专利名称：：用于颗粒状淀粉水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶的制作方法
技术领域：
：02本发明涉及淀粉水解方法，其用于在温度低于淀粉胶凝温度下，从在碾碎的植物材料中的淀粉获得可发酵糖，并且进一步涉及糖发酵以生产最终产品，例如乙醇。
背景技术：
：03淀粉是重要的原料，广泛用于工业目的，例如高果糖浆和乙醇的生产。在植物种子中淀粉形成主要储存糖类成分，并且淀粉颗粒通常是抗降解的。传统上，高温和/或酶的组合物己经被用于水解淀粉。淀粉水解酶，例如(x-淀粉酶(E.C.3.2丄l.)——其是内切作用水解酶，水解淀粉分子内部的a-l，4键，在工业中是最经常使用的。a-淀粉酶由植物、动物和微生物产生。用源自微生物源的a-淀粉酶，从植物种子进行淀粉水解、特别是从谷粒进行淀粉水解，在很多工业方法中是常规的，其中淀粉降解的第一步是淀粉水解为葡萄糖或淀粉水解为麦芽糖糊精。传统上，这些方法在高温下进行(例如，高于包含底物的淀粉的初始胶凝温度)(Corn:ChemistryandTechnology,WatsonS.A.等人编辑，(1991)AmericanAssociationofCerealChemists,Inc.禾卩TheAlcoholTextbook,第三版，Jacques等人编辑，(1999),NottinghamUniversityPress)。最近，工业上已经探索通过发酵使用低能量方法进行淀粉水解和生产醇(例如在低于植物材料中包含的淀粉的初始胶凝温度的温度下)(USP4,514,496、WO03/066826;WO04/081193;WO04/106533;04本发明涉及从磨碎的植物材料水解淀粉的方法，包括在温度低于该磨碎的植物材料中的颗粒状淀粉的初始胶凝温度下，使磨碎的植物材料与外源性植物(x-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任选的微生物a-淀粉酶的组合物接触，以获得可发酵糖。本发明进一步涉及在发酵微生物的存在下发酵该可发酵糖为最终产品。05在一个方面，本发明包括从磨碎的植物材料水解淀粉的方法，该磨碎的植物材料包含颗粒状淀粉，通过在温度低于颗粒状淀粉的淀粉胶凝温度下使磨碎的植物材料与外源性植物(x-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触而进行，以生产寡糖和生产可发酵糖。该方法也可以包括在发酵微生物存在下，在l(TC和4(TC之间的温度下，发酵可发酵糖10小时至250小时的一段时间，以生产醇。所述磨碎的植物材料可以为具有颗粒状淀粉的浆状物，该浆状物具有5。/。至60。/。之间的DS，或者可选地25%至40%之间的DS，或者可选地15n/。至45M之间的DS。a淀粉酶可以被加入0.001至30AAU/DS之间的量。06在其它方面，接触步骤也包括使磨碎的植物材料与微生物a-淀粉酶接触。温度可以在50。C至7CTC之间。植物a-淀粉酶可以是来自植物的a-淀粉酶，所述植物包括大麦、小麦、白高粱、黑麦、高梁、稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。优选地，所述植物材料是玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组，物。在一些重要的方面，所述植物是分级玉米(fractionatedcorn)。在一些方面，所述醇是乙醇，并且方法进一步包括回收乙醇。07在其它方面，本发明包括用于生产乙醇的方法，该方法通过如下进行在温度低于颗粒状淀粉的胶凝温度下，使从植物材料获得的、包含颗粒状淀粉的浆状物与能溶解颗粒状淀粉的外源性植物a-淀粉酶接触5分钟至24小时的一段时间，获得底物，以及在发酵微生物的存在下，在10'C至40'C之间的温度下，发酵该底物10小时至250小时的一段时间，产生乙醇。在一些方面，所述方法也包括回收乙醇。所述a-淀粉酶可以是例如包括下述的a-淀粉酶大麦、小麦、白高粱、黑麦、高梁、6稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。在一些方面，所述方法包括使浆状物与微生物a淀粉酶接触。所述接触步骤可以在50'C至7(TC之间的温度下进行。所述方法也可以包括，在发酵步骤之前使底物澄清。在一些方面，所述方法可以包括在接触步骤添加另外的酶，如葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。在一些优选的方面，所述另外的酶是植酸酶和/或蛋白酶。在一些方面，所述浆状物具有5-60%DS之间的颗粒状淀粉，或者可选地20-40"/。DS之间。在一些方面，所述方法包括使底物与水溶液接触，该水溶液包含涡流以在发酵步骤之前稀释。/。DS。