复红液，5%盐酸酒精液和亚甲基蓝 液三种试剂。免疫染色液包含HRP标记的抗体溶液和显色剂。HRP标记的抗体溶液，是内含 HRP标记的针对病原菌抗原特异的单抗或多抗溶液，例如单抗鼠抗军团菌抗体-HRP溶液， 多抗兔抗鲍曼不动杆菌抗体-HRP溶液；也可以是能和病原菌特殊蛋白结合的内含HRP标 记的IgG抗体溶液，例如兔IgG-HRP溶液，能和金黄色葡萄球菌上的A蛋白结合。相对于 HRP的显色剂包括三种液体(a)浓度为0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3’ - 二氨基联苯胺)底物 液，(b)浓度为0. 33-1重量％。双氧水和(c)浓度为2. 00-15. 00mg/ml氯化钴溶液或浓度为 5. 00-20. 00mg/ml硫酸镍氨溶液。反应产物呈蓝色，有利于病原菌的观察。使用何种染色液反应，应依据细菌的特点，例如特有的形态、特有的蛋白或抗原来 决定；5、耗材，包括(a)离心沉淀制片组合，可将经液化处理后的样品和稀释液通过高 速离心过程将病原菌浓缩沉淀到载玻片上，完成薄层涂片过程，(b)磁力搅拌子，用于搅拌 剪切样品，有利于液化剂的渗透，缩短液化时间。本发明一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法的优点1.提供了一种新的病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法本发明在上述已有技术人体脱落细胞液基薄层涂片技术的基础上进行改进，提供 一种新的病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法，可对样品中多种病原菌作出快速 检测。已有技术人体脱落细胞液基薄层离心沉淀制片技术检测的目的物是细胞，使用的 细胞保存液主要成分是酒精，能对人体脱落细胞进行形态固定，就是说在人体脱落细胞的 病理学观察中首先要保持人体细胞的完整，然后离心沉淀制片，由于人体细胞比较重，较低 的离心转速已满足，而较高的离心转速反而会增加背景，不利于肿瘤细胞的观察。而本发 明病原菌液基薄层离心沉淀制片技术检测的目的物是微生物病原菌，要观察病原菌首先要 将包裹病原菌的细胞打破，使病原菌从中释放出来。有些病原菌例如结核杆菌、军团菌是 在人体白细胞中，本发明检测试剂盒中包含的强碱性预处理液不含酒精成分，能裂解样品 中的肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等白细胞，使被人体细胞包裹的病原菌从中释放。检测试 剂盒中还包含液化剂，能打开样品中蛋白间的化学键，特别是肽键、氢键和二硫键，增加样 品的水溶性，让被蛋白包裹的病原菌从中释放出来。检测试剂盒中还包含稀释液，能对已均相化的样品进行稀释，使背景干净和有利于样品中病原菌的形态固定和检测。又因病原 菌个体相比较于细胞是小且轻，因此本发明在离心制片的工艺条件上采用较高的离心转速 1，000-3, 000转/分钟，不然病原菌是粘不到玻片上的，在离心沉淀制片过程中完成对病原 菌的浓缩和形态固定并使之黏附在载玻片上，得到多张分布均勻的薄层涂片。相比较于已有技术中的检测物人体细胞，本发明检测物病原菌的生物化学特性也 明显不同，细菌没有细胞核，因此鉴别染色步骤中的染色液和染色方法两者也是完全不同 的。最后的结果鉴别也是不同的，已有技术是看有没有肿瘤细胞，而本发明离心沉淀制片技 术得到的多张分布均勻的薄层涂片，根据病原菌的染色反应、形态学和排列方式，可以同时 对样品中多种病原菌作出检测。2.建立了一种病原菌液基薄层涂片快速灵敏的检测方法本发明病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法，在对含病原菌的样品进行 均相化处理后，只需一步离心就可完成制片，高速离心过程产生的离心力可使溶液中的病 原菌沉淀在玻片上，完成对样品的集菌浓缩，得到多张分布均勻的薄层涂片，然后针对不同 病原菌的特点进行鉴别染色，最后根据病原菌的染色反应、形态学和排列方式就可对样品 中多种病原菌作出快速检测，整个过程一小时内就可完成。