专利名称：：一种含龙血竭提取物的药物制剂的质量控制方法
技术领域：
：本发明属于中药分析领域，涉及一种含中药材提取物药物制剂的质量控制方法，特别涉及一种含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法。
背景技术：
：龙血竭为百合科剑叶龙血树Dranaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂。主产于广西、云南。据《本草纲目》记载，性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效。现代医学研究证实，龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。含龙血竭药材提取物的药物制剂(以下简称"龙血通药物制剂")的处方为龙血竭提取物300g，制备方法为取淀粉加沸水搅拌制成20%淀粉浆，将淀粉浆加入龙血竭提取物中，制成颗粒，干燥，装入胶囊或压片或制丸，制成1000粒(片)，即得；本品每粒(片)装0.33g。本品为红棕色至红褐色颗粒；气微，味淡。龙血通药物制剂具有活血化瘀，通脉舒络的功效，用于中风血瘀证，证见半身不遂，口舌歪斜，言语謇涩或不语，偏身麻木，头晕目眩，舌质紫黯或有瘀点瘀斑，苔薄白或白腻，脉弦或涩；本品口服，一次2粒，一日3次。本发明的申请人于2002年9月12日申请了名称为一种龙血竭总黄酮制剂的制备方法及其质量控制方法的专利，专利申请号为02129687.l，此件专利提供了龙血竭总黄酮制剂的质量控制方法，包括对龙血素B进行薄层鉴别，采用分光光度法对龙血素B和7，4'_二羟基黄酮进行含量测定，采用高效液相色谱法对7，4'-二羟基黄酮进行含量测定，这些方法可以对龙血通药物制剂进行质量控制，但是检测的项目较少，而且薄层鉴别和分光光度法的准确度不够好，本发明在原有技术的基础上增加了对总酚的含量测定，增加了采用较为准确的高效液相色谱法对龙血素B进行含量测定的方法，不仅如此，本发明还提供了一种龙血通药物制剂溶出度的测定方法，此外，本发明还提供了龙血通药物制剂的标准指纹图谱与该图谱的应用方法，可以更加有效地控制龙血通药物制剂的质量。
发明内容本发明的目的是提供一种对龙血通药物制剂中总酚和龙血素B两种指标成分进行含量测定的方法。本发明的目的还在于提供了龙血通药物制剂的标准指纹图谱，并提供了该图谱的应用方法。本发明的目的还在于提供了龙血通药物制剂的溶出度测定方法。上述的龙血通药物制剂，其特征在于药物剂型为包括但不仅限于胶囊剂、片剂、丸剂、软胶囊的常规药物制剂。本发明的目的是通过下列方式实现的—种含有龙血竭药材提取物的药物制剂(龙血通药物制剂)的质量控制方法，可以采用以下方法中的任意一种或几种(1)采用紫外-可见分光光度法检测，药物制剂每单位剂量含总酚以7，4'_二羟基黄酮计，不得低于165.0mg;(2)采用高效液相色谱法检测，药物制剂每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg;(3)采用高效液相色谱指纹图谱检测，药物制剂的标准指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为l号峰O.400.60，2号峰0.420.65，3号峰0.550.78，4号峰0.600.85，5号峰0.700.95，6号峰0.821.15，S号峰1.00，7号峰1.011.30，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；(4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法检测，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75X。所述龙血通药物制剂中总酚的含量测定方法为a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸稀释；照紫外_可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸，摇匀，得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。上述总酚的含量测定方法的优选为a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.标准曲线的制备量取对照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外_可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。上述总酚含量测定方法的优选为a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20X的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每单位剂量含总酚以7，4'-二羟基黄酮计，不得低于165.Omg。所述龙血素B的含量测定方法为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液为流动相；b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。上述龙血素B的含量测定方法的优选为高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为3050:5070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm;b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成lml含40iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，取约O.10.3g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520ii1，注入液相色谱仪，测定，即得。9上述龙血素B的含量测定方法的优选为照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品O.2g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10iU，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg。所述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。上述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法的优选为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70X线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.41.Oml/min，检测波长为250300nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520ii1，分别注入液相色谱仪，测定，即得；上述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法的优选为参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70X线性下降至1020%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。所述溶出度测定方法为采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液为流动相；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成参照物溶液，c.供试品溶液的制备取本品，以十二烷基硫酸钠与氢氧化钠溶液为溶剂，旋转使溶出，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。