专利名称：一种测定酶法脱毛液中总糖含量的方法
技术领域：
脱毛工续是制革生产中必须进行的一步，但传统的硫化物脱毛对环境污染严重。酶法脱毛可减少污染，但通常应用的蛋白酶，对皮胶原本身造成相当的损伤，所以，酶法脱毛必须严格控制其进程。脱毛液中糖含量是研究和控制酶法脱毛的一种重要手段。本发明采用硫酸-苯酚法测定其中羟基糖含量，采用乙酰丙酮法测定其中氨基糖含量，从而计算总糖含量。本发明应用于皮革生产中。
背景技术：
制革工艺中的脱毛是通过物理、化学或者生物处理的方法使毛和表皮脱离真皮的过程。同时，生皮的胶原纤维间含有很多的可溶性蛋白和纤维间质，干燥后，它们把纤维粘在一起，使生皮板硬，不耐弯折，因此，脱毛过程中还要去除这些纤维间质，松散胶原纤维，为后续工艺创造良好条件。传统的灰碱法脱毛，脱毛干净、操作简便、容易控制、质量稳定，且成本较低。但污染严重，脱毛是制革准备阶段的主要污染源，约占整个准备阶段的84% B0D,75% C0D,85%TDS,还有有毒的硫化物产生。为了减少灰碱法的污染，采用了酶法脱毛。酶脱毛作为一种生物法，无疑更符合当今世界环保的理念。早期的“发汗法”可能是最古老的酶脱毛技术。所谓“发汗法”就是利用附着在皮上的微生物菌株，在一定条件下，对动物皮组织进行作用，使毛和真皮的联结松开，从而脱毛。本质上是附在皮上的腐败细菌发酵生长，所释放出的酶产生了脱毛作用。澳大利亚细绵羊皮采用发汗法脱毛，可以保证贵重的羊毛不受损伤。后来的学者从发汗法脱毛的原料皮上分离到多种具有脱毛能力的菌株。如从澳大利亚细绵羊毛中分离出普通变形杆菌、无色杆菌、黄杆菌，具有脱毛能力。英国的原料皮上分离出普通变形杆菌；美国的原料皮分离的则是极毛杆菌。日本的农田春和二见明分离出枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。这些菌株发酵得到的酶制剂对羊皮脱毛能力良好。真正现代酶脱毛技术的创始人则是德国人R5hm，他于1908年发明了软化酶Oropon, 1910年发明了酶脱毛工艺“Arazym Process”,其使用的酶是以动物胰脏为主的酶制剂，开创了现代酶技术在皮革中应用的先河。该技术在美国用于山羊和小山羊皮的脱毛，直至1930s。二战以后，随着工业微生物生产技术的突破，大量来自于细菌、霉菌、放线菌的新型酶制剂出现，取代了来自动植物的酶制剂，酶脱毛再次受到重视。在此期间，Burton、Reed,美国东部地区农业研究中心的Cordon、Bailey、Cooper,意大利的Simoncini,澳大利亚的Yates,德国的SchlSsser、Heidemann,苏联的色色金娜，以及印度和日本的学者，运用当时的生物知识、测试手段，对酶脱毛技术从工艺到原理进行了深入的研究，取得重大进展。但由于酶脱毛过程控制难、对皮损伤大、价格高等原因，到1970年后，第二次遭到冷落。值得一提的是，此时，由于特殊的原因，我国的酶脱毛技术曾经红火一时。
进入90年代，由于世界各国对环境保护的日益重视，生物技术的重大突破，酶脱毛技术第三次受到重视。最早用于皮革工业的酶制剂正是来自动物胰脏的胰酶，它是一种蛋白酶。早期的酶脱毛多用胰酶，德国、美国称为“Arazym”，苏联则称为“奥罗邦”，在山羊皮上取得一定效果，其它皮张效果不佳，粒面容易产生管皱和松面。也有从植物中提取蛋白酶来脱毛的。最早的是从木瓜(Carica papaya)中提取木瓜蛋白酶，具有一定的脱毛能力，但成本太高。1953年，印度的S. Bose等从Calotropisgigantea(—种巨大牛角瓜)提取植物蛋白酶“马塔尔”乳液,从Eleusine coracana(—种蟋蟀草属植物)提取淀粉酶“拉特然”乳液，用于脱毛，适用于印度小公牛皮、山羊皮。据报道，用植物提取液进行酶脱毛在印度至今仍有应用。Rose、Chellan等于2004年在美国申请了相类似的专利。毫无疑问，脱毛用酶制剂的主要来源是微生物。细菌、霉菌、放线菌中都有一些菌株可产生具有脱毛能力的蛋白酶。