专利名称：一种剑叶龙血树的质量检测方法
技术领域：
本发明公开了一种中药材提取原料的质量检测方法，具体涉及一种龙血竭的提取原料剑叶龙血树的质量检测方法。
背景技术：
血竭是我国中医传统的内外伤科要药，经初步考证，血竭在我国传统医学上的使用至少有1500年的历史。中国药典2005年版一部收载的血竭为棕榈科植物麒麟竭 Daemonorops draco Bi.果实渗出的树脂经加工制成。早期血竭主要依赖进口，随着市场需求的不断增加，我国也在积极开发国产血竭替代资源。1972年以来广西、云南、海南的植物、药物专家和研究工作者，相继开发了龙血竭(百合科植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S. C. Chen的含脂木材经乙醇提取得到的树脂)作为血竭的替代品，同时制定了质量标准，并被批准为国家新药标准WS3-082(Z-016)-99(Z)。剑叶龙血树是龙血竭的提取原料，我国资源并不能满足市场需求，尚有部分剑叶龙血树原料需通过边贸进口。目前，国内外均未制定龙血竭原料标准，无法检测其质量。为适应市场需求，保证临床用药安全，有必要对剑叶龙血树的质量检测标准进行研究。
发明内容
本发明目的在于公开一种剑叶龙血树的质量检测方法。技术方案本发明所述剑叶龙血树为百合科植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen的含树脂木材。全年均可采收，除去不含树脂的部分，晾干。用作龙血竭提取的原料。本发明质量检测方法包括性状、鉴别、检查、浸出物测定、含量测定方法项目中的一种或几种。剑叶龙血树的性状如下本品为不规则板块状，红棕色至紫红色，有的带少量黄白色木部。长短薄厚不一。表面粗糙，有纵沟及细小横裂纹。皮内表面较平滑，暗棕红色或红褐色，有纵纹理及横裂纹。质硬，不易折断，断面不平坦，有众多圆形或类圆形小孔(导管)。 气微，味淡。所述鉴别方法包括粉末显微鉴别和薄层色谱鉴别粉末显微鉴别剑叶龙血树的粉末呈棕红色。可见众多大小不等的棕红色物质 (树脂)，呈块状，条状或颗粒状。纤维多成束或单个散在，腔内充满棕红色树脂，纹孔大多模糊不清。草酸钙针晶多成束，长52 102 μ m。木薄壁细胞呈类圆形，类方形或类长方形， 壁稍增厚，有的呈不规则连珠状，纹孔可见。剑叶龙血树的薄层色谱鉴别包括如下两种方法中的任意一种a.取剑叶龙血树粉末2重量份，置索氏提取器中，加60 90°C石油醚70体积份， 加热回流0. 5-1. 5小时，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2005 年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0. 002 0. 005体积份，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以80-99 1-20三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。硫酸乙醇溶液浓度相当于以1. Oml硫酸为溶质，以乙醇为溶剂，配制成IOml溶液的浓度。b.取鉴别a项下60 90°C石油醚提取后的药渣，挥干溶剂，置索氏提取器中，加乙酸乙酯60-80体积份，加热回流1小时；提取液浓缩至5体积份，加聚酰胺1-3重量份，拌勻，蒸干，置于已处理好的聚酰胺柱上(14 30目，5g，内径10mm，湿法装柱)，以稀乙醇100 体积份洗脱，流速1. 5ml/min，洗脱液弃去，继以乙醇50体积份洗脱，流速1. 5ml/min，收集洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各.0. 005 0. 01 体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12 1的60 90°C石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。所述聚酰胺可用如下方法处理取聚酰胺粉以95 %乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中；用4倍柱体积的95%乙醇洗涤；再依次用2倍柱体积的5% NaOH水溶液，1倍柱体积蒸馏水，2倍柱体积10%醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，取出烘干，即得。所述含量测定方法为照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以50-70 30-50的冰醋酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为280nm ；理论板数按龙血素A峰计算应不低于6000，龙血素A峰与相邻龙血素B峰的分离度应符合要求；对照品溶液的制备精密称取龙血素A和龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1体积份各含0. 002重量份的溶液，即得供试品溶液的制备取剑叶龙血树粉末约1. 0重量份，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25体积份，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇勻， 滤过，精密量取续滤液1体积份至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A(C17H18O4)和龙血素B(C18H2tlO5)的总量不得少于0. 20%。 冰醋酸溶液浓度相当于以1. Oml冰醋酸为溶质，以水为溶剂，配制成90ml溶液的浓度。所述检查包括对水分和总灰分的检查。其中水分照中国药典2005年版一部附录 IXH第一法检测，不得过12.0%。总灰分照中国药典2005年版一部附录IXK检测，不得过 3. 0%。所述浸出物测定是指取剑叶龙血树粉末2重量份，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法(中国药典2005年版一部附录X A)测定，用乙醇作溶剂，浸出物不得少于 20. 0%。本发明质量检测方法中，重量份/体积份的单位对应关系为g/ml的对应关系。
剑叶龙血树一直没有正式的质量标准，本发明提供了一种较为全面、完善的质量检测方法，能有效地检测剑叶龙血树的质量，为保证中药材血竭的质量奠定了基础。为研究剑叶龙血树的质量检测方法，本发明共收集10批样品，详见表1。规定本品为百合科植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen的含脂木材及树皮。表1样品产地及批次表