相比较于目前常规细菌培养鉴 定所需的24-48小时，大大缩短了检测时间，能及时作出检测报告，为临床诊断治疗提供指 导和依据。本发明检测试剂盒中包含的预处理液能裂解样品中的肺泡巨噬细胞、中性粒细胞 等白细胞，液化剂能有效打开粘蛋白，致使被人体细胞或蛋白包裹的病原菌都能从中释放 出来。再通过液基离心沉淀薄层制片的过程更可完成对病原菌的浓缩，特别是免疫学鉴别 染色方法，更有放大作用，显色剂显色后呈显人裸眼更敏感的蓝色，与目前常规直接涂片法 比较，检测的病原菌数量和细菌种类大大增加，因而检测的灵敏度也大大提高，能更真实反 映病人的受感染程度。因此本发明病原菌液基薄层涂片快速灵敏的检测方法，解决了目前 临床上存在的不能为含有病原菌的样品快速灵敏地提供病原菌感染检测结果的问题，具有 较大的社会意义。3.本发明病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法具有高性价比本发明病原菌液基薄层涂片检测方法已基本实现半自动化，所有检测试剂盒中的 试剂及耗材，和检测方法中所用的仪器设备基本实现国产化，具有较高的性价比。检测方法 又比较简单，可作为一个实用的检测技术，在我国各级医疗机构中使用，具有较大的临床推 广价值，市场潜力较大。
具体实施例方式实施例1痰液(或脑脊液或关节液)中结核杆菌的液基薄层涂片检测取200例结核病人的痰液(或脑脊液或关节液)样品进行液基薄层涂片法和直接 涂片法对比实验。用于结核杆菌液基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液(由30ml密度为 0. 88g/ml的氨水，4g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓度为20mg/ml巯基乙醇 的液化剂，浓度为0. 9%氯化钠溶液的稀释液，包括石炭酸复红液、5%盐酸酒精液和亚甲基 蓝液三种试剂的抗酸染色液和耗材(a)离心沉淀制片组合(长沙英泰仪器有限公司)和 (b)磁力搅拌子组成。检测使用的设备是磁力搅拌仪(MM-30型，上海微银生物技术有限公司)、吊蓝式离心机(Cytopr印-1型，长沙英泰仪器有限公司)、恒温烘片机(MW-50型，上海 微银生物技术有限公司)和常规的显微成像系统和系统软件。将痰样品全部(或5ml脑脊液或关节液)直接放入采样杯中，再以样品和预处理 液1 10的体积比加入预处理液、以样品和液化剂1 1的体积比加入液化剂和磁力搅拌 子，杯子用上盖盖紧，放在磁力搅拌仪上，转速2，000转/分，加热56°C搅拌15分钟。然后 将已均相化的样品和稀释液按1 3的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中， 将离心沉淀制片组合分别放入吊篮式离心机的吊蓝中，以1，500转/分离心15分钟，作液 基薄层离心沉淀制片。离心结束后弃上层液，将离心沉淀制片组合倒扣，浙干多余水分，卸 下载玻片后放在恒温烘片机上70°C烘10分钟，然后进行抗酸染色，用石炭酸复红液加热初 染、水清洗后再经5%盐酸酒精液脱色，水清洗后再经亚甲基蓝液复染，用水冲洗，65°C烘5 分钟，结核杆菌染成杆状红色，其它细菌或细胞均染成蓝色。通过常规的显微成像系统用油 镜观察和系统软件连接计算机进行结果计算，结核杆菌为阳性。结果判断按《结核病诊断实 验室检验规程》的要求进行(中国防痨协会基础专业委员会，中国教育文化出版社，P. 16， 2006年1月)。直接涂片法(常规法实验步骤省略)从中检测出80例，阳性检出率为40%， 而本发明液基薄层涂片检测法从中检测出100例，阳性检出率为50%，阳性符合率100%。 阳性中9例直接涂片法为+，本发明方法为+++ ；2例直接涂片法为+，本发明方法为++++ ；8 例直接涂片法为++，本发明方法为++++;20例直接涂片法为阴性，本发明方法为阳性，其中 12例为+，8例为++。