早期报道的细菌有覃状芽抱杆菌(Bacillus mycodies)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megatherium)、马铃薯芽抱杆菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)等。放线菌有白色链霉菌(St. albus)、抗生素链霉菌(St. antibioticus)、金色链霉菌(St. aureus)、灰色链霉菌(St. grseus)等。霉菌有黑曲霉(Asp. niger)、米曲霉(Asp. oryzae)、黄曲霉(Asp. f lavus)等。但是，蛋白酶脱毛的同时，不可避免会损伤真皮的结构，影响皮制品的使用性能，这严重影响了酶脱毛的应用。必须对酶脱毛的机理和过程进行深入的研究和严格的控制。自从酶用于皮的脱毛，人 们就开始研究酶脱毛的机理。从开始的组织切片、光学显微镜观察，到后来的化学水平、电子显微镜观察、生物技术的运用等，不断深入，取得许多成果。但由于原皮结构的复杂性、脱毛用酶的复杂性，所得结论比较分散，甚至相互矛盾。由于评判、测试困难，许多理论证据不够充分，还有待进一步研究。酶脱毛达到的主要目的倒是基本公认的，S卩①毛和皮分离，从而去毛。②除去纤维间质，松散真皮中胶原结构，为后续工艺中各种试剂的渗透创造良好条件。整个酶脱毛过程涉及的几个主要问题，如①酶作用于皮的哪一部分？作用于什么成份？②什么酶有作用？③用何种底物测定酶活，可以表征酶的脱毛能力？④酶是如何渗透到脱毛作用点的？⑤酶对皮的损伤是如何产生的？不同研究者存在着一定的分歧。芭芭金娜通过组织切片法，研究发现在酶脱毛过程中，毛囊中的毛根、马氏层、乳头层的肥大细胞等处的类粘蛋白逐渐被水解，致使毛、皮分离，牛羊皮的表皮层被溶解；同时，整个原皮中的类粘蛋白也被水解，胶原纤维得以松散[79]。Yates认为酶通过水解粘蛋白、类粘蛋白，破坏了真皮和表皮的连接,破坏了毛根和基膜的连接。透射电镜研究表明，酶破坏了毛根、毛球和毛乳头细胞之间的“桥粒”联接，随着“桥粒”被打开，细胞相互分离，毛根鞘失去对毛根的包裹作用，毛球失去对毛乳头的紧钳作用，毛可以从毛囊中脱落出来。李志强教授最近研究发现，基膜及其周围组织的蛋白提取物被广泛水解，与脱毛有关。总之，酶脱毛过程中，有大量粘蛋白、类粘蛋白或者其它蛋白质被水解，导致脱毛，酶溶液中总蛋白质浓度增加，总蛋白质浓度和脱毛进程直接相关。另一方面，由于粘蛋白有蛋白部分和粘多糖部分组成，粘蛋白被水解，除了蛋白质脱落外，多糖部分也溶入酶液。所以，脱毛液中糖含量增加。芭芭金娜认为脱毛液中的还原糖含量和脱毛能力有关，糖含量越高，即脱毛能力越强[79]。Cordon则认为糖含量和脱毛进程不相适应，证据不够充分[83]。金宝仲等则认为两者有联系，但关系不很明确。而且，粘蛋白中粘多糖的水解，使胶原结构得以松散，这一点是普遍承认的。Alexander认为糖含量可以作为反映胶原松散程度的指标。总之，一般情况下，脱毛溶液中的糖含量可以表征皮的松散程度指标，同时，也部分反映了整个脱毛进程。过去，主要是通过研究脱毛液中的蛋白质变化情况，来研究脱毛机理，对脱毛液中糖的分析不够重视，近年来对糖的分析逐渐多起来。糖和糖胺多糖的分析方法很多，包括光谱法、共振光散射法、圆二色性法、荧光法、高压液相法、毛细管电泳法、质谱法、电化学法等。无疑，光谱法是简单而最常用的方法，在皮革研究中，正是采用分光光度法来分析脱毛液中的糖含量。常用的比色法包括硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、硫酸-咔唑法、邻甲苯胺法、3，5-二硝基水杨酸法等。但是，这些方法仅仅分析了其中的羟基糖部分，而对氨基糖部分均忽略了。其计算出来的总糖含量是不全面的，有偏差的。本发明采用新的方法来计算总糖含量。本研究综合考虑了各个方面，认为分光光度法应用于脱毛液中，切实可行、方便快捷。选择了硫酸-苯酚法 和3，5-二硝基水杨酸法进行了研究。阐述了分析方法的适用性、稳定性和操作要点。由于粘蛋白中的糖有一半是氨基糖，而上述比色方法均不能测定氨基糖，故用对2-氨基糖选择性很强的乙酰丙酮法来测定氨基糖。几种方法相结合，可以反映脱毛液中的糖含量，并能估算糖链的平均大小，可用于进一步研究酶法脱毛的机理。
