专利名称：海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法
技术领域：
本发明属于海洋污染物检测技术领域，具体涉及一种海水中有机污染物潜在遗传 毒性的检测方法。
背景技术：
随着我国经济与社会的快速发展，大量且多种多样有机污染物进入到水环境中， 使得水体不同程度地表现出致突变性、致癌性和致畸性。由于海洋是地球水域的集中地，各 种有机污染物将最终进入海洋，危及海洋生态系统和人类的健康和生命安全。据美国《今日 科学》网站报道，首次在全球范围内对海洋哺乳动物体内有毒污染物的研究已取得初步成 果，但结果令人担忧的是，那些生活在人们认为尚未受到污染的太平洋中部的抹香鲸体内 累积了大量的持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)，这个研究结果 就表明全球的水域环境已经受到污染物特别是持久性有机污染物的严重破坏。与常规污染物不同，持久性有机污染物在自然环境中滞留时间长，很难降解，毒性 极强，能导致全球性的传播。这类污染物通过直接或间接的途径(通过食物链)进入人体， 会导致生殖系统、呼吸系统、神经系统等人体器官中毒、癌变或畸形，最后造成死亡。而有机 污染物等环境诱变剂导致的遗传毒性是上述致癌、致畸、致突变的遗传基础。因此，不论是 从保护海洋生态系统还是保障我们人类自身的身体健康和生命安全，建立一种短期、快速、 有效的海水中有机污染物遗传毒性的检测方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法，具体是利 用一种海洋浮游植物米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)与单细胞凝胶电泳技术，建立海水 中有机污染物潜在遗传毒性快速检测的方法，以弥补现有技术的不足。本发明采用的米氏凯伦藻隶属于裸甲藻目凯伦藻属，为世界广布种，常见于温带 和热带浅海水域，米氏凯伦藻最显著的特点是单细胞，营游泳生活，不具有植物细胞所具 有的细胞壁，具有一个大而明显的细胞核，对水体中理化因素的变化极其敏感。当水体中 存在具有遗传毒性的有机物污染且污染物的浓度超过一定限度时，米氏凯伦藻细胞核中的 DNA会发生断裂，在进行单细胞凝胶电泳检测(single cell gel electrophoresis assay, 简称SCGE，又称彗星实验，comet assay)时断裂的DNA会形成类似彗星尾部的电泳图，从而 证实水体中存在具有遗传毒性的有机污染物，并可根据彗星图像中彗尾的大小等指标，来 判断有机污染物污染程度的高低。本发明的检测方法采用以下步骤1)海水中有机污染物的提取与浓缩将海水样品用液-液萃取法 (Liquid-Liquidextraction, LLE)和固相萃取法(Solid phase extraction, SPE)提取海 水中的有机污染物，并经无水Na2SO4干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得到洗脱液，将洗脱液用氮 气吹干，最后用二甲亚砜(DMSO)溶解，得到有机物浓缩液备用；
2)米氏凯伦藻细胞收集和浓缩；选取处于指数生长期的米氏凯伦藻，用5uM的筛 绢通过自然沉降法来浓缩和富集；收集完之后用过滤消毒的无菌大洋水洗下来，同时进行 显微镜计数，调整米氏凯伦藻细胞密度在lX105cellS/mL左右，备用；3)细胞染毒处理将步骤2)中获得的细胞与步骤1)的有机物浓缩液在20°C条 件下进行染毒处理lh，染毒体系总体积为5mL ；染毒体系中有机物浓度分别设为原海水中 有机污染物浓度的1倍，5倍，10倍，100倍4个浓度梯度，将未染毒的米氏凯伦藻细胞作 为对照组；染毒结束后，以2000转/分钟的速度离心去除上清得到米氏凯伦藻细胞，将 实验组和对照组的米氏凯伦藻细胞重新用无菌大洋水悬浮，调整米氏凯伦藻细胞浓度在 lX105cells/mL 左右，备用；4)制备第一层胶配制0.8%的正常熔点的琼脂糖凝胶NMA，在80°C条件下，从磨 砂载玻片的一端垂直流下，铺满整个载玻片。