序号产地及批号原料1广西宁明(2000.06)原料2广西龙州(2001.11)原料3广西大新(2001. 12)原料4广西崇左(2001.08)原料5广西大新(2000.09)原料6云南大观药厂1原料7云南大观药厂2原料8老挝1原料9老挝2原料10老挝3植物来源剑叶龙血树 Dranaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen,乔木状,高可达5 15米。茎粗大，分枝多，树皮灰白色，光滑。老干皮部灰褐色，片状剥落，幼枝有环状叶痕。叶聚生在茎、分枝或小枝顶端，相互套迭，剑形，薄革质，长50 100cm，宽2 5cm， 向基部略变窄而后扩大，抱茎，无柄。圆锥花序长40cm以上，花序轴密生乳突状短柔毛，幼嫩时更甚；花每2 5朵簇生，乳白色；花梗长3 6mm，关节位于近顶端；花被片长6 8mm， 下部1/4 1/5合生；花丝扁平，宽约0. 6mm,上部有红棕色疣点；花药长1. 2mm ；花柱细长。 浆果直径约8 12mm，桔黄色，具1 3颗种子。花期在3月，果期7 8月。此树种在叶基部和茎、枝受伤处常溢出少量红棕色液体，花序轴密生乳突状短柔毛，很容易识别。产地产云南南部(孟连、普洱、镇康)和广西南部(窑头圩)；生于海拔950 1700米的石灰岩上，是耐旱、嗜钙的树种，有时可形成优势树种。也产于越南和老挝。下述实验例是在上述10次样品基础上进行的研究，但本发明不限于下述实验例。实验例1剑叶龙血树含量测定方法学验证实验结果龙血竭标准含量测定项下仅测定龙血素B，而实际上本品还含有龙血素A，同时测定这两种成分才更加科学合理。本发明在样品的前处理、净化，色谱条件等方面对各条件进行了考察和优化，并对建立的方法进行了验证实验，建立了同时测定龙血素A、B两指标性成分的HPLC方法，以下为方法学验证实验结果。一、仪器与试药Waters2695高效液相色谱仪Q996PDA检测器，Epower2工作站)，龙血素A、B(中国药品生物制品检定所，批号分别为111660-200301、111558-200202)，乙腈(色谱纯，美国 fisher公司)，冰醋酸、甲醇、三氯甲烷、石油醚(60 90°C )均为分析纯，北京化工厂生产， 实验用水为Milli-Q系统制备。二、方法与结果1、检测波长确定使用二极管阵列检测器，测定对照品溶液，得到龙血素A及龙血素B全波长 (200 400nm)扫描图谱，见
图1、图2。由图可见两者均在^Onm附近有最大吸收，故选择测定波长为280nm。2、色谱条件冰醋酸溶液-乙腈(58 42)为流动相；检测波长为280nm ；流速Iml/ min;柱温25°C ；冰醋酸溶液浓度相当于以1. Oml冰醋酸为溶质，以水为溶剂，配制成90ml 溶液的浓度。3、色谱柱耐用性实验(样品为原料4 广西崇左，三氯甲烷超声提取)，结果见图 3-图7。方法学所有实验均采用agilent zobax SB-C18柱。4、线性关系考察精密称取龙血素A对照品5. 64mg和龙血素B对照品5. 29mg,分别置50ml量瓶中， 加甲醇稀释至刻度，摇勻，作为对照品储备液。分别取两种对照品储备液各5ml置IOOml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，即为对照品溶液。分别取对照品溶液2、5、10、15、20μ 1，各进样两次，测定峰面积值、绘制标准曲线(见图8)。线性范围，回归方程，相关系数分别为龙血素 A 0. 01128 0. 11 μ g，Y = -16. 220+3705510. 425x, r = 0. 99999 ；龙血素 B 0.01058 0. 1058 μ g,Y = -56. 610+2983554. 053x, r = 0. 99998。表2龙血素A标准曲线结果表
权利要求
1.一种剑叶龙血树的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下薄层色谱鉴别方法中的任意一种a.取剑叶龙血树粉末2重量份，置索氏提取器中，加60 90°C石油醚70体积份，加热回流0. 5-1. 5小时，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.002 0.005体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以80-99 1_20三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；硫酸乙醇溶液浓度相当于以1. Oml硫酸为溶质，以乙醇为溶剂，配制成IOml溶液的浓度。b.取鉴别a项下60 90°C石油醚提取后的药渣，挥干溶剂，置索氏提取器中，加乙酸乙酯60-80体积份，加热回流1小时；提取液浓缩至5体积份，加聚酰胺1-3重量份，拌勻，蒸干，置于已处理好的聚酰胺柱上，以稀乙醇100体积份洗脱，流速1. 5ml/min，洗脱液弃去，继以乙醇50体积份洗脱，流速1. 5ml/min，收集洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各 0.005 0.01体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12 1的60 90°C石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下薄层色谱鉴别方法中的任意一种a.取剑叶龙血树粉末2重量份，置索氏提取器中，加60 90°C石油醚70体积份，加热回流1小时，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各 0.002 0.005体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以99 1的三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；硫酸乙醇溶液浓度相当于以1. Oml硫酸为溶质，以乙醇为溶剂，配制成IOml溶液的浓度。b.取鉴别a项下60 90°C石油醚提取后的药渣，挥干溶剂，置索氏提取器中，加乙酸乙酯70体积份，加热回流1小时；提取液浓缩至5体积份，加聚酰胺2重量份，拌勻，蒸干， 置于已处理好的聚酰胺柱上，以稀乙醇100体积份洗脱，流速1. 5ml/min，洗脱液弃去，继以乙醇50体积份洗脱，流速1. 5ml/min,收集洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取龙血竭对照药材0. 5重量份，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0. 005 0.01体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10 1的60 90°C石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于该方法中的聚酰胺按如下方法处理取聚酰胺粉以95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中；用4倍柱体积的95%乙醇洗涤；再依次用2倍柱体积的5% NaOH水溶液，1倍柱体积蒸馏水，2倍柱体积10% 醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，取出烘干，即得。
