专利名称：新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及检测新生儿神经管畸形致病基因是否发生突变的试剂盒。
背景技术：
叶酸是机体所需的重要营养素，为水溶性B族维生素，在绿叶蔬菜、水果及动物肝脏中含量丰富。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸是一碳单位的运载体，可运载甲基、甲烯基、甲醛基等一碳单位，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而叶酸对细胞分裂增殖、组织修复和机体发育等都是不可缺少的营养素。对于孕妇，补充叶酸尤其重要。妊娠头4周是胎儿神经管分化和形成的重要时期， 此期叶酸缺乏可增加胎儿神经管畸形及早产的风险，而很多受孕者在早孕期并没意识到自己已经怀孕；更有研究显示，妇女在服用叶酸4周后，体内叶酸缺乏的状态才能得到明显的改善。因此，育龄妇女至少应在孕前3个月开始，适当多吃富含叶酸的食物和补充叶酸，以确保胚胎早期有一个较好的叶酸营养状态，预防胎儿神经管及其他器官畸形的发生。育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同，存在叶酸代谢能力的差异，不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。如服用剂量不足实际需求，达不到补充叶酸的效果；而盲目过量服用高浓度叶酸，会干扰孕妇的营养元素代谢，同样会影响胎儿发育，超量服用叶酸也会引起药品不良反应，反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同身体状况与素质的育龄妇女必须根据自身情况，有的放矢地准备与补充所需要的叶酸。目前，经证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢密切相关的基因有5，10_亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。MTHFR 为 5，10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亚甲基四S叶酸还原酶)蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路， 通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接的为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。研究发现，MTHFR基因存在多种多态型，影响MTHFR活性和热稳定性。常见的变异包括⑴677C-T =MTHFR基因第677位密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，编码后酶分子中丙氨酸被缬氨酸替代，引起MTHFR热稳定性和活性降低，相对于正常的C/C基因型，纯合子T/T基因型MTHFR活性在37摄氏度降低 50% 60%，在46摄氏度降低65%; (2) 1298A-C 编码后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。U98A-C与677C-T不同的是，纯合子和杂合子血浆同型半胱氨酸升高和叶酸降低均不明显。然而，如果同时存在U98A-C和677C-T复合变异的杂合子，则MTHFR 活性低于野生型40%。甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶 (MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR能够保持甲基钴铵III在一定水平，而甲基钴铵III是激活蛋氨酸合成酶的辅助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR变异是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要原因。MTRR 66A —G多态性，导致蛋氨酸被异亮氨酸替代，使该酶活性降低。该基因型对同型半胱氨酸水平有显著影响。有研究指出，MTRR基因A66G多态，血浆同型半胱氨酸增高，基因型为MTRR 66GG，MTRR 66AG的孕妇或胎儿发生神经管畸形的危险性较正常对照组增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术检测新生儿神经管畸形致病基因5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)上的相关SNP位点是否发生突变的试剂盒。本检测试剂盒主要包括以下成分(1)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对(2)检测MTRR基因上rsl801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(3)常规荧光定量PCR反应试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、 去离子水等。本检测试剂盒的组分和含量包括(1)3 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液；(2) 0. 3 μ 1 25mM dNTP 混合液；(3) 1. 8 μ 1 25mM MgCl2 溶液；(4) 0. 075 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶；(5) 20 μ M特异性引物对每条引物各1 0D;(6) 10 μ M特异性荧光探针对每条探针各1 OD ；(7)去离子水 15. 975 μ L·本试剂盒为一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。本试剂盒的使用步骤包括(1)提取样本的基因组DNA ；(2)荧光定量PCR反应使用检测试剂盒，进行3次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积10μ 1，包含浓度为20ng/y 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。本发明所述的试剂盒用于检测习惯性流产致病基因新生儿神经管畸形致病基因 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)上的相关SNP位点的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者，可应用于产前诊断、及时治疗， 降低新生儿神经管畸形的发病率，优生优育。
具体实施例方式实施例1一人份检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒，包括以下成分(1)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各1 OD ；；(2)检测MTRR基因上rsl801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对，每条引物和探针各1 0D;；(3)荧光定量PCR反应试剂3 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 3 μ 1 25mM (1^ 混合液、1.8“ 125mM MgC12 溶液、0. 075 μ l(5units/y l)Taq DNA 聚合酶、去离子水 15. 975 μ 1。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2一人份检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒的使用步骤包括(1)提取样本的基因组DNA ；(2)荧光定量PCR反应使用检测试剂盒，进行3次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积10μ 1，包含浓度为20ng/y 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。(3) SNP基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例3应用检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒进行孕妇新生儿神经管畸形遗传易感性检测的服务(1)由医院检验科医师指导被检孕妇使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提；(2)基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNP位点和MTRR基因上rsl801394号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这3个SNPs位点的基因型。(3)孕妇新生儿神经管畸形遗传易感性的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具孕妇新生儿神经管畸形遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了该孕妇的新生儿神经管畸形遗传风险的高低，并由医师向其详细说明和解读新生儿神经管畸形遗传易感性分析报告单，指导孕妇合理补充叶酸，防止新生儿神经管畸形的发生。
权利要求
1.一种检测新生儿神经管畸形致病基因是否发生突变的试剂盒，其特征在于包括以下成分(1)检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(2)检测MTRR基因上rsl801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(3)常规荧光定量PCR反应试剂。
2.根据权利1所述的试剂盒，其特征在于包括以下组分和含量(1)3μ1IOX荧光定量PCR反应缓冲液；(2)0.3μ 1 25mM dNTP混合液；(3) 1. 8 μ 1 25mM MgC12溶液； (4)0. 075μ l(5units/y l)Taq DNA聚合酶；(5) 20 μ M特异性引物对每条引物各IOD ； (6) 10 μ M特异性荧光探针对每条探针各IOD ； (7)去离子水15. 975 μ 1。本试剂盒为一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
3.根据权利1所述的试剂盒用于检测新生儿神经管畸形致病基因5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)上的相关SNP位点的突变体。
全文摘要
本发明公开了一种检测新生儿神经管畸形致病基因上的相关SNP位点是否发生突变的试剂盒。该试剂盒的主要成分包括(1)检测MTHFR基因上rs1801133号和rs1801131号和MTRR基因上rs1801394号SNP位点多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；(2)常规荧光定量PCR反应试剂。本发明的试剂盒用于检测新生儿神经管畸形致病基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者，可应用于产前诊断、及时治疗，降低新生儿神经管畸形的发病率，优生优育。
文档编号G01N21/64GK102181569SQ201110129750
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者王贻锘 申请人:上海主健生物工程有限公司