将铺过胶的载片在80°C烤干，晾凉，备用；5)制备第二层胶将配好的0.6%低熔点琼脂糖凝胶LMA，于水浴37°C保温。取 步骤3)中处理后的各实验组和对照组中的米氏凯伦藻细胞25uL，与75uL低熔点的琼脂 糖凝胶LMA混勻后，取60uL加到铺有第一层胶的载玻片上，盖上盖玻片，4°C黑暗下固化 10-30min ；6)细胞裂解移去第二层胶上的盖玻片，将铺有第一层胶和第二层胶(其中混有 细胞)的载玻片完全浸入4°C预冷的新鲜配制的裂解液中，4°C黑暗下裂解2h ；7)DNA解旋将裂解结束后的载玻片用磷酸缓冲液(PBS)溶液轻轻漂洗3次后，置 于水平电泳槽的正极端，倒入新鲜配制的电泳液，使电泳液没过载玻片约2-3mm，室温下避 光解旋30min ；8)细胞电泳DNA解旋结束后，在电压25V，电流300mA的条件下，电泳20_30min ；9)中和电泳结束后将载玻片置于0. 4mmol/L的Tris-HCl (pH = 7. 4)缓冲液中 中和漂洗3次，每次5分钟；10)染色向第二层胶上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min ；11)显微照相、图像分析和数据处理染色结束后用PBS溶液洗去多余的染料， 盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照；图片分析处理采用CASP软件，主要考察参数为彗 星尾距(TM)、Olive尾距(OTM)和尾长，每张载玻片分析50-100个细胞；数据分析采用 SPSS13. 0软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行t_检验，P < 0. 05作为海水中有机 物污染潜在遗传毒性大小的显著性依据。本发明将海洋浮游植物米氏凯伦藻作为海水中有机污染物遗传毒性检测的生物 材料。米氏凯伦藻无细胞壁，具有一个大而明显的细胞核，对水体中理化因素的变化极其 敏感，是在群体水平上进行海水中有机污染物潜在遗传毒性研究与评价的良好生物材料。 本发明的方法既可以将海水中有机污染物提取出来检测其遗传毒性，也可以直接用于排污 口、养殖区等污染严重的海区海水总遗传毒性的检测。检测海水总遗传毒性时只需将海水 过滤除去泥沙和杂质即可用进行后续的检测。另外，本发明第一层胶的铺制不是传统的涂 抹，而是采用高温液体胶流过载玻片而铺成，克服了涂抹造成胶的厚薄不均勻、不平整，使 细胞电泳方向不规律等的缺点；同时采用的是两层胶制片法，简化了操作步骤。本发明中采 用30 %、50 %、70 %、90 %、100 %的梯度酒精脱水来保存电泳结果。实验验证，该保存方法可 使电泳结果有效保存至少1个月之久。
图1不同浓度的芘对米氏凯伦藻DNA损伤的尾矩的影响图2不同浓度的芘对米氏凯伦藻DNA损伤的Olive尾矩的影响图3不同浓度的芘对米氏凯伦藻DNA损伤的尾长的影响图4不同浓度海水有机提取物对米氏凯伦藻DNA损伤的尾矩的影响。图5不同浓度海水有机提取物对米氏凯伦藻DNA损伤的Olive尾矩的影响。图6不同浓度海水有机提取物对米氏凯伦藻DNA损伤的尾长的影响。