4.如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下含量测定方法照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以50-70 30-50的冰醋酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为^Onm;理论板数按龙血素A峰计算应不低于6000，龙血素A峰与相邻龙血素B峰的分离度应符合要求；对照品溶液的制备精密称取龙血素A和龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1体积份各含0. 002 重量份的溶液，即得供试品溶液的制备取剑叶龙血树粉末1. 0重量份，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25体积份，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷， 再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液1体积份至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A和龙血素B的总量不得少于0. 20% ；冰醋酸溶液浓度相当于以1.0ml冰醋酸为溶质，以水为溶剂，配制成90ml溶液的浓度。
5.如权利要求4所述的质量检测方法，其特征在于该方法中的含量测定方法为照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以58 42的冰醋酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为280nm ；理论板数按龙血素A 峰计算应不低于6000，龙血素A峰与相邻龙血素B峰的分离度应符合要求；对照品溶液的制备精密称取龙血素A和龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1体积份各含0. 002重量份的溶液，即得供试品溶液的制备取剑叶龙血树粉末1. 0重量份，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25体积份，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液1体积份至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A和龙血素B的总量不得少于0. 20%。
6.如权利要求4所述的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下浸出物测定方法取剑叶龙血树粉末2重量份，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，浸出物不得少于20.0%。
7.如权利要求5所述的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下浸出物测定方法取剑叶龙血树粉末2重量份，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，浸出物不得少于20.0%。
8.如权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下含量测定方法照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以50-70 30-50的冰醋酸溶液乙腈为流动相；检测波长为280nm ；理论板数按龙血素A峰计算应不低于6000，龙血素A峰与相邻龙血素B峰的分离度应符合要求；对照品溶液的制备精密称取龙血素A和龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1体积份各含0. 002 重量份的溶液，即得供试品溶液的制备取剑叶龙血树粉末1. 0重量份，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25体积份，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液1体积份至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A和龙血素B的总量不得少于0. 20%。
9.如权利要求8所述的质量检测方法，其特征在于该方法中的含量测定方法为照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以58 42的冰醋酸溶液乙腈为流动相；检测波长为280nm ；理论板数按龙血素A峰计算应不低于6000，龙血素A峰与相邻龙血素B峰的分离度应符合要求；对照品溶液的制备精密称取龙血素A和龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1体积份各含0. 002重量份的溶液，即得供试品溶液的制备取剑叶龙血树粉末1.0重量份，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25体积份，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液1体积份至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A和龙血素B的总量不得少于0. 20%。
10.如权利要求8或9所述的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下浸出物测定方法取剑叶龙血树粉末2重量份，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，浸出物不得少于20.0%。
全文摘要
本发明公开了一种剑叶龙血树的质量检测方法。该方法主要包括鉴别、检查、浸出物测定、含量测定方法等项目。其中，浸出物不得少于20.0％。水分不得过12.0％。总灰分不得过3.0％。所述鉴别方法包括粉末显微鉴别和薄层色谱鉴别；含量测定方法以58∶42的冰醋酸溶液-乙腈为流动相，剑叶龙血树按干燥品计算，含龙血素A和龙血素B的总量不得少于0.20％。该方法能有效检测剑叶龙血树的质量。
文档编号G01N30/90GK102359996SQ201110155479
公开日2012年2月22日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年5月13日
发明者朱光荣, 林瑞超, 王海 申请人:云南大唐汉方制药有限公司