实施例2脓液和创伤感染组织样品中绿脓杆菌液基薄层涂片检测用于绿脓杆菌液基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液(由25ml密度为0. 88g/ml 的氨水，Ig氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓度为5. Omg/ml 二硫赤藓糖醇的 液化剂，浓度为氯化钠溶液的稀释液，浓度为0. 5μ g/ml鸡抗绿脓杆菌抗体(IgY)-HRP 的抗体溶液，显色剂(显色剂包括浓度为0. 40mg/ml DAB底物液，浓度为0. 35重量％。双氧 水和浓度为10mg/ml氯化钴溶液)和耗材组成，耗材和使用设备同实施例1。对脓液和创伤感染组织样品有三种情况1.对于开放性感染，先用无菌生理盐 水冲洗感染表面，再以无菌试纸采取脓液或病灶深部的分泌物，将无菌试纸在装有预处理 液的采样杯中洗脱；2.对于感染部位的切除组织样品，研磨后放入装有预处理液的采样杯 中；3.对于闭锁性脓肿，可将穿刺或引流的分泌物直接放入装有预处理液的采样杯中。样 品与预处理液的体积比为1 5，样品与液化剂的体积比为1 O。杯子用上盖盖紧，放在 磁力搅拌仪上，转速1，500转/分，加热50°C搅拌25分钟。然后将已均相化的样品和稀释 液按1 1的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合分别 放入吊篮式离心机的吊蓝中，以2，OOO转/分离心12分钟，作液基薄层离心沉淀制片。离 心结束后弃上层液，将离心沉淀涂片组合倒扣，浙干多余水分，卸下载玻片后放在恒温烘片 机上50°C烘5分钟。然后进行鉴别染色，在烘干的载玻片上加四滴鸡抗绿脓杆菌抗体-HRP 溶液，室温孵育1小时后，用水冲洗，45°C烘6分钟，再滴加显色剂(DAB底物液、双氧水和氯 化钴溶液各两滴)在玻片上混勻，室温孵育3分钟后用水冲洗，37°C烘3分钟，染色反应显 示杆状深蓝色。通过显微成像系统用油镜观察和系统软件连接计算机进行结果计算，绿脓 杆菌为阳性。取150例脓液和创伤感染组织样品进行液基薄层涂片检测，其中146为阳性， 阳性率为97. 3%。
实施例3痰液(或支气管灌洗物)样品中金黄色葡萄球菌和/或肺炎链球菌和/ 或白色念珠菌的液基薄层涂片检测用于金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和白色念珠菌联合检测的检测试剂盒是由预处 理液(由37ml密度为0. 88g/ml的氨水，5g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓 度为22mg/ml β -巯基乙醇的液化剂、浓度为1. 5%氯化钠溶液的稀释液、包括结晶紫、碘 液、脱色剂和复染剂四种试剂的革兰染色液、浓度为0. 4 μ g/ml兔IgG-HRP的抗体溶液和显 色剂(显色剂包括浓度为0. 75mg/ml DAB底物液、浓度为0. 67重量％。双氧水和浓度为8mg/ ml氯化钴溶液)以及耗材组成，耗材和使用设备同实施例1。将待查病人的痰液或支气管灌洗物放入采样杯中，在采样杯中以样品和预处理液 1 12(支气管灌洗物为1 3)的体积比加入强碱性的预处理液、以样品和液化剂1 2 的体积比加入液化剂和磁力搅拌子，杯子用上盖盖紧，放在磁力搅拌仪上，转速2，000转/ 分，加热60°C搅拌15分钟。然后将已均相化的样品和稀释液按1 4(支气管灌洗物为 1 0)的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合分别放 入吊篮式离心机的吊蓝中，以1，500转/分离心13分钟，作液基薄层离心沉淀制片。离心 结束后弃上层液，将离心沉淀制片组合倒扣，浙干多余水分，卸下载玻片后在烘片机上55°C 烘3分钟，这样每例样品得到两张载玻片。先将一张玻片做革兰染色1.