发明内容
本发明采用硫酸-苯酚法来测定脱毛液中羟基糖含量，乙酰丙酮法来测定氨基糖含量，两者相加计算总糖含量。
具体实施例方式实施例一1.脱毛猪皮充分水洗，并脱脂后，经过碱膨胀，切成4cmX4cm的皮块，用于脱毛。酶用量按每克皮400u计，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂缓冲溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 :1配制。皮块和酶按用量放入广口瓶中，盖紧，32°C，振摇器中振摇。每隔一定时间，吸取酶液，测定脱毛液中糖含量。2.硫酸-苯酚法测定羟基糖含量(I)标准曲线的确定分别取葡萄糖标准溶液O. 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5ml置于干燥的比色管中，加水至O. 5ml，分别加入5%苯酚溶液O. 5ml，摇匀，快速加入2. 5ml浓硫酸，充分振摇，于25 30°C放置20min，以空白为参比调零，于490nm测量吸光度，并作标准曲线。(2)脱毛液的测定脱毛液稀释10倍，再取O. 5ml进行测定，并以O时酶液为空白。(3)羟基糖含量的计算脱毛液的测定结果用2.⑴中的标准曲线计算羟基糖含量。3.乙酰丙酮法测定氨基糖含量(I)标准曲线的确定分别取盐酸氨基葡萄糖标准溶液O、1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0ml，置于干燥的比色管中，各加水至5. 0ml，再加入1. Oml乙酰丙酮溶液，摇匀，沸水浴中加热25min，取出，冷却。加对-二甲氨基苯甲醛溶液1.0!111，摇勻，601保温lhr，放置冷却。以空白为参比调零，于525nm测量吸光度，并作标准曲线。(2)脱毛液的测定将脱毛液用6M盐酸100°C水解6hr，用6M氢氧化钠中和至pH7. 0，并以适量体积定容。取5. Oml进行测定，并以O时酶液为空白，(3)氨基糖含量的计算；
脱毛液的测定结果用3.⑴中的标准曲线计算氨基糖含量。4.总糖含量的计算将2中得到的羟基糖含量和3中得到的氨基糖含量相加即可得到总糖含量。实施例二1.脱毛牛皮充分水洗，经过碱膨胀，切成4cmX4cm的皮块，用于脱毛。酶用量按每克皮400u计，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂缓冲溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 I配制。皮块和酶按用量放入广口瓶中，盖紧，320C，振摇器中振摇。每隔一定时间，吸取酶液，测定脱毛液中糖含量。2.其它步骤同实施例一，即可得到总糖含量。
权利要求
1.本发明分别测定脱毛液中羟基糖含量和氨基糖含量，两者相加计算总糖含量。
2.(I)中测定脱毛液中羟基糖含量的方法是硫酸-苯酚法。
3.(I)中测定脱毛液中氨基糖含量的方法是乙酰丙酮法。
全文摘要
在皮革生产的脱毛工序中，测定总糖含量是研究和控制酶法脱毛的一种重要手段。本发明采用硫酸-苯酚法来测定脱毛液中羟基糖含量，乙酰丙酮法来测定氨基糖含量，两者相加计算总糖含量，克服了以往测定总糖含量时，忽略了氧基糖含量的缺点。本发明可用于皮革生产中的脱毛工序。
文档编号G01N31/22GK103063803SQ20111031938
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者宋健 申请人:江南大学