早期胰腺腺癌的检测的制作方法

专利名称：早期胰腺腺癌的检测的制作方法
早期胰腺腺癌的检测相关申请根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2010年I月22日提交的美国临时申请61/297，303、2010年4月14日提交的61/323，944、2010年6月2日提交的61/350,567以及2010年8月19日提交的61/375，119的权益。上面引用的每篇优先权申请均以引用的方式整体并入本文。
有关联邦政府资助的研究或开发的申明这项工作部分由NIH基金R01-CA096924资助。美国政府可享有本发明的某些权利。发明背景发明领域本发明涉及抗胰腺癌抗体的用途，所述抗体以高选择性结合到胰腺癌细胞上从而检测和/或诊断胰腺腺癌，优选地最早期的胰腺腺癌。更优选地，基于抗体的测定能够检测约85%或更多的胰腺腺癌，对健康对照的假阳性率为5%或更低。在特定实施方案中，所述方法和组合物可用来通过筛检来自受试者的血清样品来检测和/或诊断胰腺腺癌，并优选可通过血清样品分析检测60%或更多的I期胰腺癌以及80%或更多的II期胰腺癌。在优选实施方案中，所述抗胰腺癌抗体与PAM4抗体竞争结合到胰腺癌粘蛋白上，所述PAM4抗体包含轻链可变区互补决定区(OTR)序列⑶Rl (SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO: I), CDR2 (STSNLAS, SEQID NO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3),以及重链 CDR 序列 CDRl (SYVLH, SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO: 6)。最优选地，所述抗胰腺癌抗体是人源化PAM4 (hPAM4)抗体，其包含轻链 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO: I)、CDR2 (STSNLAS, SEQ IDNO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3),以及重链 CDR 序列 CDRl (SYVLH, SEQ ID NO: 4),CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO: 6)，以及人抗体构架区(FR)和恒定区序列。相关领域胰腺癌是主要发生于胰腺导管细胞的胰腺恶性生长。这种疾病是排在第九位的最常见癌症形式，但它分别是排在第四和第五位的男性和女性癌症死亡的主要原因。胰腺癌几乎总是致命的，5年存活率小于3 %。胰腺癌最常见的症状包括黄疸、腹痛和体重减轻，这些症状与其它表现症状(presenting factor)都是非特异性的。因而，在肿瘤生长早期诊断出胰腺癌常常是困难的，需要大量的诊断性检查，时常包括探查术。内窥镜超声成像和计算机断层成像是目前可用的最好的非侵入性诊断胰腺癌的手段。然而，小肿瘤的可靠检测以及胰腺癌和局灶性胰腺炎的区分是困难的。目前，绝大多数胰腺癌患者处于晚期时才被诊断出来，此时肿瘤已从囊向外延伸，侵袭周围器官和/或已经广泛转移。Gold等，Crit. Rev. Oncology/Hematology, 39:147-54 (2001)。该疾病的晚期检测是常见的，早期胰腺癌诊断在临床上是罕见的。这很重要，因为胰腺癌的晚期检测导致存活率低下。可用的胰腺癌现行治疗程序没有导致治愈或明显提高存活时间。手术切除是提供存活机会的唯一方式。然而，由于肿瘤负荷大，仅10%至25%的患者是“治愈性切除”的候选者。对于接受手术治疗的那些患者，5年存活率仍然很低，平均仅约为10%。胰腺癌的早期检测和诊断以及对该疾病的适当分期将会提供提高的存活优势。许多实验室已试图基于肿瘤相关标记至血流中的释放以及活检样本内的标记物质的检测来开发诊断程序。对于胰腺癌，先前表征的最好的肿瘤相关标记是针对CA19. 9的免疫测定。在70%的胰腺癌患者中发现这种唾液酸化Lea表位结构水平升高，但并未在任何所检查的局灶性胰腺炎样本中发现。然而，发现CA19. 9水平在许多其它恶 和良性病状中也升高，所以目前该测定不能用于诊断。该测定对于监测有用，手术后CA19. 9血清水平持续增加指示不良预后。已经报道，用于在不同的发展期进行诊断的许多其它单克隆抗体(MAb)的免疫测定。这些抗体包括但不限于DUPAN2、SPANl、B72. 3、Ia3和各种抗-CEA (癌胚抗原，或CEACAM5)抗体。抗体，特别是MAb和工程化抗体或抗体片段已被全面测试，并被证明在检测和治疗包括癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎性疾病或心血管疾病在内的各种人病症中具有价值[Filpula 和 McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9:231-245]。抗体或抗体源性试剂的临床应用主要取决于它们与特定病症相关的特异性靶抗原结合的能力。选择性对于在人病症的检测和治疗阶段期间将诊断剂或治疗剂递送至靶部位是有价值的，特别是如果所述诊断剂或治疗剂对机体正常组织有毒性时更是如此，所述诊断剂或治疗剂为例如药物、毒素、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、寡核苷酸、生长因子、放射性核素、血管生成抑制剂或金属。放射性标记抗体已在包括卵巢癌、结肠癌、甲状腺髓样癌和淋巴瘤在内的许多恶性肿瘤的应用中取得了一些成功。这项技术也被证明对胰腺癌有用。然而，先前报道的抗胰腺癌抗原的抗体到目前为止还没有成功地用于胰腺癌的有效治疗或早期检测和/或诊断。本领域仍然需要与正常胰腺组织和其它正常组织相比对胰腺癌和其它类型的癌症表现出高选择性的抗体。特别地，仍然需要这样的抗体，其可用作胰腺癌，优选最早期胰腺癌的有效诊断和/或治疗工具，并且在靶抗原中的摄取增强，与健康个体血液中的组分的结合降低，并从而也为正常组织和细胞提供最佳的保护，使其免受当这些组分缀合到此类抗体上时有毒治疗剂的损害。