初染，结晶紫染色 1分钟，水洗；2.媒染，碘液染色1分钟，水洗；3.脱色，脱色剂用到无紫色脱落为止，水洗； 4.复染，复染剂染色30秒，水洗，37°C烘5分钟后镜检。结果是革兰阳性呈紫色(革兰阴性 呈红色)。依据革兰染色阳性，紫色链球菌有荚膜结构和/或紫色典型的念珠结构就可检出 肺炎链球菌和/或白色念珠菌(如没有发现革兰阳性球菌，实验则结束)。如发现革兰阳性 的球状细菌，则再在另一张玻片上滴加四滴兔IgG-HRP溶液，室温孵育10分钟，双蒸水冲洗 后40°C烘5分钟。然后滴加显色剂(DAB底物液、双氧水和氯化钴溶液各两滴)在玻片上混 勻，室温孵育3分钟后用水冲洗，在烘片机上37°C烘3分钟。最后通过显微成像系统用油镜 观察和系统软件连接计算机进行结果计算，出现染成深蓝色的串状葡萄球菌，则显示金黄 色葡萄球菌阳性。实验取50例痰液(或支气管灌洗物)样品进行检测，实验结果1例为肺 炎链球菌，白色念珠菌和金黄色葡萄球菌混合感染例阳性，3例为肺炎链球菌和金黄色葡萄 球菌混合感染例阳性，2例为肺炎链球菌和白色念珠菌混合感染例阳性，12例为肺炎链球 菌阳性，9例为金黄色葡萄球菌阳性，4例为白色念珠菌阳性。实施例4尿样品中大肠杆菌的液基薄层涂片检测用于大肠杆菌的液基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液(由40ml密度为0. 88g/ ml的氨水，6g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓度为7. Omg/ml 二硫苏糖醇的 液化剂，浓度为2. 5%氯化钠溶液的稀释液，浓度为0. 5μ g/ml鼠抗大肠杆菌-HRP的抗体溶 液和显色剂(显色剂包括浓度为0. 70mg/ml DAB底物液、浓度为0. 57重量％。双氧水和浓度 为6. 8mg/ml氯化钴溶液)以及耗材组成，耗材和使用设备同实施例1。首先取尿样品30ml分成两管，3，000转/分离心15分钟后弃上清液，将沉淀物挑 进采样杯中，在采样杯中以样品和预处理液1 5的体积比加入强碱性的预处理液、以样品 和液化剂1 0.1的体积比加入液化剂和磁力搅拌子，杯子用上盖盖紧，放在磁力搅拌仪 上，转速1，500转/分，加热50°C搅拌5分钟。然后将已均相化的样品和稀释液按1 2 的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合分别放入吊篮式离心机的吊蓝中，以2，500转/分离心9分钟，作液基薄层离心沉淀制片。离心结束后弃 上层液，将离心沉淀涂片组合倒扣，浙干多余水分并卸下载玻片，在烘片机上42°C烘3. 5分 钟。然后进行鉴别染色，滴加四滴鼠抗大肠杆菌-HRP溶液在玻片上，室温孵育40分钟，双蒸 水冲洗后40°C烘5分钟。接着滴加显色剂(DAB底物液、双氧水和氯化钴溶液各两滴)在玻 片上混勻，室温孵育4分钟，双蒸水冲洗后41°C烘3分钟。最后通过显微成像系统用油镜进 行观察和系统软件连接计算机进行结果计算。出现染上深蓝色的杆状细菌，则显示大肠杆 菌阳性。实验取80例尿样品进行液基薄层涂片检测，其中33例是阳性，阳性率为41. 3%0实施例5粪便样品中沙门氏菌和/或志贺氏菌的液基薄层涂片检测用于沙门氏菌和志贺氏菌的液基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液(由20ml密 度为0. 88g/ml的氨水，3g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓度为30. Omg/ml 1，4-二巯基丁二醇的液化剂，浓度为3. 5%氯化钠溶液的稀释液，浓度为0. 3 μ g/ml鼠抗沙 门氏菌-HRP和浓度为0. 4 μ g/ml鼠抗志贺氏菌-HRP的抗体溶液和显色剂(显色剂包括浓 度为0. 65mg/ml DAB底物液、浓度为0. 55重量％。双氧水和浓度为16. 