专利名称：一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生物工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系。
背景技术：
果葡糖浆是一种新型甜味 剂。果葡糖浆的甜度最高，相当于蔗糖I. 8倍，并且果葡糖浆具有类似蜜糖的风味和不易引起血糖升高的性能。当前，国内外需求量大，主要应用于食品领域的饮料、面包、奶制品、罐头、果糖和其它食品。淀粉是制备果葡糖浆的主要是原料。用不甜的淀粉为原料转变成具有甜味的葡萄糖，再通过异构化反应转变葡萄糖生成果糖，生产果葡糖浆(果糖和葡萄糖的混合物)。淀粉由直链和支链组成。支链由a-1，6糖苷键连接，而直链的糖分子之间由a -1，4糖苷键连接。在天然的淀粉质原料中，支链淀粉的含量约占70% 95%，而直链淀粉的含量< 30%。异淀粉酶(Isoamylase，E. C. 3. 2. I. 68)能专一性地分解支链淀粉中分支点的a-1，6糖苷键，将支链淀粉转化为直链淀粉，因此又称为脱支酶。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,E. C. 3. 2. I. 3)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化直链淀粉水解为葡萄糖。在异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的联合作用下，淀粉水解生成葡萄糖。木糖异构酶具有异构葡萄糖为果糖的功能。酶法生产果葡糖浆是果葡糖浆生产的主要途径。当前，酶法生产果葡糖浆的方法是先生产异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，通过异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用，将淀粉水解生成葡萄糖；然后，再用木糖异构酶异构葡萄糖为果糖，生产果糖与葡萄糖混合的果葡糖浆。这些酶的分别生产需要大量的人力和能耗。当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。
发明内容
本发明根据异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有联合水解淀粉生成果葡糖浆的作用(即异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成果葡糖浆的酶系)，市场上还没有异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的水解淀粉生成果葡糖浆的酶系产品；毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌是常用于表达外源蛋白的宿主菌，而通过分子生物学技术构建含异淀粉酶基因表达框架(说明.表达框架启动子-信号肽-基因-转录终止子)、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。用含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉为果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。本发明所采用的技术方案是I.克隆酶基因应用分子生物学技术，从假单胞杆菌(pseudomonas)基因组中扩增异淀粉酶基因，从曲霉(Aspergillus)基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因，从栖热菌(Thermus)基因组中扩增木糖异构酶基因。2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。3.构建如附图I的毕赤酵母表达载体、附图2的酿酒酵母表达载体和附图3的枯草芽孢杆菌表达载体。4.应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木 糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；应用电转化方法将含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架、木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。分别筛选高表达异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的毕赤酵母重组子、酿酒酵母重组子和枯草芽孢杆菌重组子作为含异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。5.分别发酵含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。本发明构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的优点体现于(I)针对异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶具有协同水解淀粉生成果葡糖浆的特性，即异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶是水解淀粉生成葡萄糖的酶系，而市场上需求这种酶系产品。本发明通过构建工程菌，应用工程菌生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶，一方面提供混合异淀粉酶、a淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的新产品，另一方面取代分别发酵含异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶，发酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生产葡萄糖淀粉酶，发酵含木糖异构酶基因的菌株生产木糖异构酶。即用一个发酵工序生产整个水解淀粉生成果葡糖浆的酶系取代用多个工序分别生产水解淀粉生成果葡糖浆的三种酶。达到节省了原材料、能耗和人力资源的作用。(2)毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，为其重组酶生产提供多种宿主选择。
附图I.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体
P.毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；P. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。附图2.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体P.酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选酿酒酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨节青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；S. cerevisiae rDNA.酿酒酵母的rDNA序列。附图3.含异淀粉酶基因表达框架、葡萄糖淀粉酶基因表达框架和木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体P.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. a因子信号肽；iso.假单胞杆菌的异淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.栖热菌的木糖异构酶基因；T.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽孢杆菌的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例I :I. I构建毕赤酵母表达载体I. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列、多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPGI. I. 2犹取基因①PCR扩增假单胞杆菌(Pseudomonas)的异淀粉酶基因引物I :5，CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3，[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A jATGATGATGATGATGATG
CTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]应用常规的细菌基因组DNA提取的方法提取假单胞杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②反转录PCR扩增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽)引物I:
权利要求
1.一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法，其特征在于，其具体步骤如下 1)、应用分子生物学技术克隆假单胞杆菌的异淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和栖热菌的木糖异构酶基因； 2)、分别构建含上述基因的表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体； 3)、将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母获得毕赤酵母重组子，将上述构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母获得酿酒酵母重组子，将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组子； 4)、筛选高表达以上所述的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的毕赤酵母重组子作为含假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，筛选高表达以上所述的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的酿酒酵母重组子作为含假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母工程，筛选高表达以上所述的异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶的枯草芽孢杆菌重组子作为含假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程； 5)、分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)。
2.根据权利要求I所述一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法制备水解淀粉生成果葡糖浆的酶系(异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶)产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法。属生物技术领域。首先分别克隆假单胞杆菌的异淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和栖热菌木糖异构酶基因；构建含上述三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母将表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将载体转化相应的宿主菌而获得工程菌。发酵毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖异构酶(水解淀粉生成果葡糖浆的酶系)。本发明用一道工序同时生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系，解决分别生产这三种酶的成本高而制约酶法生产果葡糖浆产业发展的问题，为市场提供上述酶系新产品，有利于加速酶法生产果葡糖浆产业的发展。
文档编号C12N9/34GK102747062SQ20121025183
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者尹慧祥, 张添元, 张爱联, 符仙, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所