所述颗粒状淀粉可以从玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组合物获得。08图1说明从大麦面粉(32。/。DS)经发酵时间(小时)产生乙醇(％v/v)，其经各种处理，包括STARGEN001(--);大麦AA+AnGA(-■-);大麦AA+TrGA(-*-)和大麦AA+HGA(-▲-)";09图2说明从大麦面粉(32。/。DS)经发酵时间(小时)产生乙醇(％v/v)，其经各种处理，包括STARGENOOl(--);HGA(-□-);大麦AA+STARGEN001(-)K-);大麦AA+HGA(-隱-);和对照(未添加酶)(--)。发明详述10除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语，与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同意义。11尽管与本文中所述的那些类似或等价的任何方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，但是描述的是优选的方法和材料。12现在，使用下面的定义和实施例，仅通过参考的方式对本发明进行详细描述。本文中提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，被明确地引入作为参考。定义13如本文中所使用，术语"淀粉(starch)"是指由植物复合多糖碳水化合物组成的任何物质，由具有式(C6H,oO丄的直链淀粉和支链淀粉组成，其中X可以是任何数。14术语"颗粒状淀粉(granularstarch)"是指粗淀粉，即在植物材料(例如，谷粒和根茎类)中发现的、自然形态的淀粉。15术语"干固体含量(ds)"是指基于干重以百分比(％)计的浆体中的总固体。术语"浆体(slurry)"是指含有不溶性固体的含水混合物。16术语"可发酵糖(fermentablesugars)"是指寡糖和单糖，其能通过使用发酵微生物的发酵被转化为最终产品。」17术语"糊精(dextrins)"是指短链的葡萄糖聚合物(例如，2至IO个单位)。18术语"寡糖"是指具有2至IO个以糖苷键连接的单糖单元的任何化合物。简单糖的这些短链聚合物包括糊精。19术语"a-淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.类另iJ3.2丄1)"是指催化(x-l，4-糖苷键水解的酶。20术i吾"糖化酶(saccharifyingenzyme)"和"淀粉水解酶(starchhydrolyzingenzymes)"是指能转化淀粉为单糖或寡糖(例如，己糖或戊糖)的任何酶。21术语"颗粒状淀粉水解(GSH)酶"和"具有颗粒状淀粉水解(GSH)活性的酶"是指能水解颗粒状形态淀粉的酶。22术语"淀粉的水解"是指糖苷键因加入水分子而断裂。23术语"内源性植物a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的、由植物材料表达和产生的酶。如在此使用的内源性植物a-淀粉酶可以是异源的或同源的。24术语"外源性植物a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的酶，其源自植物(x-淀粉酶并且独立于用作淀粉水解底物的植物材料而提供。25术语"微生物的a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的、源自微生物源(例如细菌或真菌)的酶，并包括修饰的酶、活性片段和其杂种。26涉及多核苷酸或蛋白质的术语"异源的(heterologous)"是指在宿主细胞中非天然发生的多核苷酸或蛋白质。该术语意图包括由天然发生的基因、突变基因、合成基因和/或过表达基因编码的蛋白质。27涉及多核苷酸或蛋白质的术语"同源的(homologous)"是指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。28术语"葡糖淀粉酶(glucoamylase)"是指淀粉葡糖苷酶类的酶(例如，E.C.3.2丄3，葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。29在此使用的术语"磨碎的(milled)"是指尺寸被减小的植物材料，例如，通过碾碎、压碎、分级或任何其它减小颗粒尺寸的方法。30术语"胶凝(gelatinization)"是指淀粉分子的增溶作用，通常通过烹煮形成粘稠悬液进行。31术语"胶凝温度(gelatinizationtemperature)"是指包含底物的淀粉开始胶凝的最低温度。确切的胶凝温度取决于具体淀粉，并且可以依赖于例如植物种类和环境以及生长条件这些因素而变化。对于可以根据在此所述方法使用的许多颗粒状淀粉，初始淀粉胶凝温度的范围包括大麦(52。