8mg/ml硫酸镍氨溶 液)以及耗材组成，耗材和使用设备同实施例1。首先取粪便样品一块用20ml生理盐水搅勻去污并萃取，萃取液分成两管300转/ 分钟离心2分钟。将前面离心得到的上清液倒入另两管中，3，000转/分钟再离心15分钟， 将该两管的沉淀物挑出放入采样杯中，以样品和预处理液1 15的体积比加入强碱性预处 理液，以样品和液化剂1 0.5的体积比加入液化剂和放入磁力搅拌子。杯子用上盖盖紧， 放在磁力搅拌仪上，转速1，600转/分，加热45°C搅拌10分钟。然后将已均相化的样品和 稀释液按1 2的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合 分别放入吊篮式离心机的吊蓝中，以2，000转/分离心8分钟，作液基薄层离心沉淀制片。 离心结束后弃上层液，将离心沉淀涂片组合倒扣，浙干多余水分并卸下载玻片，在烘片机上 42°C烘3分钟。然后进行鉴别染色，在两张玻片上分别滴加四滴鼠抗沙门氏菌-HRP溶液和 鼠抗志贺氏菌-HRP溶液，室温孵育45分钟，双蒸水冲洗后38°C烘3分钟。然后滴加显色剂 (DAB底物液、双氧水和硫酸镍氨溶液各两滴在每张玻片上混勻)，室温孵育5分钟，双蒸水 冲洗后44°C烘3分钟。最后通过显微成像系统用油镜观察和系统软件连接计算机进行结果 计算，两张玻片上同时(或仅在一张玻片上)出现染上深蓝色的杆状细菌，则显示沙门氏菌 和(或)志贺氏菌阳性。实验取80例粪便样品进行液基薄层涂片检测，实验结果为1例沙 门氏菌和志贺氏菌混合感染阳性，12例沙门氏菌阳性，5例志贺氏菌阳性。实施例6胸腹水样品中曲霉菌和/或放线菌液基薄层涂片检测用于曲霉菌和放线菌的液基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液(由15ml密度为 0. 88g/ml的氨水，2g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混合液)，浓度为3%糜蛋白酶的 液化剂，浓度为2. 3%氯化钠溶液的稀释液，浓度为0. 6 μ g/ml鼠抗曲霉菌-HRP和浓度为 1 μ g/ml兔抗放线菌-HRP的抗体溶液和显色剂(显色剂包括浓度为0. 60mg/ml DAB底物 液、浓度为0. 543重量％。双氧水和浓度为7. 8mg/ml硫酸镍氨溶液)以及耗材组成，耗材和 使用设备同实施例1。首先取胸腹水样品30ml分成两管，3，000转/分钟离心15分钟后弃上清液，将两 管的沉淀物挑出放入采样杯中，以样品和预处理液1 6的体积比加入强碱性预处理液、以 样品和液化剂1 0.2的比例加入液化剂和放入磁力搅拌子。杯子用上盖盖紧，放在磁力搅拌仪上，转速1，500转/分，加热48°C搅拌5分钟。然后将已均相化的样品和稀释液按 1 4. 5的体积比稀释，加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合分别放 入吊篮式离心机的吊蓝中，以1，500转/分离心10分钟，作液基薄层离心沉淀制片。离心 结束后弃上层液，将离心沉淀涂片组合倒扣，浙干多余水分并卸下载玻片，在烘片机上46°C 烘3分钟。然后进行鉴别染色，分别在两张玻片上滴加四滴鼠抗曲霉菌-HRP溶液和兔抗放 线菌-HRP溶液，室温孵育30分钟，双蒸水冲洗后40°C烘3分钟。然后滴加显色剂(DAB底 物液、双氧水和硫酸镍氨溶液各两滴)在每张玻片上混勻，室温孵育5分钟，双蒸水冲洗后 44°C烘3分钟。最后通过显微成像系统用油镜观察和系统软件连接计算机进行结果计算。 在一张玻片上出现(或不出现)染上深蓝色的曲霉菌结构，有(或没有)染上深蓝色的分 生孢子头、梗子和顶囊，则显示曲霉菌阳性(或阴性)。在另一张玻片上出现(或不出现) 染上深蓝色的放线菌结构，有(或没有)染上深蓝色的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝，则显 示放线菌阳性(或阴性)。