专利名称：一种加压毛细管电色谱检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法
技术领域：
本发明属于食品安全-兽药残留检测领域，涉及一种采用毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物的分析方法，具体的说是采用毛细管电色谱法同时测定鱼肉中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑五种磺胺类药物的方法。
背景技术：
磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。因其具有抗菌谱广、抗球虫和价廉易得等特点，至·今仍在兽医临床和畜牧业中广泛应用。磺胺类药物是国家允许限量使用的一类抗菌药物，可被饲料生产者采用。目前，国家农业行业标准《NY 5070无公害食品水产品中鱼药残留限量》中规定，磺胺类药物在水产品组织中的最高残留总量为O. lmg/kg。该药在体内的代谢时间较长，当达到一定浓度时就会对人体的机能产生损害，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血，磺胺二甲基嘧啶等还存在潜在的致癌性。因此，为保护消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的水产品中磺胺类药物的检测方法是十分紧迫的。目前磺胺类药物的检测方法主要包括免疫学方法、微生物学法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用法、薄层色谱法和毛细管电泳法等。我国农业部颁布的检测方法有“动物源食品中磺胺类药物残留检测方法-高效液相色谱法”、“动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测方法-高效液相色谱法”。这些方法优缺点各异微生物学法检测速度较快，但检测灵敏度和特异性较差；薄层色谱法灵敏度、选择性较好，但重复性不够好；毛细管电泳最大的不足是其进样量小，限制了灵敏度、无法测定μ g/kg级或更低浓度的残留量。液质联用仪虽然检测灵敏度和分辨率很高，但一般实验室很难配置这样的仪器。加压毛细管电色谱(pCEC)是近几年来兴起的一种微分离技术，它结合了电泳的高效性和高效液相色谱的保留机制，通过在填有HPLC填料的毛细管色谱柱的两端施加高压，提高了样品的分离能力和效率，使以前需很长时间才能出现的峰现在只需很短时间就可出现，并且试剂和样品的消耗量减少，近几年开始也用于兽药残留的分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，能同时测定鳗鱼中多种磺胺类药物残留，具有快速、准确、灵敏度高的特点。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤I)样品制备将鳗鱼肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存；2)样品预处理将样品经乙酸乙酯离心提取，HLB固相萃取柱净化，再经O. 20
O.24 μ m滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；3)配制磺胺标准溶液；
4)采用加压毛细管电色谱进行分析以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用4 6mmol/L，pH 5. 5 6. 5的磷酸氢二钠溶液与乙腈的混合液，其体积比为80 60 20 40;在所加电压为9 llkv，柱压为7.5 8MP，柱温为常温，流动相的流速40 60 μ L/min ;进样量0. 9 I. I μ L的工艺条件下，用紫外检测器在波长270nm处进行检测，同时绘制标准曲线；5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。作为改进，所述步骤2)中的乙酸乙酯离心提取的具体过程为准确称取5±0. Olg均质样品置于50mL离心管中，加入4 6g干燥的无水硫酸钠和10 20mL乙酸乙酯，用涡旋混合器充分混匀2 3min，4000 6000r/min离心8 12min，将上清液转移到IOOmL分液漏斗中，再向原离心管中加入10 15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入10 20mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，25 35°C真空旋转蒸至无液体残留，用O. 8 I. 2mL乙腈、I. 5 2. 5mL体积分数为O. 9 I. I %磷酸溶液溶解得到提取液。作为改进，所述步骤2)中的HLB固相萃取柱净化的具体过程为用4 6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4 6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的乙腈，将提取液加到小柱上，保持I. 5 2. 5mL/min的流速过柱,再依次用4 6mL水、2 4mL体积分数I. 8
2.2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用5 7mL 95%乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用O. 9 I. ImL流动相定容。作为改进，所述磺胺为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲异噁唑五种，所述磺胺标准溶液的配制为称取各磺胺类标准品10. 0mg±0.01g，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。再改进，所述磷酸氢二钠溶液为5mmol/L，pH 6. 0，所述流动相的配制过程为取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氢钠按体积比30 60 10的比例配制流动相，超声波脱气20 40min。再改进，所述磺胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成O. 5 5μ g/mL的标准工作液。进一步优选，所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C18，内径100 μ m，有效柱长20cm，填料粒径3 μ m 0DS。最后,所述步骤4)的所述电压为IOkv,柱压为7. 8MP,柱温为常温,流动相的流速50 μ L/min ;进样量:1. O μ L。与现有技术相比，本发明的优点在于采用液-液萃取的经典样品处理方法结合固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少鱼肉组织中杂质的含量和基质干扰；同时采用低毒溶剂乙酸乙酯代替二氯甲烷，减少了实验过程中有机溶剂对操作者和环境的污染；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以减少5种磺胺类药物的保留时间，并且灵敏度得到提高，可以同时分离检测5种磺胺类药物，不仅能满足鳗鱼磺胺类残留量的常规检测，也可用于其它水产品样品中的磺胺类药物的测定。本发明的分析方法高效、准确，有机试剂消耗少，有较高的灵敏度，可以满足日常检测磺胺类药物的需求。