上述溶出度测定方法的优选为参照高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例为5055:4550为流动相；检测波长为275280nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含1020iig的溶液；c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟6585转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液520ia，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。上述溶出度测定方法的优选为参照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例为53:47为流动相；检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含15iig的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟75转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液10ii1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每单位剂量的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75%。对上述质量控制方法的研究与说明—、对总酚含量测定的研究说明1、系统适应性研究(1)仪器与试药高效液相色谱仪，紫外检测仪，记录仪，柱箱，7，4'-二羟基黄酮对照品，纯度为98.23%，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；(2)测定方法的选择根据化学成分研究结果，采用三氯化铁_铁氰化钾显色法测定总酚类化合物的含量；(3)对照品的选择经研究，选择7，4'-二羟基黄酮作为本品含量测定的对照PR(4)供试品制备方法与测定方法经研究，确定供试品制备方法为取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20%的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；本发明中0.3%的十二烷基磺酸钠溶液的配置方法为取0.3g十二烷基磺酸钠，置100ml容量瓶中，加50%乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50%乙醇溶液定容至刻度，即得。2、7，4'-二羟基黄酮线性关系和回归方程(1)对照品溶液的制备精密称取7，4'-二羟基黄酮10mg，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每lml中含7，4'_二羟基黄酮321^);(2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在780nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定结果见表l，标准曲线见附图l;回归方程:y=0.0995x+0.079其中x为浓度(iig/ml)，y为吸收度，相关系数r=0.9996。表17，4'-二羟基黄酮标准曲线12标准品浓度0ig/ml)1.4282.8564.2845.7127.140吸收度A0.1550.3020.4530.5890.7223、精密度试验取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，在6分钟内，连续测定6次，结果见表2，结果表明精密度良好。表2精密度试验结果序号123456RSD%吸收度A0.2800.2810.2810.2800.2820.2820.324、稳定性试验取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，分别在不同时间测定其吸收度，结果见表3，表明供试品溶液在06分钟吸收度保持相对稳定。表3样品稳定性考察数据测定时间(min)0123456RSD(%)吸收度A0.2800.2800.2810.2820.2820.2830.2840.53测定时间(min)78910203040RSD(%)吸收度A0.2860.2870.2900.2920.3000.3100.3103.605、重复性试验取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，测定，结果见表4，结果表明样品测定重现性好。表4重复性试验序号123456平均RSD%称样量(mg)12.2012.0612.1512.2212.2112.09--吸收度A0.2850.2760.2800.2880.2890.277--总酚量(mg/粒)226.91221.81223.58229.08230.12222.12225.601.606、加样回收试验取同一批号已知含量的龙血通药物制剂(含量为225.6mg/粒)6份，每份约6mg，精密称定，置25ml棕色容量瓶中，分别加入7，4'-二羟基黄酮对照品5!1^，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，按样品测定方法测定，计算总酚的含量和加样回收率，结果见表5，表明本方法准确性高。表5加样回收试验结果序号取样量总酚含量加对照品实测量加样回收率平均加样RSD(g)(mg)量(mg)(mg)(%)回收率(％)(o/o)16.064.145.019.0197.1526.124.185.12'9.1897.5836.014.115.039.0698.4445.984.094.968.8596.0197.511.445.994.094.979.0599.7066.234.264.969.0396.19137、十批样品含量测定取本品十批进行含量测定，测定结果见表6。表6十批样品含量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>限度确定根据龙血通药物制剂10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含龙血素B不得少于165.Omg/粒(片)。二、龙血素B含量测定方法的研究与说明1、系统适应性研究(l)仪器与试药高效液相色谱仪，紫外检测器；龙血素B对照品，供含量测定用；乙腈(色谱纯)，水(超纯水)；(2)色谱条件①流动相的选择经研究，选择乙腈-l^HAC比例为40:60系统作为流动相；②测定波长的选择经研究，将测定波长定为278nm;③柱温30。C;④系统适用性研究经研究，在系统实验中龙血素B的理论塔板数不得低于4000。2、供试品溶液、对照品溶液的制备和阴性供试液的制备(1)供试品溶液的制备经研究，确定供试品制备方法为精密称取龙血通药物制剂内容物O.lg，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得；(2)对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含40iiiig的溶液，作为对照品溶液；(3)阴性供试液的制备取阴性样品(除主药外的辅料制得的样品)，参照供试液制备方法，制成阴性供试液。3、方法学考察[one](1)线性关系考察标准品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B16.78mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液；分别吸取对照品溶液0.5，1，2，4，6，8ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10iU，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，见表7和附图2;线性关系和回归方程回归方程为Y=28388X-11375;r=1;线性范围为8.39134.24iig/ml。