实验取70例胸腹水样品进行液基薄层涂片检测，实验结果为2 例曲霉菌和放线菌混合感染阳性，12例曲霉菌阳性，3例放线菌阳性。实施例7支气管灌洗物样品中六种病原菌的液基薄层涂片检测支气管灌洗物样品中六种病原菌是指军团菌、B型流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、 肺炎克雷伯菌、肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌。用于六种病原菌的液基薄层涂片检测试剂盒是 由预处理液(由IOml密度为0. 88g/ml的氨水，1. 5g氯化钠及余量为水配制成的IOOml混 合液)，浓度为2%胃蛋白酶的液化剂，浓度为4. 3%氯化钠溶液的稀释液，浓度为0. 5μ g/ ml鼠抗军团菌-HRP、浓度为1. 2 μ g/ml兔抗B型流感嗜血杆菌-HRP、浓度为1. 4 μ g/ml兔 抗鲍曼不动杆菌-HRP、浓度为2 μ g/ml兔抗肺炎克雷伯菌-HRP、浓度为2. 5 μ g/ml兔抗肠 原杆菌-HRP和浓度为1. 5 μ g/ml兔抗硝酸盐阴性杆菌-HRP的抗体溶液和显色剂(显色剂 包括浓度为0. 55mg/ml DAB底物液、浓度为0. 53重量％。双氧水、浓度为18. 8mg/ml硫酸镍 氨溶液)以及耗材组成，耗材和使用设备同实施例1。首先取3ml支气管灌洗物样品放入采样杯中，在采样杯中以样品和预处理液1 4 的体积比加入强碱性的预处理液和磁力搅拌子，不加液化剂。杯子用上盖盖紧，放在磁力搅 拌仪上，转速2，000转/分，加热56°C搅拌5分钟。然后将已均相化的样品(不需要加稀 释液)加入离心沉淀制片组合中的离心管中，将离心沉淀制片组合分别放入吊篮式离心机 的吊蓝中，以2，500转/分离心6分钟，作液基薄层离心沉淀制片。离心结束后弃上层液， 将离心沉淀制片组合倒扣，浙干多余水分，卸下载玻片后在烘片机上43°C烘3分钟。然后 进行染色，分别在六张玻片上滴加四滴鼠抗军团菌-HRP溶液、兔抗B型流感嗜血杆菌-HRP 溶液、兔抗鲍曼不动杆菌-HRP溶液、兔抗肺炎克雷伯菌-HRP溶液、兔抗肠原杆菌-HRP溶液 和兔抗硝酸盐阴性杆菌-HRP溶液，室温孵育40分钟，双蒸水冲洗后45°C烘5分钟。然后滴 加显色剂(DAB底物液、双氧水和硫酸镍氨溶液各两滴)在每张玻片上混勻，室温孵育3. 5 分钟，双蒸水冲洗后45°C烘3分钟。最后通过显微成像系统用油镜观察和系统软件连接计 算机进行结果计算。在分别和上述不同的抗体-HRP的抗体溶液相对应的六个玻片上出现 染上深蓝色杆状的军团菌或/和B型流感嗜血杆菌或/和鲍曼不动杆菌或/和和肺炎克雷 伯菌或/和肠原杆菌或/和硝酸盐阴性杆菌，则显示军团菌或/和B型流感嗜血杆菌或/ 和鲍曼不动杆菌或/和肺炎克雷伯菌或/和肠原杆菌或/和硝酸盐阴性杆菌为阳性。实验 取80例样品进行液基薄层涂片检测，实验结果1例为军团菌和B型流感嗜血杆菌混合感染阳性，1例为鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌混合感染阳性，2例为军团菌，8例为B型流感嗜 血杆菌，10例为鲍曼不动杆菌，20例为肺炎克雷伯菌，5例为肠原杆菌，7例为硝酸盐阴性杆菌。
权利要求
一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒是由下列组成(1)预处理液，是由密度为0.88g/ml的5 50ml氨水，1 10g氯化钠及余量为水配制成的100ml混合液；(2)液化剂，是蛋白酶或巯基还原剂；(3)稀释液，为0.5 5重量％的氯化钠溶液；(4)鉴别染色液，是化学染色液或免疫染色液；(5)耗材，包括(a)离心沉淀制片组合，(b)磁力搅拌子。
2.如权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于所述的液化剂蛋白酶是0.5-5重量％糜 蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶。
