专利名称：一种乳中尿素定性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种乳中尿素定性检测方法，尤其涉及一种高灵敏度、快速检测乳中尿素掺假的方法。
背景技术：
牛乳中蛋白质含量丰富且易被人体吸收，生理利用率可达85%，营养价值极高。随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，人们对食品的营养价值提出了更高的要求，牛乳恰恰是一种营养价值丰富的食品，因此越来越多的人开始消费乳及乳制品。目前检测牛乳中蛋白质含量的凯氏定氮仪，是通过测定样品中氮的含量计算出蛋白质含量，尿素的含氮量为46. 6%，凯氏定氮仪会将尿素当做蛋白质来计算，所以，某些不法商贩为牟取暴利，对原料乳及成品纯牛奶进行尿素掺假。
因此，迫切需要能够简便、快速检测原料乳及成品纯牛奶中尿素掺假的方法。目前检测尿素掺假常用二乙酰一肟法，但是二乙酰一肟并非只与尿素反应时显色，与瓜氨酸反应也有显色。一些人使用酶解法与纳氏试剂作用进行鉴定，但是该法需要购制分光光度计，且检测时间长(王武生，时振强等，《酶解法检测牛奶中的尿素》，食品科学， 1993 (4):50-52。)。另外有人采用酶解法与苯酚红进行检测，苯酚红显色的pH值范围是 6. 8 (黄)-8. 2 (红)，牛奶本身pH值是6. 4-6. 8，且该方法使用PBS缓冲液进行配制，不利于显色，另外试纸条的保藏性和酶的固定也有一定困难(徐黎，叶兴乾等，《原料乳及成品纯牛奶中尿素掺假快速检测方法的研究》，中国乳品工业，2004 (4):34-35。)。中国专利申请 CN 101398386A中还公开了采用试纸的检测方法，该方法试纸制作过程复杂，且尿素酶使用人工方法从植物中提取，难以保证配制的尿素酶浓度稳定，导致实际操作中，各试纸条的显色时间不同，影响测试精度；同时，牛乳中的蛋白和脂肪会影响试纸的测试灵敏度，延缓显色时间并提高检出限。发明内容
本发明的目的是提供一种乳中尿素定性检测方法，保证测试中显色反应时间的稳定，同时提高尿素含量测试的灵敏度。
本发明提供了一种乳中尿素定性检测方法，包括a.配制浓度为20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到质量含量为0.5%溴百里香酚蓝乙醇溶液；b.使用奶粉和纯水配制复原乳，其中奶粉和纯水的质量比为1:7，使用现有的方法准确测量复原乳的尿素含量，以确保复原乳中尿素含量在正常范围内；c.配制尿素溶液，向复原乳中添加尿素溶液，使得复原乳中尿素浓度增加0.2g/L，得到阳性对照乳；d.各取ImL待测乳和阳性对照乳，离心处理待测乳和阳性对照乳后，分别取经过离心处理的待测乳和阳性对照乳的上层清液，两者中均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚蓝乙醇溶液，涡旋混勻分别得到待测乳清液和阳性对照乳清液；e.将待测乳清液和阳性对照乳清液静止lmin，并按照如下方法定性判断待测乳清液中的尿素含量；ea.若待测乳清的颜色比阳性对照乳清液的颜色浅，则待测乳中的尿素含量小于阳性对照乳中的尿素含量；eb.若待测乳清的颜色比阳性对照乳清液的颜色深或颜色一致，则待测乳中的尿素含量大于或等于阳性对照乳中的尿素含量。
在一种乳中尿素定性检测方法的再一种示意性的实施方式中，步骤c中离心处理的条件为lOOOOrpm，持续20min。
在一种乳中尿素定性检测方法的另一种示意性的实施方式中，步骤d中所述涡旋混勻的时间为k。
使用一种乳中尿素定性检测方法，不需要制作试纸等复杂工艺，所用的尿素酶不需要从植物种子提取，从厂家直接购买高纯度的尿素酶产品，稀释使用，成本低，性能稳定， 只需要配置简单试剂，检测时间稳定且用时短，用肉眼判断即可。
使用一种乳中尿素定性检测方法，通过离心处理待测乳得到乳清的方式，避免了待测乳中蛋白质和脂肪(尤其是使用涂有尿素酶的试纸条)对尿素酶催化作用的阻碍，提高了测试的灵敏度，降低了尿素的检出限。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。
