专利名称：习惯性流产致病基因突变检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及检测习惯性流产致病基因是否发生突变的试剂
品.O
背景技术：
妊娠不足28周、胎儿体重不足IOOOg而终止者称为流产(Abortion)。孕12周前终止者成为早期流产，孕12周至不足观周终止者成为晚期流产。其中，自然因素导致的流产称为自然流产(Spontaneousabortion，miscarrage)。自然流产率占全部妊娠的10% 15%，其中，80%为早期流产。习惯性流产指连续发生三次或三次以上自然流产。其发生率约占妊娠总数的1 %， 占自然流产数的15%。习惯性流产的病因极为复杂，染色体异常、解剖因素、内分泌异常、免疫因素、血型不合、感染甚至精神因素等均可导致习惯性流产的发生。其中，常见原因有胚胎染色体异常、免疫因素异常、甲状腺功能低下、子宫畸形或发育不良、宫颈粘连、宫颈内口松弛等。习惯性流产是一种复杂的多基因疾病，从根本上讲是遗传因素和环境因素交互作用的结果，是基因在环境诱导下的异常表达所致。因此，从遗传角度寻找和确定与习惯性流产相关的易感基因或致病基因，就可以从根本上阐明其发病机制，不仅能够为诊疗方案的确定提供辅助支持，还能对易感人群进行提示，使其进行有效预防，降低习惯性流产的发生目前，涉及习惯性流产的一些基因，已经被很好的进行研究。其作用机制、生化功能、信号通路、调控、转录等等方面都有明确可靠的研究结果；研究手段、方法、仪器设备和试剂等都已经发展到了一个相当的高度。目前，经证实并且机理研究清楚的与抗氧化能力密切相关的基因有细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-α基因 (TNF-α)、白细胞介素-6基因(IL-6)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)。CTLA4基因位于人类染色体2q33，编码特异性受体，并表达于T淋巴细胞表面，是一种T细胞活化的抑制性调节因子。CTLA4基因对调节母-胎之间的免疫耐受发挥着重要的作用。rs231775(A49G)是位于CLTA4基因第1外显子上的一个A/G单核苷酸多态性位点，此多态性导致CTLA4mRNA表达显著下降，使得CTLA4分子对免疫信号的下调作用降低， 从而使免疫信号的调节失去控制。研究发现，携带AA基因型的习惯性流产患者同AG和GG 基因型的患者比较，能产生高水平的IgE抗体，AA基因型被认为主要介导了 TH2为主的免疫反应。由此可以推测，习惯性流产患者中高频率分布的等位基因G和基因型GG，与TH2免疫反应降低有关，由此打破了母-胎界面TH1/TH2的免疫平衡，从而引起对宫内胎儿有害的免疫反应，是遗传风险基因型。肿瘤坏死因子-a (TNF- a )是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子， TNF-α作为具有多种生物学活性的细胞因子也参与正常妊娠过程中的多种生物学功能的调节，妊娠期适量的TNF- α能促进妇女能量代谢及胚胎发育，提高孕激素及绒毛膜促性腺激素的合成，并且能刺激细胞滋养层生成尿激酶型血浆素原激活剂(uPA)，有利于蜕膜细胞外基质降解及胎盘植入，对妊娠维持有重要作用。经研究发现，正常早孕妇女血清中TNF- α 明显低于正常非孕妇女，而反复流产组血清中的TNF-α明显高于正常早孕组，其中难免流产组明显高于先兆流产组。因此认为，在妊娠期TNF-α分泌受到抑制，而TNF-α的高水平表达与反复流产相关，可作为预测流产的指标。rsl8006^和rsl7997M均为位于TNF-α 基因启动区G/A单核苷酸多态性位点，A等位基因会增加TNF- α的转录和分泌，而TNF- α 水平的升高将增加习惯性流产的风险，因此这两个位点的A等位基因为风险基因型。白细胞介素-6(IL_6)是一种多功能细胞因子，在正常妊娠妇女的血清及羊水中均存在著一定量的IL-6，至妊娠后期及分娩前IL-6水平明显升高。妊娠后期IL-6的急剧升高与肾移植中的排斥反应相似，是母体对胎儿的一种排斥反应，在妊娠期间，母体的免疫机制受到抑制，在妊娠末期这种抑制被解除，出现排斥反应，表现为各种细胞因子的出现。研究发现正常早孕妇女血清中IL-6水平与正常非孕妇女无明显差异，反复流产组血清中IL-6明显高于正常早孕组，其中难免流产组明显高于先兆流产组。因此认为，高水平的 IL-6与反复流产相关，可作为预测流产的指标。rsl800796是位于IL-6启动子区域的一个 G-572C单核苷酸多态性位点，与IL-6的表达相关。研究表明，携带风险基因型G时IL-6表达增加，造成免疫应答的紊乱，增加习惯性流产的风险。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，现有研究显示，叶酸与母胎的健康密切相关。在受精卵发育、细胞分裂生长十分旺盛时，孕妇新陈代谢活跃， 蛋白质合成加速，叶酸的需要量陡然剧增。如果孕妇体内红细胞叶酸贮存量不足，胎盘发育不良就会自发流产。目前，已发现MTHFR上存在一系列的多态性位点，这些位点通过改变MTHFR的表达或者活性，进而阻碍叶酸代谢，增加习惯性流产的风险。rsl801133是位于 MTHFR基因第5外显子上的C677T单核苷酸多态性位点，引起MTHFR基因编码的蛋白第222 个氨基酸由Ala [A]变为Val [V]。研究表明，携带T等位基因时，蛋白的热敏感性增加，MTHFR 活性降低。rsl801131是位于第一号染色体MTHFR基因第八个外显子上第1298核苷酸的一个A/C单核苷酸多态性位点，携带C等位基因时，会引起MTHFR基因编码的蛋白第4 个氨基酸由Glu变为Ala。现有研究显示，携带这2个MTHFR多态性位点的风险基因型时都会降低MTHFR的活性，导致叶酸代谢及同型半胱氨酸清除过程受阻，促进了血栓形成倾向，增加了习惯性流产的发生风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术检测习惯性流产致病基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-α基因(TNF-α )、白细胞介素_6 基因(IL-6)和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的相关SNP位点是否发生突变的试剂盒。本检测试剂盒主要包括以下成分(1)检测CTLA4基因上rs769214号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(2)检测TNF-α基因上rsl8006^号和rsl7997M号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(3)检测IL-6基因上rsl800796号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(4)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(5)常规荧光定量PCR反应试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、 去离子水等。本检测试剂盒的组分和含量包括(1)6 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液；(2) 0. 6 μ 1 25mM dNTP 混合液；(3) 3. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液；(4) 0. 