3.如权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于所述的液化剂巯基还原剂是浓度为 3. 0-30. Omg/ml 巯基乙醇、浓度为 4. 0-40. Omg/ml β -巯基乙醇、浓度为 3. 5-35. Omg/ml 1， 4- 二巯基丁二醇、浓度为4. 5-45. Omg/ml 二硫赤藓糖醇或浓度为5. 0-50. Omg/ml 二硫苏糖
4.如权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于所述的鉴别染色液为化学染色液时，是 革兰染色液，包括结晶紫，碘液，脱色剂和复染剂四种试剂。
5.如权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于所述的鉴别染色液为化学染色液时，是 抗酸染色液，包括石炭酸复红液，5%盐酸酒精液和亚甲基蓝液三种试剂。
6.如权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于所述的鉴别染色液为免疫染色液，它包 含辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体溶液和相对于HRP的显色剂。
7.如权利要求1或6所述检测试剂盒，其特征在于所述的鉴别染色液为免疫染色液，它 包含的HRP标记抗体溶液是内含HRP标记的针对病原菌抗原特异的单抗或多抗溶液，或是 能和病原菌特殊蛋白结合的内含HRP标记的IgG抗体溶液。
8.如权利要求1或6所述检测试剂盒，其特征在于所述的鉴别染色液为免疫染色液，它 包含的相对于HRP的显色剂包括三种液体(a)浓度为0. 10-0. 80mg/mlDAB (3，3，- 二氨基 联苯胺)底物液，(b)浓度为0. 33-1重量％。双氧水和(c)浓度为2. 00-15. 00mg/ml氯化钴 溶液或浓度为5. 00-20. 00mg/ml硫酸镍氨溶液。
9.权利要求1所述病原菌液基薄层涂片检测试剂盒的检测方法，其特征在于包含下列 步骤(1)取样取含病原菌的样品；(2)样品的均相化处理在样品中以样品和预处理液1 3-20的体积比加入预处理液， 以样品和液化剂1 0-5的体积比加入液化剂，和磁力搅拌子一起加热45-65°C搅拌5-30 分钟，转速为1，000-2, 000转/分；(3)液基离心沉淀薄层制片取上述已均相化的样品和稀释液按1 0-6体积比混合，放 入吊篮式离心机的吊蓝中，以1，000-3, 000转/分转速离心5-15分钟，进行液基离心沉淀 制片，得到液基离心沉淀薄层涂片；(4)鉴别染色在含同一样品的一张以上的载玻片上进行鉴别染色，采用常规的化学染 色法或免疫染色法；(5)观察与计算结果在完成染色后，按常规通过显微成像系统进行观察，并通过系统软 件连接计算机进行结果计算。
10.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(1)步中的样品是痰 液、支气管灌洗物、胸腹水、脓液和创伤感染组织、脑脊液、关节液、尿液或粪便。
11.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(1)步中样品含有的 病原菌为二类(a)细菌是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、结核杆菌、肺炎链球菌、金黄色 葡萄球菌、绿脓杆菌、军团菌、B型流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、肠原杆菌或 硝酸盐阴性杆菌；(b)真菌是白色念珠菌、曲霉菌或放线菌。
12.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(2)步中的预处理 液是取之于由密度为0. 88g/ml的5-50ml氨水、l_10g氯化钠及余量为水配制的IOOml混合 液。