一种乳中尿素定性检测方法，包括如下所述的步骤。
a.配制浓度为20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到质量含量为0. 5%溴百里香酚蓝乙醇溶液。例如在一种示意性实施方式中，称取20mg尿素酶，加入Iml三级水，制成20mg/ml尿素酶溶液；称取0. 5g溴百里香酚蓝，加入IOOml乙醇，制成质量含量约为0. 5%溴百里香酚蓝乙醇溶液。
b.使用奶粉和纯水配制复原乳，其中所述奶粉和所述纯水的质量比为1:7，使用现有的方法准确测量复原乳的尿素含量，以确保所述复原乳中尿素含量在正常范围内。例如在一种示意性实施方式中，称取Ig奶粉加入7ml三级水，涡旋混勻，制成复原乳，用酶解法检测其中的尿素含量为0. 25g/L。本领域技术人员可以理解，正常的牛乳中也含有尿素，尿素的含量一般在0. 21 0. ;34g/L 的范围内(J. S. jonker, R. A. Kohn, R. A. Erdman, Using mile urea nitrogen to predict nitrogen excretion and utilization efficiency in lactating dairy cows, Journal of Dairy Science, 1998，81(10) :2682-2692)。
c.配制尿素溶液，向复原乳中添加制得的尿素溶液，使得复原乳中的尿素浓度增加0.2g/L，得到阳性对照乳。例如在一种示意性实施方式中，称取0. Ig尿素，加入IOml三级水，制成10g/L尿素溶液；吸取980uL复原乳，加入20uL的10g/L尿素溶液，混勻，使得复原乳中尿素浓度增加0. 2g/L，即得到尿素含量为0. 45g/L阳性对照乳。当然也可以配制其他浓度的尿素溶液，只要改变加入尿素溶液的量，保证复原乳中尿素的浓度增加0. 2g/L即可。
d.各取ImL待测乳和阳性对照乳，离心处理后分别取上层清液，均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚蓝乙醇溶液，涡旋混勻后分别得到待测乳清液和阳性对照乳清液。例如在一种示意性实施方式中，各量取Iml待测乳和阳性对照乳，以IOOOOrpm高速离心 20min;分别取离心后的上清液，然后均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚蓝溶液，涡旋k混勻，得到待测乳清液和阳性对照乳清液。
e.将待测乳清液和阳性对照乳清液静止lmin，并按照如下方法定性判断待测乳清液中的尿素含量。
ea.若待测乳清的颜色比阳性对照乳清液的颜色浅，则说明待测乳中的尿素含量小于阳性对照乳中的尿素含量。例如在一种示意性实施方式中，阳性对照乳清液为蓝色，待测乳清为黄绿色，说明待测乳中的尿素含量小于阳性对照乳中0. 45g/L的尿素含量。
eb.若待测乳清的颜色比阳性对照乳清液的颜色深或颜色一致，则说明待测乳中的尿素含量大于或等于阳性对照乳中的尿素含量。例如在另一种示意性实施方式中， 阳性对照乳清液为蓝色，待测乳清为深蓝色，说明待测乳中的尿素含量大于阳性对照乳中 0. 45g/L的尿素含量，此时可以认为待测乳中存在着非正常来源的尿素，典型的情况通常是尿素掺假。
本领域技术人员可以理解，若有水存在，尿素在尿素酶的特异催化作用下，分解释放出二氧化碳和氨气，由于氨气的作用使得待测乳的PH值由酸变碱(正常的乳液pH值范围在6. 3飞.8之间，低于6. 3则乳液已经酸败，而高于6. 8则是酸败后的乳液加碱矫正过)，从而和待测乳中预先加入的PH指示剂发生颜色变化。由于待测乳中存在大量的蛋白质和脂肪，它们的存在会阻碍尿毒酶的催化作用以及PH指示剂的显色反应，从而延缓了尿素与水的反应，使得PH指示剂的颜色变化变慢；同时乳中蛋白质和脂肪的阻碍会导致尿素测试灵敏度的降低，导致尿素的检出限变高。尤其当使用涂有或浸泡过尿素酶的试纸时，蛋白质和脂肪会附着在试纸的微孔隙中，阻碍尿素进入试纸的孔隙与尿素酶接触，从而严重的影响了尿素与水的反应。