表7龙血素B标准曲线实验数据进样浓度((ig/ml)8.3916.7833.5667.12100.68134.24峰面积积分值(Y)218886475202935168.51896925.52853442.56221773(2)精密度试验取C=86.72ug/ml的标准品，连续进样6次测定峰面积，结果见表8，结果表明精密度较好。表8精密度试验结果序号123456峰面积1886982194168319731021941912120069911998140RSD%2.24[OH6](3)稳定性试验取样品，分别在配置后0、1、2、4、8、12小时测定，结果见表9，表明供试品在12小时内稳定。表9稳定性考察数据:0149]测定时间(h)0124812浓度(ug/ml)18.87319.27419.46919.34019.39919.402RSD%1.12[O巧O](4)重复性试验精密称取同一批号样品5份，测定，每次进样101，结果见表10，结果表明方法重复性较好。表IO重复性试验结果:0153]序号12345称样量(g)0.206640.201280.206950.205400.20568含量(mg/g)4.624.924.814.844.73平均含量(mg/g)4.78RSD%2.39(5)加样回收试验精密称取样品(龙血素B含量为4.78mg/g)5份，每份0.lg，分别加入浓度为0.1678mg/ml的龙血素B对照品溶液2ml，按照供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率，结果见表ll，平均回收率为99.95%。表ll加样回收试验结果15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(6)样品含量测定及含量取十批本品，按说明书中含量测定项下龙血素B的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行十批成品中龙血素B的含量测定，结果见下表12。表12龙血通药物制剂中龙血素B含量测定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>限度确定根据龙血通药物制剂10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含龙血素B不得少于1.50mg/粒(片)。三、指纹图谱测定方法的研究与说明1、概述龙血通药物制剂由龙血竭单味药材组成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效，用于血瘀引起的中风。为了更全面、有效的控制龙血通药物制剂的质量，提高中药口服制剂的质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，发明人参照中药注射剂指纹图谱的要求，对龙血通药物制剂指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察。在对多批龙血通药物制剂指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了龙血通药物制剂的指纹图谱标准草案，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制药物制剂质量的目的。对所测得的指纹图谱的辨认，发明人采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经多次试验研究，且通过与计算相对保留时间及相对保留峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。所以发明人采用该软件做为龙血通药物制剂指纹图谱相似度计算软件。2、指纹图谱标准研究说明(1)参照物溶液的制备根据对龙血通药物制剂成分的分析，选择龙血素B作为参照物；[OWO](2)供试品溶液的制备经研究，最终确定龙血通药物制剂指纹图谱测定供试品的制备方法为取装量差异项下的龙血通药物制剂内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加50%甲醇25ml，超声(250W、40KHz)30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得。(3)检测方法①仪器和试剂仪器高效液相色谱仪，多波长紫外_可见检测器，全自动进样器，色谱工作站，色谱柱，流动相为A:0.1X的磷酸和B:甲醇，梯度洗脱，洗脱顺序为时间(min)A%(0.1%磷酸)B%(乙腈)07030502080602080流速为0.7ml/min;检测波长为280nm;论板数按参照物(龙血素B)峰计算，应不低于6000;试剂甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。②色谱柱经试验考察，发现WatersXterraC188色谱柱对制剂中各成分分离效果最好，因此选择用该类型色谱柱作为龙血通药物制剂指纹图谱测定专用色谱柱。③测定波长发明人检测了五个波长下的指纹图谱，经比较分析，确定280nm为指纹图谱的检测波长，在该波长下的指纹图谱中，除已知成分龙血素B能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好；(4)稳定性试验取龙血通药物制剂成品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔3小时测定一次其指纹图谱，共测6次，结果见表13，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于O.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求。表13稳定性分析结果(参照文件名为龙血通药物制剂对照图谱.Sep)时间数据文件相似度(参照)相似度(对照)对照图谱龙血通药物制剂对照图谱.Sep1.0000.9570小时SIGNAL01.cdf0.9340.9973小时SIGNAL01.cdf0.9340.9976小时SIGNAL01.cdf0.9340.99717<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(5)精密度试验取龙血通药物制剂，按本发明中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定；测定结果见表14、15、16;结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求，表明该方法精密度良好。表14精密度考察结果(占总峰面积5%以上主要峰的保留时间)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表15精密度考察结果(占总峰面积5%以上的主要峰的峰面积)123456averRSD%AAAAAAAAs3593.4483580.9963605.3173578.0553593.4483600.0723591.8890.30i1307.4961291.5371288.7881290.7921307.4961314.4791300.0980.8521707.9291673.7191693.9461689.4941707.9291715.2521698.045O.