专利名称：螺旋藻中β-胡萝卜素的HPLC测定方法
技术领域：
本发明涉及一种β -胡萝卜素的测定方法，特别是涉及一种螺旋藻中β -胡萝卜素含量的测定方法。
背景技术：
β-胡萝卜素(C40H56)是类胡萝卜素之一，也是橘黄色脂溶性化合物，β _胡萝卜素会被人体转换成维生素Α，6微克β-胡萝卜素相当于1微克维生素Α，β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、 白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。β -胡萝卜素的测定方法是石油醚-丙酮提取、三氧化二铝柱层析、高效液相色谱法及纸层析法，石油醚-丙酮提取、三氧化二铝柱层析此法操作繁琐，同时因为不标定标准品溶液，容易将检测值测高，纸层析法因为前处理繁琐，用分光光度法测定不如高效液相色谱法精确，均影响结果准确性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种螺旋藻中β -胡萝卜素含量的测定方法，克服现有技术中a.将结果检测偏高，b.样品处理中的乳化现象，c. 胡萝卜素降解的问题。本发明是通过以下技术方案实现的一种螺旋藻中胡萝卜素的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备采用皂化提取法溶解螺旋藻中的胡萝卜素，具体为 称取螺旋藻样品，加入乙醇溶液、抗坏血酸和氢氧化钾溶液于恒温水浴锅中回流，所得溶液转移至分液漏斗用30-60°C石油醚萃取皂化提取液中的β-胡萝卜素，取上层石油醚层，用水洗涤3-5次，弃去水层，将石油醚层通过无水硫酸钠进行干燥，然后转移至容量瓶定容即得；(2)标准曲线的制备Α、标准储备液准确称取β -胡萝卜素标准品于容量瓶中，加氯仿溶解，用石油醚定容，配制成胡萝卜素储备液，于_18°C避光保存，临用前标定；标准溶液的标定取标准储备液，用正己烷定容，混勻，测定其吸光值，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。按下列公式计算溶液浓度
Γ π ^ ^4 10Χ = — χ-
E 0.05X 胡萝卜标准溶液浓度，单位为微克每毫升A:吸光值E : β -胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为 lug/ml的吸光系数，为0. 2368
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—测定过程中稀释倍数的换算系数B、取胡萝卜素储备液配制不同浓度的β-胡萝卜素溶液，分别上HPLC测定，求得峰面积绘制标准曲线；C、标准使用液量取现标定的β -胡萝卜素标准储备液配制标准使用液；(3)利用步骤O) C中确定的标准使用液的浓度作为外标计算待测液中β -胡萝卜素的含量
Γ 、， cxV 1000X =-χ-
m 1000x10按照步骤(1)所述方法制备供试品待测液，X-试样中β-胡萝卜素的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)C-试样测定液中β-胡萝卜素的浓度，单位为微克每毫升(ng/mL)m-试样质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)。所述步骤(1)螺旋藻样品为0. Ι-lg，加入乙醇的体积为25_50ml，抗坏血酸浓度为 5% -15%，体积为3-10ml，氢氧化钾溶液浓度为40-60%，体积为8_15ml，所述的水浴温度为80-100°C，所述的皂化时间为0. 5-1. 5h。所述步骤(1)中石油醚萃取皂化提取液中的β-胡萝卜素体积为40_70ml，震摇 l-5min ；所用水的体积为5ml，无水硫酸钠6_10g。HPLC色谱条件是流动相甲醇85-95体积份乙腈5-15体积份流速为1. 2mL/min ；进样量=IOyL,柱温:30°C。本发明的有益效果本发明的测定方法对螺旋藻中的胡萝卜素分离性好，灵敏度高，选择性和特异性好，能够有效排除基质干扰，且在样品处理过程中采用皂化提取， 适用于螺旋藻制品。文献报道的胡萝卜素的测定方法是石油醚-丙酮提取、三氧化二铝柱层析、高效液相色谱法及纸层析法，石油醚-丙酮提取、三氧化二铝柱层析此法操作繁琐，同时因为不标定标准品溶液，容易将检测结果测高，纸层析法因为前处理繁琐，用分光光度法测定不如高效液相色谱法精确，均影响结果准确性。本发明简化了测定螺旋藻中胡萝卜素的实验步骤，降低了因未标定标准储备液及其仪器灵敏度而产生的偶然误差，提高了测定结果的重复性和准确性，并且此检测方法在其他的粉类产品中也可使用。
图1是螺旋藻中β -胡萝卜素含量测定标准曲线图。
具体实施例方式下面将通过实例对本发明作进一步的描述，这些描述将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。(1)供试品溶液的制备
