专利名称：一种检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测技术领域，涉及动物源食品中残留抗生素的检测方法， 特别是涉及一种检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法。
背景技术：
牛奶、肉制品等动物源食品普遍含有蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类、盐类、钙、磷、铁 等丰富的营养物质，随着人民生活水平的不断提高，其在居民的膳食结构中所占比重也越 来越大。阿莫西林因其具有其廉价、剂型多、抗菌谱广、疗效高、疗程短等优点，广泛应用于 畜牧业生产中，用于预防和治疗畜禽疫病。阿莫西林的大量使用导致其在多数动物源食品 中均有残留，人们食用阿莫西林残留量超标的动物源食品后，会对人体健康造成危害。最 常见的如阿莫西林引起的过敏反应。还有就是药物的耐药性，由于动物生长过程中长期 大量使用阿莫西林，使得动物体内的细菌产生了耐药性，细菌对阿莫西林产生耐药性后往 往对人使用的同种或同类抗生素也产生耐药性，致使阿莫西林无法控制人体细菌感染性 疾病，其后果不堪设想。为了避免消费者受到阿莫西林残留的危害，各国都有相应法规规 定最高残留量的标准。在美国，规定牛的可食用组织中阿莫西林残留限量值为0.01mg/L; 欧盟规定牛奶中阿莫西林的残留限量为0. 004mg/L ；日本规定鸡蛋中阿莫西林残留限量为 0. 01mg/L。我国农业部2001年颁布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，对新鲜牛乳的 卫生指标明确了 “抗生素不得检出”。现有技术中，已应用于阿莫西林残留检测的技术主要有微生物检测法如TTC法， 免疫分析法如ELISA检测法、荧光免疫测定法，色谱检测法如HPLC、GC法等。上述方法在检 测精密度等方面各有所长，有的灵敏度低、选择性差；有的操作过程步骤较为繁琐，有的需 购置昂贵仪器，但大都存在检测耗时长、成本高的缺点，在具体实际应用中造成不便。本发 明人在已公开的专利201010109375. 3中阐述了类似检测方法，但也还存在检测灵敏度低、 荧光检测稳定性不够理想等缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、检测结果准 确、灵敏度高、稳定性强的检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。—种检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法，包括以下步骤(1)荷移体系的形成配制阿莫西林浓度0. 01 80mg/L的标准水溶液，加入浓度 0. 1 2%的非离子表面活性剂，用pH缓冲液调节体系至pH3 9，再与浓度为0. 1 lg/L 的醌类或茜素类物质在常温下反应5 40min，得到荷移体系，备用；(2)测定波长的确定将步骤(1)得到的荷移体系在荧光分光光度计下确定其荧 光的激发光谱和发射光谱，或者在紫外分光光度计下确定其最大紫外可见吸收波长；其中荧光的激发发射波长的扫描范围为220 650nm，紫外可见的扫描范围为200 600nm ；(3)确定上述荷移体系荧光强度或者紫外吸收强度与阿莫西林的线性范围、工作 曲线，同时计算方法的标准偏差、检测限及样品的回收率；(4)样品前处理I、牛奶取5.0 25. Og牛奶，加入10 30mL三氯乙酸、无水乙醇或是浓度为 5% 10% V/V的高氯酸、或是pH2.0 4. 4的酸化乙腈中的一种，混勻，在转速3000 10000r/min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；II、肉样取5.0 25. Og剁碎的肉样，加入10 30mL三氯乙酸、无水乙醇、乙腈 或是浓度为5% 10% V/V的高氯酸、或是浓度为0. 05 0. 5mol/L的盐酸中的一种，超声 5 15min后，在3000 10000r/min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；(5)样品测定取步骤(4)所得上清液，按照步骤(1)所述的条件进行荷移反应， 得到样品的荷移体系，在步骤( 所确定的荧光激发发射光谱或者紫外最大吸收波长下， 测定样品荷移体系的荧光强度或者紫外吸光度，再对照步骤(3)所得的荷移体系工作曲 线，计算出样品中的阿莫西林残留量。步骤(1)中，所述的非离子表面活性剂为曲拉通-110、吐温-20、吐温-80、司 盘-20、司盘-40、司盘-60或司盘-80中的一种，所选用的醌类物质为四氯苯醌、四氰基对 二次甲基苯醌、2，3_ 二氯_5，6 二氰苯醌、氯醌酸、对苯醌、萘醌或1，4_ 二羟基蒽醌中的一 种，茜素类物质为茜素绿或茜素红中的一种。同现有技术相比，本发明具有以下优点或者积极效果1、由于阿莫西林本身具有较弱荧光和紫外吸收，直接测定灵敏度非常低。本发明 首先利用阿莫西林与醌类试剂发生荷移反应，使得荧光强度或者紫外吸收增强，再通过非 离子表面活性剂的增敏作用，进一步提高荧光强度或者紫外吸收值，从而实现了对阿莫西 林的高灵敏度检测，满足低残留量时的检测要求，同时显著提高了体系稳定性，弥补了在先 申请荧光检测稳定性差的不足，在实际检测应用中更具可行性。2、检测速度快，检测范围宽，准确率高，选择性好，全部操作过程可在50min内完 成；3、无需购置昂贵的抗生素检测仪器，只需配备离心机与紫外或荧光分光光度计即 可完成检测；4、操作方法简单，对操作人员无特殊技术要求。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的保护范围并不限于 此。实施例11、制备浓度为80mg/L的阿莫西林标准水溶液500mL，使用时逐级稀释。2、取浓度5 μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入2% 的吐温-20水溶液ImL, pH6缓冲液ImL和0. 