卯33106.2173065.9643093.7513078.1773106.2173115.0333094.2270.6141489.0401467.2301480.9351475.6811489.0401494.7501482.7790.6952143.1272139.5122150.7312134.2982143.1272137.9522141.4580.2662931.2372895.2672921.5602910.9432931.2382933.9202920.6940.52,74265.5164237.7154265.8734242.8684265.5194278.9824259.4120.37表16精密度分析结果(参照文件名为龙血通药物制剂对照图谱.Sep)次数数据文件相似度(参照)相似度(对照)对照图谱龙血通药物制剂对照图谱.Sep1.0000.9571SIGNAL01.cdf0.9330.9972SIGNAL01.cdf0.9330.9973SIGNAL01.cdf0.9330.9974SIGNAL01.cdf0.9330.9975SIGNAL01.cdf0.9330.9976SIGNAL01.cdf0.9330.997(6)重复性试验取龙血通药物制剂，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液5份，依法测定，结果见表17，计算相似度，相似度结果均不小于0.95，符合指纹图谱的技术要求。表17重复性分析结果(参照文件名为龙血通药物制剂对照图谱.Sep)次数数据文件相似度(参照)相似度(对照)对照图谱龙血通药物制剂对照图谱.Sep1.0000.9591SIGNAL01.cdf0.9310.99619<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>根据以上方法学考察结果，表明该方法测定龙血通药物制剂的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。(7)十批大生产成品的测定及标准指纹图谱的获得取十批成品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表18，结果计算相似度，用相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得"共有模式"作为标准指纹图谱，见附图3，并规定龙血通药物制剂指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于O.80。表18十批分析结果(参照文件名为龙血通药物制剂对照图谱.Sep)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>四、溶出度测定方法的研究说明1、溶出度测定指标成分的选择龙血通药物制剂所含成分类别较多，难以考察所有成分的溶出情况，为了建立溶出度测定方法，更好地控制产品质量，选择其中的一个成分作为指标性成分，进行溶出度考察，经研究，选择龙血素B作为溶出度测定的指标性成分。2、溶出介质的选择经考察本品在不同溶出介质中的溶出量，分别采用40%乙醇溶液、不同浓度氢氧化钠溶液、0.1%十二烷基硫酸钠的氢氧化钠溶液作为溶出介质，以龙血素B含量为指标性成分，进行溶出量测定；结果表明，在O.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液中溶出最好，故确定溶出介质为0.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液。3、溶出介质体积的选择经研究，选择溶出介质体积为100ml，以满足高效液相色谱仪的检测限。4、转速的选择在固定溶出介质和溶出介质体积的条件下，比较50r/min、75r/min、100r/min对龙血通药物制剂中龙血素B溶出量的影响。取本品，照溶出度测定法(中国药典2005年版二部附录XC第三法)，以0.1%十二烷基硫酸钠的O.025mol/L氢氧化钠溶液100ml为溶出介质，转速分别为每分钟50转、75转和100转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定，结果见表19。表19转速对溶出量的影响转速50r/min75r/min100r/min平均溶出量78.64%96.75%97.43%结果表明在相同的时间点转速对溶出量有一定影响，75r/min时溶出已能较好溶出，故选择转速为75r/min。5、溶出度测定方法的验证(1)系统适应性研究①仪器与试药高效液相色谱仪，紫外检测器，龙血素B对照品，甲醇(色谱纯)，水(超纯水)。②色谱条件流动相的选择经研究，选择甲醇-0.1%磷酸比例为53:47系统作为流动相；测定波长的选择经研究，将测定波长定为278nm;柱温30。C;系统适用性研究为确保定量分析的准确，经研究，在系统实验中龙血素B的理论塔板数不得低于10000。(2)验证试验①线性关系考察标准品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B5.04mg置100ml量21瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液；分别吸取对照品溶液0.6，1.3，2.5，5，10ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10iU，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。线性关系和回归方程结果表明，龙血素B在3.250.4ug/ml范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=28.819X-3.1591;r=0.9999;结果见表20、附图4。表20龙血素B标准曲线实验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>②精密度试验精密吸取龙血素B对照品溶液(浓度为25.2ug/ml)，连续进样6次，每次10ul，测定峰面积，结果见表21，结果表明精密度较好。表21精密度试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>③稳定性试验取本品，研细，取约0.3g，精密称定，以0.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液100ml为溶剂，搅拌使溶解，分别在配置后0、l、2、4、8、12小时测定峰面积，结果见表22，结果表明供试品在12小时内稳定。表22稳定性考察数据<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>重复性试验取本品，研细，取6份，每份约0.3g，精密称定，按稳定性试验项下的方法制备供试液，每次进样10yl，测定峰面积，结果见表23，结果表明方法重复性较好。表23重复性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>⑤加样回收试验精密称取同一批号已知含量的龙血通药物制剂(龙血素B含量为6.25mg/g)6份，每份约0.15g，分别加入浓度为0.906mg/ml的龙血素B对照品溶液lml，按稳定性试验项下的方法制备供试液，每次进样10iU，测定峰面积，计算回收率，结果见表24，平均回收率为97.133%。表24加样回收试验结果序号取样量(g)样品含量(mg)加对照品量(mg)实测量(mg)加样回收率(%)平均加样回收率(%)RSD(%)10.151350.9461.80795.2420.151120.9451.83398.130.149620.9350》061.81196.7997.1331.5440.145580.911.7997.1450.150760.9421.81196.0760.146850.9181.81999.46⑥溶出度均一性试验采用含0.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液为溶出介质，对同一批号本品进行溶出度均一性考察。测定方法取6—粒样品，照溶出度测定法(中国药典2005版二部附录XC第三法)以0.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液为溶出介质，转速为75r/min，依法操作，考察在不同取样时间4、6、8、10、15、20、30、45min的溶出度，每次取样1.0ml，及时补充等量溶出介质，溶液经离心处理，注入高效液相色谱仪，测定龙血素B含量，计算出累计溶出百分率；结果见表25，并绘制溶出曲线，见附图5。