A、采用皂化提取法溶解螺旋藻中的β -胡萝卜素，使螺旋藻中的β -胡萝卜素充分提取，具体做法是称取0. 5g的螺旋藻样品，置于锥形瓶中，加入30ml的乙醇，加入浓度为10%抗坏血酸5ml，加入浓度为50%的氢氧化钾溶液10ml，再将其置于恒温水浴锅中回流。所述的水浴温度为90°C，所述的皂化时间为0. 5h ；从水浴中取出，立即冷却，终止反应。B、将A步所得的溶液转移至分液漏斗中；用体积为60ml的石油醚(沸程为 30-600C )萃取皂化提取液中的胡萝卜素，震摇2min，静置分层。C、弃去下层，用5ml的水分4次洗石油醚层，弃去水层；D、在玻璃漏斗中盛有8g无水硫酸钠，将石油醚层通过无水硫酸钠进行干燥；E、将干燥后的石油醚层转移至50ml的容量瓶中，用石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠转移定容，即得到供试溶液；(2)色谱条件流动相甲醇90体积份，乙腈10体积份流速为1. 2mL/min ；进样量10 μ L，柱温 30 "C。(3)标准曲线的制备Α、标准储备液准确称取12. 5mg β -胡萝卜素标准品于50ml容量瓶中，加3_6ml 氯仿溶解，用石油醚定容，配制成浓度为250ug/ml的胡萝卜素储备液，于_18°C避光保存， 临用前标定。标准溶液的标定取标准储备液50ul，用正己烷定容至10ml，混勻，测定其吸光值，比色杯厚度为1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。按下列公式计算溶液浓度
权利要求
1.一种螺旋藻中胡萝卜素的HPLC测定方法，其特征在于，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备采用皂化提取法溶解螺旋藻中的胡萝卜素，具体为称取螺旋藻样品，加入乙醇溶液、抗坏血酸和氢氧化钾溶液于恒温水浴锅中回流，所得溶液转移至分液漏斗用沸程为30-60°C石油醚萃取皂化提取液中的β-胡萝卜素，取上层石油醚层， 用水洗涤3-5次，弃去水层，将石油醚层通过无水硫酸钠进行干燥，然后转移至容量瓶定容即得；(2)标准曲线的制备Α、标准储备液准确称取β-胡萝卜素标准品于容量瓶中，加氯仿溶解，用石油醚定容，配制成胡萝卜素储备液，于_18°C避光保存，临用前标定；标准溶液的标定取标准储备液，用正己烷定容，混勻，测定其吸光值，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。按下列公式计算溶液浓度X 胡萝卜标准溶液浓度，单位为微克每毫升 A 吸光值E β -胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为Iug/ ml的吸光系数，为0. 2368 10^ 测定过程中稀释倍数的换算系数B、取胡萝卜素储备液配制不同浓度的β-胡萝卜素溶液，分别上HPLC测定，求得峰面积绘制标准曲线；C、标准使用液量取现标定的β-胡萝卜素标准储备液配制标准使用液；(3)利用步骤O)C中确定的标准使用液的浓度作为外标计算待测液中β-胡萝卜素的含量按照步骤(1)所述方法制备供试品待测液，X--试样中β-胡萝卜素的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)C-试样测定液中胡萝卜素的浓度，单位为微克每毫升(ng/mL)m-试样质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)。
2.根据权利要求1所述螺旋藻中胡萝卜素的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)螺旋藻样品为0. Ι-lg，加入乙醇的体积为25-50ml，抗坏血酸浓度为5% -15%，体积为3-10ml，氢氧化钾溶液浓度为40-60%，体积为8_15ml，所述的水浴温度为80-100°C，所述的皂化时间为0. 5-1. 5h。
3.根据权利要求1所述螺旋藻中胡萝卜素的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中石油醚萃取皂化提取液中的β-胡萝卜素体积为40-70ml，震摇l-5min ；所用水的体积为5ml，无水硫酸钠6-10g。
4.根据权利要求1所述螺旋藻中胡萝卜素的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(I)HPLC色谱条件是流动相甲醇85-95体积份乙腈5-15体积份流速为1. 2mL/min ；进样量10μ L，柱温:30°C。
全文摘要
本发明公开了一种螺旋藻中β-胡萝卜素的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备采用皂化提取法溶解螺旋藻中的β-胡萝卜素(2)标准曲线的制备(3)利用步骤(2)中确定的标准使用液的浓度作为外标计算待测液中β-胡萝卜素的含量。本发明的测定方法对螺旋藻中的β-胡萝卜素分离性好，灵敏度高，选择性和特异性好，能够有效排除基质干扰，且在样品处理过程中采用皂化提取，适用于螺旋藻制品。本发明简化了测定螺旋藻中β-胡萝卜素的实验步骤，降低了因未标定标准储备液及其仪器灵敏度而产生的偶然误差，提高了测定结果的重复性和准确性，并且此检测方法在其他的粉类产品中也可使用。
文档编号G01N30/02GK102175789SQ20111000190
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者侯春莲, 李星芝, 赵晓娟 申请人:天津天狮生命源有限公司, 天津天狮生物发展有限公司, 天狮集团有限公司