使用藻类的评价化学物质的毒性的方法

专利名称：使用藻类的评价化学物质的毒性的方法
技术领域：
本发明涉及使用藻类的评价化学物质的毒性的方法。
背景技术：
在使用藻类的评价化学物质的毒性的情况下，必须以在液体培养和琼脂培养基等中维持的细胞为基础进行原代培养以及次代培养来调制藻类细胞，并且将被检测物质添加到调制好的藻类细胞中来进行试验。但是，维持藻类细胞的工作和每次试验时进行次代培养的工作繁杂而不便。为了解决这种繁杂，可以利用冷冻了的藻类细胞(非专利文献1以及2等)。通过在即将进行试验之前对已冷冻的藻类细胞实施解冻，并利用解冻的藻类细胞，从而能够不对藻类细胞进行次代培养而将藻类细胞迅速提供给试验。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开第2005/062027号非专利文献非专利文献1 桑野和可，2002年《藻类的冷冻保存》，堀辉三·大野正夫·堀口健雄编《21世纪初的藻学的现状》，日本藻类学会，山形，108-111页非专利文献2 森史等，《国立环境研究所微生物系统保存设施的蓝藻和绿藻的冷冻保存》，Microbiol. Cult. Coll.，2002 年 6 月，45-55 页

发明内容
发明所要解决的技术问题关于使用藻类的评价化学物质的毒性的方法，作为比日本经济协作开发机构 (OECD)试验指南TG201中规定的繁殖阻碍试验更加迅速而且更加简便的方法，本发明人等已开发了利用藻类的延迟发光的方法(专利文献1)。但是，本发明人发现如果在刚解冻了冷冻的细胞之后就测定其延迟发光，则发光模式与非冷冻细胞的延迟发光有所不同，且发光量也减少。因此，如果使用冷冻的藻类细胞，则存在不能够进行与使用没有冷冻的藻类细胞的情况相同等的毒性评价的问题。解决技术问题的手段本发明人为了解决上述技术问题而反复深入研究，发现在解冻藻类细胞之后，通过进行培养藻类细胞并使藻类细胞从冷冻的影响中恢复的恢复培养，从而能获得与没有冷冻的藻类细胞相同的发光模式，并且发光量也不降低，由此完成了本发明。S卩，本发明提供一种使用藻类的评价化学物质的毒性的方法，其特征在于具备(a)解冻步骤，对冷冻的藻类细胞加温并解冻，在所获得的细胞悬浊液中添加培养基进行稀释；
(b)恢复培养步骤，对由解冻步骤(a)所获得的藻类细胞进行培养，使藻类细胞从冷冻以及解冻的影响中恢复；(C)确认步骤，采集一部分恢复培养步骤(b)之后的藻类细胞，添加培养基进行稀释，测定藻类细胞的延迟发光并将所获得的发光量作为初期值数据；(d)暴露步骤，将确认步骤(C)之后的藻类细胞和含有被检测物质的溶液相混合来制作暴露试样，并培养暴露试样；(e)测量步骤，测定暴露步骤(d)之后的暴露试样的延迟发光，将所获得的发光量作为暴露数据；以及(f)评价步骤，根据初期值数据以及暴露数据计算出评价值，根据评价值评价被检测物质的毒性。在上述方法中，为了进行更加准确的评价，优选反复进行恢复培养步骤(b)以及确认步骤(c)，直至由确认步骤(c)所获得的初期值数据达到规定的值为止。另外，在上述方法中，为了进行更加准确的评价，优选在暴露步骤(d)中，还将确认步骤(C)之后的藻类细胞和被检测物质溶液的溶剂相混合来制作对照试样，并培养对照试样；在测量步骤(e)中，还测定对照试样的延迟发光作为对照数据；在评价步骤(f)中，根据初期值数据、暴露数据以及对照数据计算出评价值，根据评价值评价被检测物质的毒性。发明的效果根据本发明的使用藻类的评价化学物质的毒性的方法，能够使用冷冻的藻类细胞来迅速地进行毒性评价。


图1是表示冷冻·解冻的绿藻(比较例)以及没有冷冻的绿藻的颗粒数的图。图2是表示冷冻·解冻的绿藻(比较例)以及没有冷冻的绿藻的菌落存活率 (colony survival rate)的图。图3是表示冷冻 解冻的绿藻(比较例)以及没有冷冻的绿藻的延迟发光的发光模式的图。图4是表示冷冻 解冻的绿藻(比较例)以及没有冷冻的绿藻的发光量(累计值)的图。图5是表示冷冻 解冻的绿藻(实施例)以及没有冷冻的绿藻的延迟发光的发光模式的图。图6是表示冷冻 解冻的绿藻(实施例)以及没有冷冻的绿藻的发光量(累计值)的图。图7是对比较例所涉及的使用藻类的评价化学物质的毒性的方法进行说明的流程图。图8是对实施例所涉及的使用藻类的评价化学物质的毒性的方法进行说明的流程图。