5g/L的2，3- 二氯-5,6 二氰苯醌2mL,用水定 容到刻度，摇勻后在室温下放置15min，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在220 650nm波长范围内扫描，在最大激发波长338nm，最大发射波长418nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00、10. 00,20. 00,50. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 ImL, 先后加入2%的吐温-20水溶液lmL，pH6缓冲液ImL和0. 5g/L的2，3- 二氯-5，6 二氰苯 醌2mL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置15min，得到不同浓度标准品荷移络合物。将 荷移络合物在激发波长338nm，发射波长418nm下测定不同浓度标准品荷移络合物对应荧 光强度F，对其线性回归，线性回归方程为F = 5. 235C+45. 23，线性范围0. 01 50 μ g/mL, 相关系数r = 0. 9985，检测限0. 003 μ g/mL。5、加标回收率实验取15. Og无抗牛奶置于烧杯中，加入10 μ g/mL的阿莫西林标 准液5mL，用无水乙醇定容至25mL，充分振动后于5000r/min下离心7min，取上清液2mL先 后加入2%的吐温-20水溶液lmL，pH6缓冲液ImL和0. 5g/L的2，3- 二氯_5，6 二氰苯醌 2mL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置15min，得到样品荷移络合物。将荷移络合物在 激发波长338nm，发射波长418nm下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出阿莫西林 含量。同时按上述分析步骤对同一样品测定5次，计算出牛奶样品平均回收率(n = 5)为 93. 2%,相对标准偏差为2.3%。6、取15. Og含阿莫西林残留的牛奶置于25mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25mL， 充分振动后于5000r/min下离心7min，取上清液2mL先后加入2%的吐温-20水溶液lmL， pH6缓冲液ImL和0. 5g/L的2，3- 二氯-5，6 二氰苯醌2mL，用水定容到刻度，摇勻后在室温 下放置15min，得到样品荷移络合物。将荷移络合物在激发波长338nm，发射波长418nm下 测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出牛奶样品阿莫西林含量为0. 08 μ g/mL。该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。另附不添加非离子表面活性剂的对照试验试验过程同实施例1，仅在过程中不加入吐温-20，其检测结果为阿莫西林含量 不能检出。实施例21、制备浓度为50mg/L的阿莫西林标准水溶液IOOmL,使用时逐级稀释。2、取浓度10 μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入
的曲拉通-110水溶液lmL，pH7缓冲液2mL和lg/L的四氰基对二次甲基苯醌lmL，用水定 容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在220 650nm波长范围内扫描，在最大激发波长 310nm，最大发射波长430nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00,20. 00,40. 00,80. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 ImL, 先后加入的曲拉通-110水溶液lmL，pH7缓冲液2mL和lg/L的四氰基对二次甲基苯醌 lmL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到不同浓度标准品荷移络合物。将荷 移络合物在激发波长310nm，发射波长430nm下测定不同浓度标准品荷移络合物对应荧光 强度F，对其线性回归，线性回归方程为F = 8. 435C+35. 46，线性范围0. 01 80μ g/mL，相 关系数 r = 0. 9992，检测限 0. 005 μ g/mL。5、取15. Og含阿莫西林残留的牛奶置于25mL容量瓶中，用pH2. 5的酸性乙腈定容 至25mL，充分振动后于8000r/min下离心5min，取上清液2mL先后加入的曲拉通-110 水溶液lmL，pH7缓冲液2mL和lg/L的四氰基对二次甲基苯醌lmL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到样品荷移络合物。将荷移络合物在激发波长310nm，发射波长 430nm下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出牛奶样品阿莫西林含量为0. 3μ g/mL。该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。实施例31、制备浓度为20mg/L的阿莫西林标准水溶液IOOmL,使用时逐级稀释。2、取1. 0 μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入0. 5% 的吐温-80水溶液lmL，pH8缓冲液2mL和0. 