具体实施例方式实施例1本发明的具体实施以检测溶解于海水中已知浓度的有机污染物芘 (Pyrene)的潜在遗传毒性为例。取ImL浓度为100ug/L的芘(Pyrene)储备液，用4999mL的无菌大洋水配置成 0. 02ug/L的阳性海水样品。1)海水中有机污染物的提取与浓缩将浓度为0.02ug/L的阳性海水样品 用液-液萃取法(Liquid-Liquid extraction, LLE)和固相萃取法(Solid phase extraction, SPE)提取海水中的有机污染物，并经无水Na2SO4干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得 到洗脱液，将洗脱液用氮气吹干，最后用Iml的二甲亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为100Ug/L 的有机物浓缩液；2)米氏凯伦藻的细胞收集和浓缩选取处于指数生长期的米氏凯伦藻细胞，用 5uM的筛绢通过自然沉降法来浓缩和富集细胞；收集完之后用过滤消毒后的无菌大洋水将 细胞洗下来，用0.3%台盼蓝染色检验细胞活性，80%以上的细胞为活细胞方可进行后续实 验，同时进行显微镜计数，调整细胞密度在lX105cellS/mL左右，备用；3)细胞染毒处理将步骤2)中获得的细胞与步骤1)中的有机物浓缩液在20°C条 件下进行染毒处理lh，染毒体系总体积为5mL ；染毒体系中有机物浓度分别为0. 01,0. 1，1， lOug/L，将未添加有机物浓缩液的染毒体系作为对照组；染毒结束后，以2000转/分钟的速 度离心去除上清得到藻细胞，将实验组和对照组的藻细胞重新用无菌大洋水悬浮，调整细 胞浓度在1 X IO5ceIlsAiL左右，备用；4)制备第一层胶配制0.8%的正常熔点的琼脂糖凝胶NMA，在80°C条件下，从磨 砂载玻片的一端垂直流下，铺满整个载玻片。将铺过胶的载片在80°C烤干，晾凉，备用；5)制备第二层胶将配好的0.6%低熔点琼脂糖凝胶LMA，于水浴37°C保温。取步 骤3)中处理后的各实验组和对照组中的细胞25uL，与75uL低熔点的琼脂糖凝胶LMA混勻 后，取60uL加到铺有第一层胶的载玻片上，盖上盖玻片，4°C黑暗下固化10-30min ；6)细胞裂解移去第二层胶上的盖玻片，将铺有第一层胶和第二层胶(其中混有 细胞)的载玻片完全浸入4°C预冷的新鲜配制的裂解液中，4°C黑暗下裂解2h ；7)DNA解旋将裂解结束后的载玻片用磷酸缓冲液(PBS)溶液轻轻漂洗3次后，置 于水平电泳槽的正极端，倒入新鲜配制的电泳液，使电泳液没过载玻片约2-3mm，室温下避 光解旋30min ；8)细胞电泳DNA解旋结束后，在电压25V，电流300mA的条件下，细胞电泳 20-30min ；
9)中和电泳结束后将载玻片置于0. 4mmol/L、pH = 7. 4的Tris-HCl缓冲液中中 和漂洗3次，每次5分钟；10)染色向混有细胞的第二层胶上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min ；11)显微照相、图像分析和数据处理染色结束后用PBS溶液洗去多余的染料， 盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照；图片分析处理采用CASP软件，主要考察参数为彗 星尾距(TM)和Oliva尾距(OTM)和尾长，每张载玻片分析50-100个细胞；数据分析采用 SPSS13. 0软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行t_检验，以P < 0. 05作为存在有机 物污染的显著性依据。如图1，实验组中有机物浓度分别为0.01，0. l，l，10ug/L，对照组就 是无菌大洋水，结果实验组的DNA尾距随着有机物浓度的升高而变长，t-检验的结果表明， 本发明的检测方法高度灵敏，能够检测出海水中0. 01ug/L的有机物。DNA损伤的Olive尾 矩(图2)和DNA损伤的尾长(图3)的t-检验分析也证明检测的灵敏度。实施例2海水样品的检测检测取自胶州湾养殖区的海水中有机污染物的潜在遗传毒性。1)海水中有机污染物的提取1. 1海水样品的采集与处理根据《海洋监测规范》中关于海水样品采集的要求， 2009年4月从青岛石老人沙子口贝类养殖区采集海水样品5L，盛于玻璃器皿中。