具体实施例方式以下参照附图就用于实施本发明的方式进行详细的说明。
图8是对本实施方式所涉及的使用藻类的评价化学物质的毒性的方法进行说明的流程图。本实施方式具备解冻步骤(a)、恢复培养步骤(b)、确认步骤(C)、暴露步骤(d)、 测量步骤(e)以及评价步骤(f)。在解冻步骤(a)中，对冷冻的藻类细胞加温并解冻，将培养基加入到由解冻获得的细胞悬浊液中进行稀释。关于所使用的冷冻藻类细胞，可以使用由一般的藻类细胞的冷冻方法冷冻的藻类细胞。例如可以通过在37°C的水浴中慢慢摇动含有冷冻细胞的冷冻管(Cryo-tube) 120^150秒钟左右来进行解冻。接着，将培养基加入到解冻了的细胞悬浊液中进行稀释。在冷冻的细胞悬浊液中通常含有二甲亚砜(DMSO)等冻害保护剂，为了缓和冻害保护剂的细胞毒性有必要在解冻后迅速进行稀释。关于稀释，例如可以使用OECD培养基来稀释到10倍。为了防止渗透压发生急剧变化，花1分钟时间慢慢地添加培养基。在恢复培养步骤(b)中，对由解冻步骤(a)所获得的藻类细胞进行培养，并使藻类细胞从冷冻以及解冻的影响中恢复。如后面所述的比较例所示，如果不进行恢复培养步骤， 则藻类细胞就不能够从冷冻以及解冻的伤害中得到充分的恢复，与没有冷冻的藻类细胞相比较延迟发光的发光模式发生变化，且发光量降低。即使是冷冻 解冻的藻类细胞，如果不显示与没有冷冻的藻类细胞相同的发光模式 发光量，则不能够恰当评价化学物质的毒性。 如后面所述的实施例所示，如果在解冻步骤(a)中进行恢复培养步骤(b)，则使冷冻·解冻的藻类细胞显示与没有冷冻的藻类细胞相同的发光模式 发光量，能够解决这个问题。关于恢复培养，例如是在温度为25 士 0. 5°C以及照度为5(Γ55μπι01 · πΓ2 · s—1的条件下培养广2 小时。在确认步骤(C)中，采集一部分恢复培养步骤(b)后的藻类细胞，添加培养基进行稀释，测定藻类细胞的延迟发光，并将所获得的发光量作为初期值数据。在该步骤中，确认藻类细胞由恢复培养步骤(b)而从冷冻以及解冻的影响中得到充分的恢复，并且取得在后面的毒性评价的时候所使用的初期值数据。进一步用培养基稀释藻类细胞是为了缓和冻害保护剂的毒性。冻害保护剂通常是以5 10%左右包含于冷冻的细胞悬浊液中。在解冻步骤(a)中，如果进行10倍左右的稀释，则冻害保护剂的浓度成为0. 5 1%左右，但是发现恢复步骤即使在这个浓度的冻害保护剂存在下也是可能的。但是，为了不影响到化学物质毒性评价而有必要在培养后进一步进行10倍稀释从而降低冻害保护剂的浓度。关于延迟发光的测定，可以由公知的装置以及方法，例如可以由国际公开第 2005/062027号所记载的装置以及方法进行。在由确认步骤(C)测定的发光量为规定的值的情况下，可以将该数值作为初期值数据并进入到后面的暴露步骤(d)。关于作为该判断基准的规定的值，既可以利用预先设定的值，又可以利用针对冷冻细胞单独设定的值。例如，制造者可以在制造冷冻细胞的时候设定该值。所谓规定的值，是指例如没有冷冻的藻类细胞的发光量的90%以上的值。在这个值以下则可判断为发光量不够充分且藻类细胞恢复不够充分。在由确认步骤(C)测定的发光量没有达到规定的值的情况下，继续恢复培养步骤 (b)，在经过规定的时间(例如30分钟)之后再一次进行确认步骤并确认是否到达规定的值。