通过对待测乳高速离心，可以分离其中大部分脂肪和蛋白质，使得待测乳中的尿素可以与后加入的尿素酶充分接触，加快尿素与水的反应，并保证反应充分进行，从而提高了尿素测量的灵敏度，降低了检出限。另外，通过向尿素含量在正常范围内的复原乳中添加尿素溶液，使得复原乳中的尿素含量增加到0. 4Γ0. Mg/L，且在尿素含量为0. 41 g/L就能出现PH指示剂的显色反应，并随着尿素含量的增加pH指示剂的显色加深，即检验灵敏度为 0.41 g/L，且检出限小于0. g/L。相比于背景技术中提及的其他测试方法，以上所述的检测方法检出限低，检测灵敏度高。
使用如上所述的检测方法，不需要制作试纸等复杂工艺，所用的尿素酶不需要从植物种子提取，从厂家直接购买高纯度的尿素酶产品，稀释使用，成本低，性能稳定，只需要配置简单试剂，检测时间短，用肉眼判断即可。
另外，通过离心处理待测乳得到乳清的方式，避免了待测乳中蛋白质和脂肪(尤其是使用涂有尿素酶的试纸条)对尿素酶催化作用的阻碍，提高了测试的灵敏度，降低了尿素的检出限，对乳品企业奶源质量和消费者饮用“放心奶”、“安全奶”均能起到有力的保证作用，有利于保证消费者的健康，保证消费者的合法权益及消费市场的有序竞争和良性发展， 保障人们物质生活质量。
在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何图示、实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种乳中尿素定性检测方法，包括a.配制浓度为20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到质量含量为0.5%的溴百里香酚蓝乙醇溶液；b.使用奶粉和纯水配制复原乳，其中所述奶粉和所述纯水的质量比为1:7，使用现有的方法准确测量所述复原乳的尿素含量，以确保所述复原乳中尿素含量在正常范围内；c.配制尿素溶液，向所述复原乳中添加所述尿素溶液，使得所述复原乳中尿素浓度增加0. 2g/L，得到阳性对照乳；d.各取ImL待测乳和所述阳性对照乳，离心处理所述待测乳和所述阳性对照乳后，分别取经过离心处理的所述待测乳和所述阳性对照乳的上层清液，两者中均加入40uL所述尿素酶溶液和20uL所述溴百里香酚蓝乙醇溶液，涡旋混勻分别得到待测乳清液和阳性对照乳清液；e.将所述待测乳清液和所述阳性对照乳清液静止lmin，并按照如下方法定性判断所述待测乳清液中的尿素含量；ea.若所述待测乳清的颜色比所述阳性对照乳清液的颜色浅，则所述待测乳中的尿素含量小于所述阳性对照乳中的尿素含量；eb.若所述待测乳清的颜色比所述阳性对照乳清液的颜色深或颜色一致，则所述待测乳中的尿素含量大于或等于所述阳性对照乳中的尿素含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中步骤c中所述离心处理的条件为IOOOOrpm，持续 20min。
3.如权利要求1所述的检测方法，其中步骤d中所述涡旋混勻的时间为^。
全文摘要
一种乳中尿素定性检测方法，包括配制尿素酶溶液和溴百里香酚蓝乙醇溶液；使用奶粉和纯水配制复原乳，确保复原乳中尿素含量在正常范围内；配制尿素溶液，向复原乳中添加尿素溶液，得到阳性对照乳；各取待测乳和阳性对照乳，离心处理待测乳和阳性对照乳后，得到上层清液，两者中均加入尿素酶溶液和溴百里香酚蓝乙醇溶液得到待测乳清液和阳性对照乳清液；按照如下方法定性判断待测乳清液中的尿素含量待测乳清的颜色比阳性对照乳清液的颜色浅，则待测乳中的尿素含量小于阳性对照乳中的尿素含量；颜色深或颜色一致，则待测乳中的尿素含量大于或等于阳性对照乳中的尿素含量。一种乳中尿素定性检测方法，成本低，性能稳定，检测时间稳定。
文档编号G01N21/78GK102539421SQ20101059741
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者刘志楠, 刘晓川, 喻东威, 李梅, 薛志清, 赵源 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司