C至59。C)、小麦(58。C至64匸)、黑麦(57。C至70。C)、玉米(62。C至72。C)、高直链淀粉玉米(67t:至80'C)、稻米(68i:至77。C)、高梁(68°〇至77°0、马铃薯(58。C至68°C)、木薯(59。C至69°C)和甘薯(58。C至72°C)(J丄M.Swinkels的STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY中32-38页，VanBeynum等人编辑(1985)MarcelDekkerInc.NewYork禾QTheAlcoholTextbook第三版，Jacques等人编辑，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries(1999)NottinghamUniversityPress,-UK)。32术语"低于胶凝温度"是指温度小于胶凝温度。33如本文中所使用，术语"干固体含量(ds)"是指基于干重以百分比(％)计的浆体中的总固体，包括水分。34术语"浆状物"是指包含不溶固体(例如，颗粒状淀粉)的含水混合物。35术语"醪液(mash)"是指液态的可发酵底物的混合物，其被用于产生发酵产物，并且该术语被用于指从初始混合可发酵底物与一种或多种淀粉水解酶和发酵有机体至发酵实验完成的任意发酵阶段。36术语"发酵(fermentation)"是指通过微生物酶分解和厌氧分解有机底物，以生产更简单的有机化合物。虽然发酵发生在缺氧条件下，但该术语不意图仅限于严格缺氧条件，因为发酵也在氧存在下发生。37短语"同步糖化和发酵(SSF)"是指产生最终产品的过程，其中发酵有机体例如产乙醇微生物和至少一种酶例如糖化酶在同一工艺步骤中结合在同一容器中。38术语"糖化(saccharification)"是指不可直接使用的多糖被酶转化为单糖或寡糖，以便发酵转化为最终产品。39术语"最终产品"是指从可发酵底物酶转化的任何碳源衍生产品。在一些优选的实施方式中，所述最终产品是醇，例如乙醇。40在此使用的术语"发酵有机体"是指任意的微生物或细胞，其适合用于发酵，以便直接或间接生产最终产品。41在此使用的术语"产乙醇者"或"产乙醇微生物"是指能从单糖或寡糖生产乙醇的发酵生物。42如在此使用的术语"回收(recovered)"、"分离(isolated)"和"分开(separated)"是指蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从至少一种与其天然相关的成分中去除。43术语"源自(derived)"包括术语"起源自(originatedfrom)"、"得自(obtained)"或"可得自(obtainablefrom)"和"分离自(isolatedfrom)",并且在一些实施方式中，如在此使用的，是指从细胞产生核苷酸序列编码的多肽，在所述细胞中核苷酸是天然存在的或核苷酸已经被插入所述细胞中。44术语"酶促转化(enzymaticconversion)"通常是指底物通过酶作用修饰。45术语"产量(yield)"是指使用本发明的所述方法生产的最终产品的量。在一些实施方式中，该术语是指最终产品的体积，并且在其它实施方式中，该术语是指最终产品的浓度。46在此使用的术语"酶单位(enzymeunit)"是指在特定测定条件下每分钟生产1微摩尔产品的酶的量。例如，在一个实施方式中，术语"葡糖淀粉酶活性单位(GAU)"定义为在测定条件6(TC和pH4.2下，从可溶淀粉底物(4。/。DS)每小时生产lg葡萄糖所需要的酶的量。在另一实施方式中，对"可溶淀粉单位(SSU)"，l单位的酶活性等价于在特定培养条件下每分钟释放的葡萄糖中lmg的还原力，并且是基于10等份的酶样品在pH4.5、5(TC下水解可溶马铃薯淀粉底物(4%DS)的程度。DS是指"干固体(drysolids)"。47如本文中所使用，术语"包括(comprising)"和其同源词以其包含性意义使用；也就是说，等价于术语"包含(including)"及其相应的同源词。48"一个(a)"、"一个(an)"和"这个(the)"包括复数形式，除非上下文中另外明确指出。"49数值范围包括限定该范围的数。50本文所提供的标题不是对本发明的不同方面或实施方式的限制，其可以通过整体上参考说明书而被理解。实施方式51在植物细胞以及微生物的细胞中，a-淀粉酶也涉及淀粉的水解，并且在谷类种子的发芽期间，淀粉降解的起始伴随大量的a-淀粉酶的从头合成。因此，谷类种子有其自己的内源性淀粉水解a-淀粉酶，其涉及产生用于发芽和生长的简单糖。52在低于初始淀粉胶凝温度的温度条件下(例如低于80°C)，淀粉水解酶的酶组合物，包括那些来自微生物源的和那些来自天然植物a-淀粉酶的，提供了水解颗粒状淀粉并获得可发酵糖以及其它最终产品的改进方法。