8g/L的四氯苯醌2mL，用水定容到刻度，摇勻 后在室温下放置lOmin，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在220 650nm波长范围内扫描，在最大激发波长 335nm，最大发射波长460nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00、10. 00,20. 00,40. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 lmL， 先后加入0. 5%的吐温-80水溶液lmL，pH8缓冲液2mL和0. 8g/L的四氯苯醌2mL，用水定 容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到不同浓度标准品荷移络合物。将荷移络合物在 激发波长335nm，发射波长460nm下测定不同浓度标准品荷移络合物对应荧光强度F，对其 线性回归，线性回归方程为F = 13. 786C+78. 35，线性范围0. 01 40 μ g/mL，相关系数r = 0. 9991，检测限 0. 01 μ g/mL。5、取IOg含阿莫西林残留的剁碎的牛肉，用0. 2mol/L盐酸10ml，超声lOmin， 70000r/min离心8min，取上清液2mL先后加入0.5%的吐温-80水溶液lmL，pH8缓冲液2mL 和0. 8g/L的四氯苯醌2mL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到样品荷移络 合物。将荷移络合物在激发波长335nm，发射波长460nm下测定荧光强度F，代入步骤4回 归方程计算出牛肉样品阿莫西林含量为0. 6 μ g/mL。该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。实施例41、制备浓度为10mg/L的阿莫西林标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取15. O μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入0. 2% 的司盘-60水溶液lmL，pH5缓冲液2mL和0. 3g/L的对苯醌2mL，用水定容到刻度，摇勻后 在室温下放置lOmin，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在220 650nm波长范围内扫描，在最大激发波长 336nm，最大发射波长410nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00,20. 00,40. 00,60. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 ImL, 先后加入0. 2%的司盘-60水溶液lmL，pH5缓冲液2mL和0. 3g/L的对苯醌2mL，用水定容 到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到不同浓度标准品荷移络合物。将荷移络合物在 激发波长336nm，发射波长410nm下测定不同浓度标准品荷移络合物对应荧光强度F，对其 线性回归，线性回归方程为F = 5. 415C+56. 43，线性范围0. 01 60 μ g/mL，相关系数r = 0. 9987，检测限 0. 005 μ g/mL。5、取5. Og含阿莫西林残留的剁碎的鱼脊背肉，用5%高氯酸10mL，超声lOmin， 90000r/min离心6min，取上清液2mL先后加入0. 2%的司盘-60水溶液lmL，pH5缓冲液2mL 和0. 3g/L的对苯醌2mL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到样品荷移络合 物。将荷移络合物在激发波长336nm，发射波长410nm下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出鱼脊背肉样品阿莫西林含量为0. 04μ g/mL。该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。实施例51、制备浓度为5mg/L的阿莫西林标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取10. 0 μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入0. 8% 的司盘-80水溶液lmL，pH4缓冲液ImL和0. 4g/L的茜素红lmL，用水定容到刻度，摇勻后 在室温下放置20min，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在200 600nm波长范围内扫描，在最大吸收波长5IOnm 波长下测定荷移反应产物的可见吸收度，同时做空白试验。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00,20. 00,40. 00,70. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 lmL， 先后加入0. 8%的司盘-80水溶液lmL，pH4缓冲液ImL和0. 4g/L的茜素红lmL，用水定容 到刻度，摇勻后在室温下放置20min，得到不同浓度标准品荷移络合物。将荷移络合物在最 大吸收波长510nm波长下测定不同浓度标准品荷移络合物对应吸光度A，对其线性回归，线 性回归方程为A=L 473C+0. 267，线性范围0. 01 70 μ g/mL，相关系数r = 0. 9987，检测 限 0.005 μ g/mL。5、取10. Og含阿莫西林残留的剁碎的猪肉，用三氯乙酸15mL，超声lOmin，80000r/ min离心8min，取上清液2mL先后加入0. 8 %的司盘-80水溶液lmL，pH4缓冲液ImL和0. 