表25累积溶出量(050521)溶\取样、出\时^-^^4min6min8min10min15mhi20min30min45min145.389969.136584.836186.571195.956996.637399.6427100.886242.448174.072879.706585.415195.014598.186598,6727100.573343.849872.183387.730887.973694.976298.7403100.697101.933447.224263.088980,517885.352690.850890.979393.098994.1062547.501169.788579.717181.892289.483691.49394.764991.4446644.041668.039576.938579.772987.875890.575494.208997.2161均值(％)45.075869.384981.574584.496392.359694.435396.847597.6933RSD(0/o)4.454.974.423.313.353.693.023.93⑦溶出度测定重现性试验采用含0.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液为溶出介质，分别对本品进行溶出度重复性考察；测定方法同上，结果见表26、27，并绘制溶出曲线，见附图6、7。表26累积溶出量(050522)溶\取样■出\时4min6min8min10miri15min20min30min45min140.574261.275169.786876.039286.08788.976592.228892.3764242.725168.718974.371979.976685.825688.107994.478395.8689342.33467.802576.428282.265587.338991.705494.705896細1441.674161.773374.658677.936890.104991.697796.654398.083143.352462.010173.76581.865687.000992.14793.286892.9871645.185664.783978.593587.255190.056292.713896.725591.8876均值(％)42.640964.394074.600780.889887.735690.891494.68094.5339RSD(%)3.67664.60473.59734.41271.97761.88571.72872.388123<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>结论由试验结果可知，龙血通药物制剂在O.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液中释药迅速，拐点均在15分钟左右，45分钟时已达平台，表现出较为一致的溶出曲线；故可确定龙血通药物制剂溶出度限度为本品在O.1%十二烷基硫酸钠的0.025mol/L氢氧化钠溶液中，45min时溶出不少于75%。本发明的有益效果1、本发明提供了对龙血通药物制剂中总酚和龙血素B两种成分含量测定的方法，这些方法在原有的质量标准中都没有，对这两种成分的含量进行检测，可以更加真实地反应龙血通药物制剂的质量；2、本发明还提供了一种龙血通药物制剂的标准指纹图谱及其应用，这种指纹图谱的检测方法可以全面地反应龙血通药物制剂的质量，对控制龙血通药物制剂的质量大有帮助；3、本发明还提供一种龙血通药物制剂溶出度的测定方法，测定药物的溶出度，可以更加严格地控制药物的质量；4、本发明的提供的方法具有良好准确性、稳定性和重复性，可以应用于大工业生产中，是非常好的质量控制方法。附图1:7，4'-二羟基黄酮标准曲线附图2:龙血素B标准曲线附图3:龙血通药物制剂的标准指纹图谱附图4:龙血素B标准曲线附图5:龙血通药物制剂(050521)累积溶出曲线附图6:龙血通药物制剂累积溶出曲线附图7:龙血通药物制剂累积溶出曲线具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例1:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含28g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在760nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为050524的本品8mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺lg，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用15X的乙醇40ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇85ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在760nm处，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每粒含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1Q04)计，为170.0mg;实施例2:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每lml中含32iig的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为050528的本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20X的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，在780nm处，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每粒含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1Q04)计为168.0mg;实施例3:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含36g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在800nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为050530的本品15mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺3g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用25X的乙醇60ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇110ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，在800nm处，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每粒含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1Q04)计为169.5mg;实施例4:龙血素B的的含量测定方法照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为30:55为流动相，流速0.8ml/min，检测波长为270nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含40iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为050524的本品O.lg，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每粒含龙血素B(C18H2。05)为1.55mg。