图I是5种磺胺类药物标准品的毛细管电色谱图，加-IOkV电压时的出峰顺序图，其中I.磺胺嘧啶2.磺胺间甲氧嘧啶3.磺胺甲噁唑4.磺胺二甲异噁唑5.磺胺喹噁啉；图2是不加电压的uHPLC图，其中I.磺胺嘧啶2.磺胺二甲异噁唑3.磺胺间甲氧嘧啶4.磺胺甲噁唑5.磺胺喹噁啉；图3是市售鱼肉样品的检测电色谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。I样品制备将鳗鱼肌肉组织样品，用剪刀剪碎后用高速均质器均质，冷冻保存。2样品前处理(I)提取将样品解冻，准确称取5g(精确至O. Olg)均质样品置于50mL离心管中，加入5g干燥的无水硫酸钠和15mL乙酸乙酯,用润旋混合器充分混勻2min, 5000r/min离心lOmin，将上清液转移到IOOmL分液漏斗中，再向原离心管中加入15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入15mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，30°C真空旋转蒸至无液体残留，用ImL乙腈、2mL体积分数为I %磷酸溶液溶解。(2)净化预先用5mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用5mL超纯水冲洗小柱，转移过多的乙腈。将提取液加到小柱上，保持2mL/min的流速过柱，再依次用5mL水、3mL体积分数2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用6mL95%乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分2mL、2mL、2mL分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干,用ImL流动相定容，溶液经O. 22 μ m滤膜过滤后，供毛细管电色谱测定。3标准溶液的配置磺胺标准储备溶液称取各磺胺类标准品10. Omg (准确至O. Img)，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液，避光冷藏保存。临用前用流动相稀释成标准工作液。4流动相配制及色谱条件取乙腈、重蒸水、磷酸二氢钠(50mmol/L)按30 : 60 : 10 (V/V/V)的比例配制流动相，超声波脱气30min后备用。所用色谱条件(I)色谱柱选用规格EP-100-20/45-3-C18，内径100 μ m，有效柱长20cm，填料粒径3 μ mODS 柱；(2)紫外检测波长270nm ；(3)流动相乙腈:磷酸氢二钠(5mmol/L, pH 6. O) = 30 : 70 (V/V),(4)流速50 μ L/min ;进样量1 μ L ；(5)柱压电压-10kV，柱压为7· 8MP，柱温为常温。5工作曲线和检出限
用流动相稀释标准储备溶液为O. 5 5 μ g/mL混合标准工作溶液，按试验条件进行检测，绘制标准曲线。试验表明，5种磺胺在O. 5 5 μ g/mL范围内线性良好，线性回归方程、相关系数及检出限列于表I。表I 5种磺胺类药物标准工作曲线与检出限
权利要求
1.一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤 1)样品制备将鳗鱼肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存； 2)样品预处理将样品经乙酸乙酯离心提取，HLB固相萃取柱净化，再经O.20 O. 24 μ m滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用； 3)配制磺胺标准溶液； 4)采用加压毛细管电色谱进行分析以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用4 6mmol/L，pH 5. 5 6. 5的磷酸氢二钠溶液与乙腈的混合液，其体积比为80 60 20 40;在所加电压为9 llkv，柱压为7.5 8MP，柱温为常温，流动相的流速40 60μ 7π η ;进样量0. 9 I. I μ L的工艺条件下，用紫外检测器在波长270nm处进行检测，同时绘制标准曲线； 5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的乙酸乙酯离心提取的具体过程为准确称取5±0. Olg均质样品置于50mL离心管中，加入4 6g干燥的无水硫酸钠和10 20mL乙酸乙酯，用润旋混合器充分混勻2 3min,4000 6000r/min离心8 12min，将上清液转移到IOOmL分液漏斗中，再向原离心管中加入10 15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入10 20mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，25 35°C真空旋转蒸至无液体残留，用O. 8 I. 2mL乙腈、I. 5 2. 5mL体积分数为O. 9 I. I %磷酸溶液溶解得到提取液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的HLB固相萃取柱净化的具体过程为用4 6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4 6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的乙腈，将提取液加到小柱上，保持I. 5 2. 5mL/min的流速过柱，再依次用4 6mL水、2 4mL体积分数I. 8 2. 2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用5 7mL 95% (体积比)乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用O. 9 I. ImL流动相定容。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述磺胺为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲异噁唑的五种，所述磺胺标准溶液的配制为称取各磺胺类标准品10. 0mg±0. Olg，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述磷酸氢二钠溶液为5mmol/L，pH6.0，所述流动相的配制过程为取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氢钠按体积比30 60 10的比例配制流动相，超声波脱气20 40min。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述磺胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成O. 5 5 μ g/mL的标准工作液。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C18,内径 100 μ m,有效柱长 20cm，填料粒径 3 μ m 0DS。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤4)的所加电压为10kv，柱压为7.8MP，柱温为常温，流动相的流速50μ L/min ;进样量1. O μ L。
全文摘要
本发明涉及一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于先将样品经乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱净化，0.22μm滤膜过滤后使用，采用加压毛细管电色谱进行分析，以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作检测柱，紫外检测器在270nm处进行检测，流动相为乙腈∶磷酸二氢钠(5mmol/L，pH 6.0)＝30∶70(V/V)。本发明采用液-液萃取的经典样品处理方法结合固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少鱼肉组织中杂质的含量和基质干扰；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以减少5种磺胺类药物的保留时间，并且灵敏度得到提高，可以同时分离检测5种磺胺类药物，不仅能满足鳗鱼磺胺类残留量的常规检测，也可用于其它水产品样品中的磺胺类药物的测定。
文档编号G01N30/74GK102955008SQ201110246660
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者王阳光, 欧阳小琨, 董洁莹, 杨立业, 李大东 申请人:浙江海洋学院