磨碎的植物材料53包含颗粒状淀粉的植物材料可以得自，但不仅限于，小麦、玉米、黑麦、高梁(买罗高粱)、稻米、黍、大麦、小黑麦、木薯(木薯粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻米、高粱及其组合。植物材料可以包括杂交品种和遗传改良品种(例如，包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物任意部分可以被用作植物材料，包括但不仅限于植物的各部分，例如叶、茎、荚、外果壳、根茎、穗轴、谷粒和类似物。在一个实施方式中，整谷粒可以被用作颗粒状淀粉源。优选的整谷粒包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高梁和其组合。54优选情况下，所述整谷粒的尺寸通过本领域已知的方法被减小，其包括碾磨(例如锤碾磨或滚筒碾磨)；乳化技术；旋转脉动；分级和类似方法。在一些实施方式中，所述植物材料被磨细，以至至少70%将通过具有0.5毫米滤网的筛。在一些实施方式中，磨细的植物材料的至少90%将通过具有0.5毫米滤网的筛。55在其它实施方式中，所述植物材料是分级的谷类谷粒，其包括纤维、胚乳和/或芽孢部分。在一些实施方式中，某些级分将被用于本发明的淀粉水解方法。用于分级植物材料例如玉米、大麦和小麦的方法是本领域公知的。植物a-淀粉酶56在优选的实施方式中，根据本发明，用于磨碎的植物材料的淀粉水解的酶组分是外源性植物(x-淀粉酶。57外源性植物a-淀粉酶可以从各种植物和植物部分获得，例如玉米、大麦、小麦、稻米和高粱。至少一种植物(x-淀粉酶已经被纯化，并且可以从例如Sigma-Aldrich的来源商业获得。优选的植物淀粉酶包括那些源自大麦和高粱的。58很多植物(x-淀粉酶已经被纯化，并且这些酶中的一些已经被测序。植物a-淀粉酶的实例包括那些在拟南芥(Arabidopsis)(GenBankNP564977);稻米(Karrer等人(1992)ThePlanU.2:51,7-532;和Karrer等人(簡)PlantMol.Biol.16:797-805);玉米(美国专利2005/0138688;Warner等人(1991)PlantSci.78:143—150和Subbarao等人(1998)Phytochem.49:657-666);大麦(Xavier等人(2003)Structure11:973-984;MacGregor等人(2001)Biochim.Biophys.Acta1546:1—20;和GenBankX05166)中发现的。59在本方法进行的温度下，可以相信内源性植物a-淀粉酶未被灭活并且也可以促进颗粒状淀粉水解。60根据本发明的外源性植物a-淀粉酶可以被单独添加或与其它酶结合添加。葡糖淀粉酶-61在本发明的优选实施方式中，所述方法包括使磨碎的植物材料与外源性植物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合物接触。62葡糖淀粉酶(E.C.3.2丄3.)可以源自细菌、植物和真菌源的异源或内源蛋白质表达。优选的，对本发明有用的葡糖淀粉酶通过数个丝状真菌和酵母菌的菌株生产。特别是，从曲霉G^/7^^7/""和木霉菌(7h'c/20^"廳)的菌株分泌的葡糖淀粉酶是商业上重要的。适合的葡糖淀粉酶包括天然产生的野生型葡糖淀粉酶以及变体和基因工程突变体葡糖淀粉酶。以下的葡糖淀粉酶是可以用于本发明考虑的方法中的葡糖淀粉酶的非限制性实例。黑曲霉04^wg///^"/gw)Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBOJ.3:1097-1102;WO92/00381、WO00/04136和USP6,352,851);泡盛曲霉(ApeA^7/wavrawon')葡糖淀粉酶(WO84/02921);米曲霉(Aperg/〃^co^ae)葡糖淀粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55:941-949)禾口当ra應m/(见Chen等人(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等人(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等人(1994)BiochemJ.302:275-281)。63葡糖淀粉酶也从踝节菌属(ra/aram;^")的菌株获得，例如那些源自埃默森篮状菌(ewe"om7)、7:/e_yce"am、！T^po^/和嗜热篮状菌(7:AmwopM"力的(WO99/28488;USPNo.RE:32,153;USPNo.4,587，215);木霉属(7h'c/20fifema)菌株例如里氏木霉(7:/"ee"/)，特别是与公开在US专利发明者M·库玛申请人:美国丹尼斯克有限公司杰能科子公司