实施例5:龙血素B的的含量测定方法照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制各取批号为050528的本品0.2g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各101，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每粒含龙血素B(C18H2。05)为1.60mg。实施例6:龙血素B的的含量测定方法照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为50:65为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为285nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为050530的本品0.3g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各201，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每粒含龙血素B(C18H2。05)为1.62mg。实施例7:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性AgilentllOO液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.5ml/min，检测波长为270nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为050524的本品内容物，研细，取约0.4g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10iU，分别注入液相色谱仪，测27定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰O.45，2号峰0.50，3号峰0.60，4号峰0.70，5号峰0.80，6号峰O.91，S号峰1.00，7号峰1.12，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.85。实施例8:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性Agilent1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为050528的本品内容物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰O.50，2号峰0.55，3号峰0.66，4号峰0.73，5号峰0.80，6号峰0.98，S号峰1.00，7号峰1.15，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.88。实施例9:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性Agilent1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.8ml/min，检测波长为290nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为050530的本品内容物，研细，取约0.7g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；28e.测定结果供试品指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰O.52，2号峰0.58，3号峰0.68，4号峰0.72，5号峰0.82，6号峰O.98，S号峰1.00，7号峰1.16，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.90。实施例10:溶出度测定参照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例为55:45为流动相；检测波长为275nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含10iig的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取批号为050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟70转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液10ii1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每粒的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B(C^H2。05)计为80%。实施例ll:溶出度测定参照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例为53:47为流动相；检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含15iig的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取批号为050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟75转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液10ii1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每粒的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B(C^H2。05)计为83%。实施例12:溶出度测定参照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例为50:45为流动相；检测波长为280nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不29低于10000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含20iig的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取批号为050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟85转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液20ii1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每粒的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B(C^H2。05)计为82%。权利要求一种含有龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法，其特征在于采用以下方法中的任意一种或几种(1)采用紫外-可见分光光度法检测，药物制剂每单位剂量含总酚以7，4′-二羟基黄酮计，不得低于165.0mg；(2)采用高效液相色谱法检测，药物制剂每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg；(3)采用高效液相色谱指纹图谱检测，药物制剂的标准指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.40～0.60，2号峰0.42～0.65，3号峰0.55～0.78，4号峰0.60～0.85，5号峰0.70～0.95，6号峰0.82～1.15，S号峰1.00，7号峰1.01～1.30，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；(4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法检测，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75％。