13.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(2)步中的液化剂是 蛋白酶或巯基还原剂。
14.如权利要求9或13所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(2)步中的液 化剂蛋白酶是0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶。
15.如权利要求9或13所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(2)步中的液 化剂巯基还原剂是浓度为3. 0-30. Omg/ml巯基乙醇、浓度为4. 0-40. Omg/ml β -巯基乙醇、 浓度为3. 5-35. Omg/ml 1,4- 二巯基丁二醇、浓度为4. 5-45. Omg/ml 二硫赤藓糖醇或浓度为 5. 0-50. Omg/ml 二硫苏糖醇。
16.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(3)步中的稀释液为 0. 5-5重量％的氯化钠溶液。
17.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(4)步中的鉴别染色 采用的化学染色法，是革兰染色法或抗酸染色法。
18.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(4)步中的鉴别染色 采用的免疫染色法，是HRP标记的的单抗或多抗的Fab段和病原菌抗原特异结合的直接抗 体染色法，或是HRP标记的IgG抗体的Fc段和病原菌的特殊蛋白非特异结合的直接抗体染 色法。
19.如权利要求18所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(4)步鉴别染色采 用的免疫染色法，是HRP标记的兔IgG抗体或鼠IgG抗体的Fc段和病原菌的特殊蛋白非特 异结合的直接抗体染色法。
20.如权利要求9，18或19所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(4)步鉴 别染色采用的免疫染色法中，采用和HRP相对应的显色剂，它包括三种液体(a)浓度为 0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3，- 二氨基联苯胺)底物液，(b)浓度为0. 33-1重量％。双氧水和 (c)浓度为2. 00-15. 00mg/ml氯化钴溶液或浓度为5. 00-20. 00mg/ml硫酸镍氨溶液。
21.如权利要求9所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述第(5)步中通过显微成 像系统用油镜进行观察，并通过系统软件连接计算机进行结果计算。
全文摘要
本发明是一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法。检测试剂盒是由预处理液，液化剂，稀释液，鉴别染色液和耗材组成。这种检测试剂盒的检测方法，是在检测样品中加入强碱性预处理液和液化剂进行样品的均相化处理，再加入稀释剂，作液基离心沉淀薄层制片，得到多张分布均匀的病原菌液基薄层涂片，然后进行鉴别染色，根据病原菌的染色反应、形态学和排列方式的观察与计算，就可对样品中多种病原菌作出检测结果。本发明建立了一种病原菌液基薄层涂片快速灵敏的检测方法，整个过程一小时内就可完成，检测方法又比较简单，具有较大的临床推广价值。
文档编号G01N1/30GK101974609SQ20101050047
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者刘佳, 吴增斌, 江静, 潘曙明, 程振球, 贺坚慧 申请人:贺坚慧