样品采集 后，立即密封，低温(4°C以下)避光保存，并尽快运回实验室进行处理和分析。如果不立刻 进行分析，海水样品必须保存于低温(4°C以下)及暗处，并在7d内完成所有样品萃取，萃取 后40d内完成分析等工作。所有玻璃仪器均先用铬酸洗液浸泡过夜，然后依次用自来水、蒸 馏水冲洗，烘干备用。1. 2海水中有机污染物物的提取海水中有机污染物的提取采用常规的液_液萃 取法(Liquid-Liquid extraction, LLE)禾口固才目萃取法(Solid phase extraction, SPE)。 固相萃取中采用非极性大孔网状树脂XAD-2来吸附非极性和弱极性的半挥发性有机污染 物。1. 3水样提取物的浓缩将步骤1. 2中萃取和吸附洗脱得到的组分，分别经无水 Na2SO4干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗，洗脱液用氮气吹干，最后用ImL DMSO溶解，得到有机物 浓缩液，备用。2)浮游植物细胞收集和浓缩在进行前期预实验的基础上，筛选出米氏凯伦藻 (Kareniamikimotoi)作为受试材料，米氏凯伦藻由国家海洋局第一海洋研究所生态中心藻 类种质库提供。由于米氏凯伦藻属于裸甲藻目，细胞无细胞壁，为避免过多的离心次数对藻 细胞的破坏，本方法用用5uM的筛绢通过自然沉降法来浓缩和富集细胞；收集完之后用过 滤消毒后的无菌大洋水将细胞洗下来，用0. 3%台盼蓝染色检验细胞活性，80%以上的细胞 为活细胞方可进行后续实验，同时进行显微镜计数，调整细胞密度在1 X 105cellS/mL左右， 3)细胞染毒处理将步骤2)中的细胞与步骤1)的有机物浓缩液在20°C条件下进 行染毒处理lh，染毒体系总体积为5mL ；染毒体系中有机物浓度分别设为原海水中有机污 染物浓度的1倍，5倍，10倍，100倍4个浓度梯度。浓度梯度的配置是把浓缩的有机物浓缩 液按比例加入染毒体系中，例如，5倍的实验组浓度梯度就是5mL的染毒体系中包含5uL的 有机物浓缩液。
将未染毒的细胞作为对照组；染毒结束后，以2000转/分钟的速度离心去除 上清得到藻细胞，将实验组和对照组的藻细胞重新用无菌大洋水悬浮，调整细胞浓度在 lX105cells/mL 左右，备用；4)制备第一层胶在80°C条件下，将0.8%的正常熔点的琼脂糖凝胶NMA(100mL PH = 7. 4的磷酸缓冲液加入0. 8g正常熔点的琼脂糖，加热使之溶解)从磨砂载玻片的一端 垂直流下，铺满整个载玻片。将铺过胶的载片在80°C下烤干，晾凉，备用；5)制备第二层胶将配好的0. 6%低熔点琼脂糖凝胶LMA(用无菌大洋水配制， IOOmL无菌大洋水中加入0. 6g低熔点的琼脂糖，加热使之溶解)冷却至37°C并保持在该温 度。取步骤3中处理后各实验组和对照组中的细胞25uL与75uL低熔点的琼脂糖凝胶混勻， 取60uL该混合液加到铺有第一层胶的载玻片上，盖上盖玻片，4°C黑暗下固化10-30min;6)细胞裂解移去第二层胶上的盖玻片，将铺有第一层胶和第二层胶(其中混有 细胞)的载玻片完全浸入4°C预冷的新鲜配制的裂解液中，4°C黑暗下裂解2h ；7) DNA解旋将裂解结束后的载玻片用PBS溶液轻轻漂洗3次后，置于水平电泳槽 的正极端，倒入新鲜配制的电泳液，使电泳液没过载玻片约2-3mm，室温下避光解旋30min ；8)细胞电泳将解旋后的细胞，在电压25V，电流300mA的条件下，电泳20-30min ；9)中和电泳结束后将含有细胞的载玻片取出，置于0. 4mmol/L的Tris-HCl (pH =7. 4)缓冲液中中和漂洗3次，每次5分钟；载玻片保存如果不能对细胞立即染色观察，可将步骤9中漂洗过的载玻片放入 30%,50%,70%,90%,100%的梯度乙醇中室温黑暗脱水，自然晾干，黑暗保存可达一个月 之久，等需要观察时再染色；11)染色向混有细胞的第二层胶上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min。