2.如权利要求1所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸；照紫外-可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；C.供试品溶液制备与测定法取本品，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液lOml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。3.如权利要求2所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.标准曲线的制备量取对照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液lOml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。4.如权利要求3所述含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液O，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20%的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每单位剂量含总酚以7，4'-二羟基黄酮计，不得低于165.Omg。5.如权利要求1所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸水溶液为流动相；b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；C.供试品溶液的制备取本品，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。6.如权利要求5所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为3050:5070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm;b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成lml含40iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，取约O.10.3g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520iU，注入液相色谱仪，测定，即得。7.如权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.Oml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品0.2g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各lOiU，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg。8.如权利要求1所述指纹图谱测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A:0.1%的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；C.供试品溶液的制备取本品，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。9.如权利要求8所述指纹图谱测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.41.Oml/min，检测波长为250300nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得。10.如权利要求9所述的指纹图谱的应用，其特征为参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各lOiU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。11.如权利要求1所述溶出度测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-O.1%磷酸水溶液为流动相；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成参照物溶液，C.供试品溶液的制备取本品，以十二烷基硫酸钠与氢氧化钠溶液为溶剂，旋转使溶出，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。12.如权利要求11所述指纹图谱测定方法，其特征在于参照高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-O.1%磷酸水溶液比例为5055:4550为流动相；检测波长为275280nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含1020iig的溶液；c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟6585转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液520ia，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。13.如权利要求12所述指纹图谱测定方法，其特征在于参照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-O.1%磷酸水溶液比例为53:47为流动相；检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中含15iig的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典2005年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟75转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液lOia，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每单位剂量的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75X。14.如权利要求113所述的龙血竭药材提取物的药物制剂，其特征在于该药物制剂的剂型为包括但不仅限于胶囊剂、片剂、丸剂、软胶囊的常规药物制剂。全文摘要本发明提供了一种含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法，该方法可以采用以下四种质量控制方法的任意一种或几种(1)采用紫外-可见分光光度法对7，4′-二羟基黄酮进行含量测定；(2)采用高效液相色谱法对龙血素B进行含量测定；(3)采用高效液相色谱法进行指纹图谱检测；(4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行溶出度检测。本发明提供的质量控制方法，准确，精密，稳定性好，能够有效地控制含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量。文档编号G01N21/33GK101780190SQ20091000964公开日2010年7月21日申请日期2009年1月20日优先权日2009年1月20日发明者刘涛,吴云,孙永城,屠鹏飞,徐玉玲,毕宇安,王振中,章晨峰,萧伟,邹艳萍申请人:江苏康缘药业股份有限公司