在暴露步骤(d)中，将能够由确认步骤(C)确认已从冷冻以及解冻的影响中得到恢复的藻类细胞，与含有被检测物质的溶液混合来制作暴露试样，培养暴露试样。暴露试样的制作为，例如，相对于藻类细胞1容量添加含有被检测物质的溶液9容量。藻类细胞由该操作被稀释10倍，如上所述，这是为了避免冻害保护剂对化学物质毒性评价的影响。另外，因为能够大量添加含有被检测物质的溶液，所以即使是难溶于水的化学物质也能够进行评价。也可以设定各种各样的被检测物质的浓度来调制多个暴露试样。另外，也可以将藻类细胞与只溶解被检测物质的溶剂相混合从而制作对照试样。通过使用对照试样测定对照数据并计算出评价值，从而就能够更加准确地评价被检测物质的毒性。暴露试样的培养例如是在温度为25 士0. 50C以及照度为50 55 μ mol · πΓ2 · s—1的条件下进行的。培养时间只要是被检测物质影响到藻类细胞的程度的时间就没有特别的限定，例如8小时，优选为M小时。为了容易地对延迟发光进行测定，可以将能够直接用于延迟发光的测定的试验管用作为暴露试样的培养容器。在此情况下，为了将每根试验管的照度的不均勻性控制在最小限度并提高搅拌效率以及提高藻类的细胞增殖率，优选进行合并使用旋转装置(rotator)以及轨道摇床(orbital shaker)的旋转培养。在测量步骤(e)中，测定暴露步骤(d)后的暴露试样的延迟发光，将所获得的发光量作为暴露数据。如上所述，延迟发光的测定可以由公知的装置以及方法，例如可以由国际公开第2005/062027号所记载的装置以及方法进行。更为具体的是，在对试样照射1秒钟的激发光(680nm，20 μ mol · m_2 · )之后，由光电倍增管检测从试样中检测的延迟发光，从完成激发到以后的60秒钟内以100毫秒间隔记录该延迟发光量，并将从完成激发后1. 1秒到60秒为止的该延迟发光量的总和作为暴露数据。在评价步骤(f )中，根据初期值数据以及暴露数据计算出评价值，并根据评价值评价被检测物质的毒性。已知延迟发光与藻类细胞的生长阻碍相关并且发光量会因此降低。 在暴露数据较初期值数据有所下降的情况下，则可以评价为在被检测物质中有毒性。更为具体的是，对作为暴露试样的含有成为评价对象的有害物质的试样(A)和不含有害物质的试样(B)进行测量，并分别计算出由以下所述式1进行计算的增加速度，比较A的增加速度和B的增加速度，由以下所述式2计算出A相对于B的降低量并将其作为毒性的指标。(式1)增加速度=(In(暴露数据)-In (初期值数据))+ (培养时间)(式2)降低率=(B的增加速度-A的增加速度)+B的增加速度X100实施例(比较例)按照标准程序，使用含有冻害保护剂(5%DMS0)并在细胞密度为2000X 104细胞/ mL以及体积为650 μ L的条件下被冷冻的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)，由以下所述方法测定延迟发光。将OECD培养基用于稀释液。(a)解冻步骤(a-Ι)加温步骤在37°C水浴中，一边慢慢地摇动已放入了冷冻的绿藻的冷冻管，一边用12(Γ150 秒钟左右使其完全解冻。在净化台(clean bench)内用前端粗的移液管轻轻地进行移液， 将620 μ L的细胞悬浊液取出至玻璃管中。(a_2)稀释步骤
将5580 UL (10倍稀释)的OE⑶培养基慢慢地加入到玻璃管内。为了防止渗透压发生急剧变化，花1分钟左右的时间一点点进行添加。添加培养基后在净化台内静置5 10 分钟。(C)确认步骤采集完成了(a_2)的稀释步骤的试样的一部分，稀释至10倍从而调制出初期值样品。测定初期值样品的延迟发光。另外，通过颗粒测量来测量细胞数。进一步实施由菌落法(Colony method)进行的存活细胞的测量。另一方面，使用没有冷冻的绿藻来进行延迟发光的测定、颗粒数的测量以及菌落存活率的测量。图1是表示冷冻·解冻的绿藻以及没有冷冻的绿藻的颗粒数的图，图2是表示冷冻·解冻的绿藻以及没有冷冻的绿藻的菌落存活率的图。如图1以及图2所示，可以看到 (c)确认步骤中的冷冻·解冻的绿藻的颗粒数以及菌落存活率与没有冷冻的绿藻的那些相比几乎没有差别，并且从冷冻·解冻的影响中恢复到恰当的状态。然而，根据表示延迟发光的发光模式的图即图3可知，冷冻 解冻的绿藻和没有冷冻的绿藻其发光模式是不相同的。如果发光模式有所不同，则在进行之后的化学物质的毒性评价的情况下，不能够进行与没有冷冻的藻类相同等的评价。