12)显微照相、图像分析和数据处理染色结束后，用PBS溶液洗去第二层胶上多 余的染料，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照；图片分析处理采用CASP软件，主要考察 参数为彗星尾距(TM)和Olive尾距(OTM)和尾长(TL)，每张载玻片分析50-100个细胞； 数据分析采用SPSS13. 0软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行t_检验，以P < 0. 05 作为显著性依据。如图4所示，实验组中有机物浓度分别为原海水有机物浓度的1倍，5倍，10倍， 100倍，对照组就是无菌大洋水，结果实验组的DNA尾距随着有机物浓度的升高而变长，表 明检测的海水样品中存在有潜在的有机物污染。DNA损伤的Olive尾矩(图2)和DNA损伤 的尾长(图3)的t-检验分析也证明检测的海水存在潜在的有机物污染。实施例中所用的试剂及配方1、pH7. 4磷酸缓冲生理盐水(PBS)溶液称取NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 3. 49g, KH2PO4 0. 2g，溶于 800mL 蒸馏水 中，调pH = 7. 4，定容至IOOOmL02、无菌大洋水取经过充分沉淀的大洋海水，用0.45um的醋酸混合纤维素滤膜过滤，于120°C高 温灭菌20min，冷却，备用。3、正常熔点的琼脂糖凝胶(NMA)称取正常熔点的琼脂糖粉0. 8g，微波加热溶于IOOmL的PBS溶液中，水浴60°C保温，现用现配。4、低熔点的琼脂糖凝胶(LMA)称取低熔点的琼脂糖粉0. 6g，与IOOmL无菌大洋水混合，微波加热溶解，水浴冷却 至37°C保温，现用现配。5、碱性细胞裂解液NaCl 146. lg, Na2EDTA 37. 2g, Tris-base 1. 2g，肌氨酸钠 10g，用 NaOH 调 pH = 10. 0，用去离子水定容至890mL，过滤除菌，室温保存。临用前，加入IOOmL DMSO和IOmL TritonX-100,混勻，放入4°C冰箱预冷，备用。6、解旋液及电泳液ION NaOH 溶液 30mL，200mM 的 EDTA 溶液 5mL，定容至 IOOOmL,混勻，备用。7,0. 4M Tris-HCl 中和液(pH = 7. 5)称取48. 5g Tris-base，溶于800mL蒸馏水中，用浓度大于IOM的HCl溶液调pH = 7. 5，过滤除菌，室温保存。8、50ug/L的碘化丙啶染液。
权利要求
一种海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法，其特征在于包括以下的步骤1)海水中有机污染物的提取与浓缩将海水样品用液 液萃取法和固相萃取法提取海水中的有机污染物，并经无水Na2SO4干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得到洗脱液，将洗脱液用氮气吹干，最后用二甲亚砜溶解，得到有机物浓缩液备用；2)米氏凯伦藻的细胞收集和浓缩；选取处于指数生长期的米氏凯伦藻，用5μM的筛绢通过自然沉降法来浓缩和富集；收集完之后用过滤消毒的无菌大洋水将米氏凯伦藻细胞洗下来，调整米氏凯伦藻细胞密度在1×105cells/mL左右，备用；3)细胞染毒处理将步骤2)中获得的细胞与步骤1)的有机物浓缩液在20℃条件下进行染毒处理1h，染毒体系总体积为5mL；染毒体系中有机物浓度分别设为原海水中有机污染物浓度的1倍，5倍，10倍，100倍4个浓度梯度，将未染毒的米氏凯伦藻细胞作为对照组；染毒结束后，以2000转/分钟的速度离心去除上清得到米氏凯伦藻细胞，将实验组和对照组的米氏凯伦藻细胞重新用无菌大洋水悬浮，调整米氏凯伦藻细胞浓度在1×105cells/mL左右，备用；4)制备第一层胶配制0.8％的正常熔点的琼脂糖凝胶NMA，在80℃条件下，从磨砂载玻片的一端垂直流下，铺满整个载玻片，再将铺过胶的载片在80℃烤干，晾凉，备用；5)制备第二层胶将配好的0.6％低熔点琼脂糖凝胶LMA，于水浴37℃保温，取步骤3)中处理后的各实验组和对照组中的米氏凯伦藻细胞25uL，与75uL低熔点的琼脂糖凝胶LMA混匀后，取60uL加到铺有第一层胶的载玻片上，盖上盖玻片，4℃黑暗下固化10 