4g/ L的茜素红lmL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置20min，得到样品荷移络合物。将荷 移络合物在最大吸收波长510nm波长下测定不同浓度标准品荷移络合物对应吸光度A，代 入步骤4回归方程计算出猪肉样品阿莫西林含量为0. 7 μ g/mL。该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。实施例61、制备浓度为10mg/L的阿莫西林标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取20. O μ g/mL的阿莫西林标准水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入 的司盘-20水溶液lmL，pH 3缓冲液ImL和0. 2g/L的1，4_ 二羟基蒽醌lmL，用水定容到刻 度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到荷移络合物。3、将上述荷移络合物溶液在200 600nm波长范围内扫描，在最大吸收波长397nm 波长下测定荷移反应产物的紫外吸收度，同时做空白试验。4、取浓度 0. 01、1. 00,5. 00,20. 00,40. 00,60. 00 μ g/mL 的阿莫西林标准液各 ImL, 先后加入的司盘-20水溶液lmL, pH3缓冲液ImL和0. 2g/L的1,4- 二羟基蒽醌ImL, 用水定容到刻度，摇勻后在室温下放置lOmin，得到不同浓度标准品荷移络合物。将荷移 络合物在最大吸收波长397nm波长下测定不同浓度标准品荷移络合物对应吸光度A，对其 线性回归，线性回归方程为A=L 834C+0. 345，线性范围0. 01 60 μ g/mL,相关系数r = 0. 9987，检测限 0. 005 μ g/mL。5、取15. Og含阿莫西林残留的牛奶置于25mL容量瓶中，用三氯乙酸定容至25mL， 充分振动后于3000r/min下离心20min，取上清液2mL先后加入1 %的司盘_20水溶液lmL， PH3缓冲液ImL和0. 2g/L的1，4_ 二羟基蒽醌lmL，用水定容到刻度，摇勻后在室温下放 置lOmin，得到样品荷移络合物。将荷移络合物在最大吸收波长397nm波长下测定不同浓 度标准品荷移络合物对应吸光度A，代入步骤4回归方程计算出牛奶样品阿莫西林含量为1. 3 μ g/mL0 该法检测结果与用NY/T 830-2004检测结果一致。
权利要求
1. 一种检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法，包括以下步骤(1)荷移体系的形成配制阿莫西林浓度0.01 80mg/L的标准水溶液，加入浓度 0. 1 2%的非离子表面活性剂，用PH缓冲液调节体系至pH3 9，再与浓度为0. 1 lg/L 的醌类或茜素类物质在常温下反应5 40min，得到荷移体系，备用；(2)测定波长的确定将步骤(1)得到的荷移体系在荧光分光光度计下确定其荧光的 激发光谱和发射光谱，或者在紫外分光光度计下确定其最大紫外可见吸收波长；其中荧光 的激发发射波长的扫描范围为220 650nm，紫外可见的扫描范围为200 600nm ；(3)确定上述荷移体系荧光强度或者紫外吸收强度与阿莫西林的线性范围、工作曲线， 同时计算方法的标准偏差、检测限及样品的回收率；(4)样品前处理1、牛奶取5.0 25. Og牛奶，加入10 30mL三氯乙酸、无水乙醇或是浓度为5% 10% V/V的高氯酸、或是pH2. 0 4. 4的酸化乙腈中的一种，混勻，在转速3000 IOOOOr/ min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；II、肉样取5. 0 25. Og剁碎的肉样，加入10 30mL三氯乙酸、无水乙醇、乙腈或是 浓度为5% 10% V/V的高氯酸、或是浓度为0. 05 0. 5mol/L的盐酸中的一种，超声5 15min后，在3000 10000r/min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；(5)样品测定取步骤(4)所得上清液，按照步骤(1)所述的条件进行荷移反应，得到 样品的荷移体系，在步骤( 所确定的荧光激发发射光谱或者紫外最大吸收波长下，测定 样品荷移体系的荧光强度或者紫外吸光度，再对照步骤(3)所得的荷移体系工作曲线，计 算出样品中的阿莫西林残留量。
2.根据权利要求1所述的检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法，其特征在于 步骤(1)中，所述的非离子表面活性剂为曲拉通-110、吐温-20、吐温-80、司盘-20、司 盘-40、司盘-60或司盘-80中的一种，所述的醌类物质为四氯苯醌、四氰基对二次甲基苯 醌、2，3_ 二氯_5，6 二氰苯醌、氯醌酸、对苯醌、萘醌或1，4_ 二羟基蒽醌中的一种，所述的茜 素类物质为茜素绿或茜素红中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种检测牛奶及肉制品中阿莫西林残留量的方法。配制阿莫西林标准水溶液，加入非离子表面活性剂，在与醌类或茜素类物质反应后得到荷移体系。确定荧光或紫外的扫描波长，进而计算标准溶液的线性范围、工作曲线等参数。对待测样品进行相应荷移反应后，在紫外或荧光条件下测定其反应数值，经计算即可得到其阿莫西林残留量。该技术通过非离子表面活性剂的增敏作用，进一步提高荧光强度或者紫外吸收值，满足低残留量时的检测要求，同时显著提高了体系稳定性，弥补了在先申请荧光检测稳定性差的不足，在实际检测应用中更具可行性。
文档编号G01N21/25GK102072892SQ201010533069
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者徐兴志, 杨亚玲, 耿卫东 申请人:云南健牛生物科技有限公司