15 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶；(5) 20 μ M特异性引物对每条引物各1 0D;(6) 10 μ M特异性荧光探针对每条探针各1 OD ；(7)去离子水 31. 95 μ I0本试剂盒为一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。本试剂盒的使用步骤包括(1)提取样本的基因组DNA ；(2)荧光定量PCR反应使用检测试剂盒，进行6次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积 10 μ 1，包含浓度为20ng/l·! 1的样本基因组DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 125mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。本发明所述的试剂盒用于检测习惯性流产致病基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-α基因(TNF-α )、白细胞介素-6基因(IL_6)和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的相关SNP位点的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、及时治疗，降低习惯性流产的发病率，优生优育。
具体实施例方式实施例1一人份检测习惯性流产致病基因否发生突变的试剂盒，包括以下成分(1)检测CTLA4基因上rs769214号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各1 0D;(2)检测TNF- α基因上rsl8006^号和rsl7997M号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各1 OD ；(3)检测IL-6基因上rsl800796号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各1 0D;(4)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各IOD ；(5)荧光定量PCR反应试剂6 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 6 μ 1 25mM dNTP 混合液、3. 6μ 125mM MgC12 溶液、0. 15 μ 1 (5units/μ 1) Taq DNA 聚合酶、去离子水 31. 95 μ 1。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2一人份检测习惯性流产致病基因否发生突变的试剂盒的使用步骤包括(1)提取样本的基因组DNA ；(2)荧光定量PCR反应使用检测试剂盒，进行6次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积 10 μ 1，包含浓度为20ng/l·! 1的样本基因组DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 125mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。(3) SNP基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例3应用检测习惯性流产致病基因否发生突变的试剂盒进行个体习惯性流产遗传易感性检测的服务(1)由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提；(2)基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的CTLA4基因上rs769214号 SNP 位点、TNF-α 基因上 rsl800629 号和 rsl799724 号 SNP 位点、IL-6 基因上 rsl800796 号SNP位点、MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这6个SNPs位点的基因型。(3)个体习惯性流产遗传易感性的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体习惯性流产遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者习惯性流产遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体习惯性流产遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测习惯性流产致病基因是否发生突变的试剂盒，其特征在于包括以下成分 (1)检测CTLA4基因上rs769214号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(2)检测TNF-α基因上rsl800629号和rsl799724号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(3)检测IL-6基因上rsl800796号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(4)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；( 常规荧光定量PCR反应试剂。
2.根据权利1所述的试剂盒，其特征在于包括以下组分和含量(1)6μ1IOX荧光定量PCR反应缓冲液；(2)0.6μ 1 25mM dNTP混合液；(3) 3. 6 μ 1 25mM MgC12溶液； (4) 0. 15 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶；(5) 20 μ M特异性引物对每条引物各IOD ； (6) 10 μ M特异性荧光探针对每条探针各IOD ； (7)去离子水31. 95 μ 1。本试剂盒为一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
3.根据权利1所述的试剂盒用于检测习惯性流产致病基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-α基因(TNF-α )、白细胞介素-6基因(IL_6)和5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的相关SNP位点的突变体。
全文摘要
本发明公开了一种检测习惯性流产致病基因上的相关SNP位点是否发生突变的试剂盒。该试剂盒的主要成分包括(1)检测CTLA4基因上rs769214号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号和rs1799724号SNP位点、IL-6基因上rs1800796号SNP位点和MTHFR基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(2)常规荧光定量PCR反应试剂。本发明的试剂盒用于检测习惯性流产致病基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、及时治疗，降低习惯性流产的发病率，优生优育。
文档编号G01N21/64GK102229983SQ20111012977
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者王贻锘 申请人:上海主健生物工程有限公司