图4是表示从激发光灭灯后1. 1秒到60秒为止的发光量(累计值)的图，冷冻的绿藻的发光量与没有冷冻的绿藻的发光量相比较降低了，大约为77%。已知延迟发光中发光量与藻类的生长阻碍相关而发生降低，所以发光量由于冷冻·解冻而已经较冷冻前降低的藻类细胞被预想为已经发生了生长阻碍，并且即使暴露在作为评价对象的化学物质中也不能够恰当评价毒性。因此，上述比较例的方法对于利用藻类的延迟发光的化学物质的评价方法来说是不适当的。(实施例)(a)解冻步骤以与比较例同样的方法进行。(b)恢复培养步骤对由(a)解冻步骤调制的试样，在温度为25士0. 5 °C以及照度为 5(Γ55 μ mol · m_2 · s—1的条件下用1小时或者2小时进行培养。(C)确认步骤采集一部分完成了(b)恢复培养步骤的试样，并对其进行稀释，从而调制出初期值样品。测定初期值样品的延迟发光。另一方面，使用没有冷冻的绿藻进行延迟发光的测定。图5是表示延迟发光的发光模式的图。为了进行比较，图中除了包括没有冷冻的绿藻的延迟发光以及由实施例的方法获得的初期值样品的延迟发光之外，还包括由比较例的方法获得的初期值样品的延迟发光。如图5所示，明显可知通过进行1小时或者2小时的恢复培养，达到与没有冷冻的绿藻的延迟发光相同的发光模式。图6是表示发光量的图。 通过进行1小时或者2小时的恢复培养，从而就能够获得成为没有冷冻的绿藻的发光量的大约93%以及大约11 的充分的发光量。因此，上述实施例的方法能够进行与使用没有冷冻的绿藻的情况相同等的评价
权利要求
1.一种使用藻类的评价化学物质的毒性的方法，其特征在于具备(a)解冻步骤，对冷冻的藻类细胞加温并解冻，在所获得的细胞悬浊液中添加培养基进行稀释；(b)恢复培养步骤，对由解冻步骤(a)所获得的藻类细胞进行培养，使藻类细胞从冷冻以及解冻的影响中恢复；(c)确认步骤，采集一部分恢复培养步骤(b)之后的藻类细胞，添加培养基进行稀释，测定藻类细胞的延迟发光并将所获得的发光量作为初期值数据；(d)暴露步骤，将确认步骤(c)之后的藻类细胞和含有被检测物质的溶液相混合来制作暴露试样，并培养暴露试样；(e)测量步骤，测定暴露步骤(d)之后的暴露试样的延迟发光，将所获得的发光量作为暴露数据；以及(f)评价步骤，根据初期值数据以及暴露数据计算出评价值，根据评价值评价被检测物质的毒性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于反复进行恢复培养步骤(b)以及确认步骤(c)，直至由确认步骤(c)所获得的初期值数据达到规定的值为止。
3.如权利要求1或者2所述的方法，其特征在于在暴露步骤(d)中，还将确认步骤(c)之后的藻类细胞和被检测物质溶液的溶剂相混合来制作对照试样，并培养对照试样；在测量步骤(e)中，还测定对照试样的延迟发光作为对照数据；在评价步骤(f)中，根据初期值数据、暴露数据以及对照数据计算出评价值，根据评价值评价被检测物质的毒性。
全文摘要
本发明提供一种使用藻类的评价化学物质的毒性的方法，包括(a)解冻步骤，对被冷冻的藻类细胞加温并解冻，将培养基加入到所获得的细胞悬浊液中进行稀释；(b)恢复培养步骤，对由解冻步骤所获得的藻类细胞进行培养，并使藻类细胞从冷冻以及解冻的影响中恢复；(c)确认步骤，采集一部分恢复培养步骤后的藻类细胞，添加培养基进行稀释，测定藻类细胞的延迟发光并将所获得的发光量作为初期值数据；(d)暴露步骤，将确认步骤之后的藻类细胞和含有被检测物质的溶液相混合来制作暴露试样，培养暴露试样；(e)测量步骤，测定暴露步骤之后的暴露试样的延迟发光，将所获得的发光量作为暴露数据；以及(f)评价步骤，根据初期值数据以及暴露数据计算出评价值，根据评价值评价被检测物质的毒性。
文档编号G01N21/64GK102597747SQ20108005045
公开日2012年7月18日 申请日期2010年10月26日 优先权日2009年11月9日
发明者数村公子, 竹内彩乃, 胜又政和 申请人:浜松光子学株式会社