30min；6)细胞裂解移去第二层胶上的盖玻片，将铺有第一层胶和第二层胶的载玻片完全浸入4℃预冷的新鲜配制的裂解液中，4℃黑暗下裂解2h；7)DNA解旋将裂解结束后的载玻片用磷酸缓冲液溶液轻轻漂洗3次后，置于水平电泳槽的正极端，倒入新鲜配制的电泳液，使电泳液没过载玻片约2 3mm，室温下避光解旋30min；8)细胞电泳DNA解旋结束后，在电压25V，电流300mA的条件下，电泳20 30min；9)中和电泳结束后将载玻片置于0.4mmol/L、pH＝7.4的Tris HCl缓冲液中，中和漂洗3次，每次5分钟；10)染色向第二层胶上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min；11)显微照相、图像分析和数据处理染色结束后用PBS溶液洗去多余的染料，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照；图片分析处理采用CASP软件，主要考察参数为彗星尾距、0live尾距和尾长，每张载玻片分析50 100个细胞；数据分析采用SPSS13.0软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行t 检验，P＜0.05作为海水有机污染物潜在遗传毒性大小的显著性依据。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于上述的固相萃取法是采用非极性大孔网 状树脂XAD — 2来吸附非极性和弱极性的半挥发性有机污染物。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于上述步骤6)中的裂解液组分如下NaCl 146. lg，Na2EDTA 37. 2g，Tris-base 1. 2g，肌氨酸钠 10g，调 pH 至 10. 0，用去离子水定容至890mL，过滤除菌，室温保存；临用前，加入IOOmL DMSO和IOmL Triton X-IOO0
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于上述步骤7)的电泳液制备方法如下取 ION NaOH溶液30mL，200mM的EDTA溶液5mL，用去离子水定容至1000mL。
全文摘要
本发明涉及一种海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法，具体是利用一种海洋浮游植物米氏凯伦藻与单细胞凝胶电泳技术，来检测海水中的有机污染物。本发明将海洋浮游植物米氏凯伦藻作为海水中有机污染物遗传毒性检测的生物材料，米氏凯伦藻无细胞壁，具有一个大而明显的细胞核，对水体中理化因素的变化极其敏感，是在群体水平上进行海水中有机污染物潜在遗传毒性研究与评价的良好生物材料。本发明的方法既可以将海水中有机污染物提取出来检测其遗传毒性，也可以直接用于排污口、养殖区等污染严重的海区海水总遗传毒性的检测。检测海水总遗传毒性时只需将海水过滤除去泥沙和杂质即可用进行后续的检测。
文档编号G01N27/447GK101975814SQ20101050318
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者庞敏, 王宗灵, 王菊英, 穆景利, 闫启仑, 高春蕾 申请人:国家海洋局第一海洋研究所