将此类抗体用来检测体液(特别是血液)中的胰腺癌相关抗原，可以改进这种疾病的较早期诊断，只要它明显区别于良性疾病，并且还可以监测治疗反应，并且还可潜在地通过指示疾病负荷来改善预后。概述在各种实施方案中，本发明涉及结合到胰腺癌细胞上，而很少或不结合到正常细胞或非赘生性胰腺癌细胞上的抗体、抗原结合抗体片段和融合蛋白。优选地，所述抗体结合到最早期胰腺癌上，对PanIN-IA的检测率为约54%，对PanlB的检测率为75%，对PanIN_2的检测率为86%。更优选地，所述抗体结合到80%至90%或更多的人侵袭性胰腺腺癌、导管内乳头状粘液性瘤变(neoplasia)、PanlN-lA、PanIN-IB和PanIN-2病变上。最优选地，所述抗体可以区分早期胰腺癌和非恶性病状例如胰腺炎。此类抗体特别可用于癌症的早期检测以及早期胰腺癌和良性胰腺病状的鉴别诊断。在优选的实施方案中，此类抗体可用于体内或离体分析来自疑似患有早期胰腺癌或某些其它癌症的个体的样品。更优选地，所述抗体可用于通过分析血清样品检测和诊断早期胰腺癌。所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以通过用粘蛋白免疫和/或选择而获得，并优选对人胰腺癌粘蛋白有反应性。因此，所述抗体、抗体片段或融合蛋白优选结合到与胰腺癌细胞相关的抗原上。更优选地，所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以结合到表达于胰腺癌中的粘蛋白例如MUC-I或MUC-5上。在替代实施方案中，所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以结合到合成肽序列上，例如结合到噬菌体展示肽上。可结合到抗胰腺癌抗体上的示例性肽包括但不限于 WTffNITKAYPLP (SEQ ID NO:7)和 ACPEffffGTTC (SEQ ID NO:8) 此类合成肽可以是线形或环状的，并且可能与或不与结合到内源性胰腺癌抗原上的抗体竞争。合成肽序列某些位置中的氨基酸对于抗体结合性而言可能不如其它氨基酸关键。例如，在SEQ ID N0:7中，位于肽序列的位置7、8和11处的残基K、A和L可以改变，同时仍然保留抗体结合性。类似地，在SEQID N0:8中，该序列的位置8和9处的苏氨酸残基可以改变，但位置9处苏氨酸的置换可显著影响抗体对所述肽的结合。所述抗体与靶胰腺癌抗原的结合可以通过用如二硫苏糖醇(DTT)和/或高碘酸盐的试剂处理靶抗原来抑制。因而，所述抗体与胰腺癌抗原的结合可能取决于二硫键的存在和/或靶抗原的糖基化状态。在更优选的实施方案中，题述抗体识别的表位与报道的其它粘蛋白特异性抗体例如MA5抗体、CLH2-2抗体和/或45M1抗体没有交叉反应性(参见，例如，Major 等,J Histochem Cytochem. 35:139-48，1987;Dion 等，Hybridoma10:595-610， 1991)。题述抗体或片段可以是裸抗体或片段，或者优选缀合到至少一种治疗和/或诊断剂上以便将所述试剂递送至靶组织。在替代实施方案中，PAM4抗体或片段可以是双特异性融合蛋白或抗体的一部分，所述双特异性融合蛋白或抗体具有针对靶细胞抗原的第一结合位点和针对缀合到可靶向构建体上的半抗原的第二结合位点。可靶向构建体继而可以连接至可用于预靶向技术的至少一种治疗和/或诊断剂。在优选的实施方案中，题述抗体、抗体片段或融合蛋白包含鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体或片段，其包含轻链可变区CDR序列CDRl (SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO: I),CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3)，以及重链可变区 CDR序列CDRl(SYVLH, SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)o特定实施方案可以涉及使用鼠PAM4抗体的组合物和方法，所述鼠PAM4抗体优选包含如图IA和IB中所公开的鼠PAM4可变区序列(SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12)。此类鼠PAM4抗体或片段可用于体外或离体诊断技术，例如来自疑似患有胰腺癌或其他类型的癌症的受试者的组织样品的免疫组织化学分析或体液样品的免疫测定。其它特定实施方案可以涉及使用嵌合PAM4抗体的组合物和方法，所述嵌合PAM4抗体包含连接至人抗体恒定区序列的鼠可变区序列。所述嵌合PAM4抗体或片段优选包含图2A和2B中所示的cPAM4可变区序列(SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14)。此类嵌合抗体在人中的免疫原性小于鼠抗体，同时保留了亲本鼠抗体的抗原结合特异性。用于癌症的诊断性和/或治疗性治疗的嵌合抗体是本领域熟知的。
又其它特定实施方案可以涉及使用人源化PAM4抗体或其片段的组合物和方法，所述人源化PAM4抗体或其片段包含如上所讨论的鼠PAM4 MAb的互补决定区(CDR)和人抗体构架区(FR)和恒定区序列。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或其片段的轻链和重链可变区的FR包含至少一种被鼠PAM4 MAb的相应FR置换的氨基酸。还更优选人源化PAM4抗体或其片段可包含至少选自鼠PAM4重链可变区(

图1B，SEQ ID NO: 12)的氨基酸残基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸残基，和/或至少一种选自鼠PAM4轻链可变区(图1A，SEQ ID NO: 10)的氨基酸残基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸。最优选地，人源化PAM4抗体或其片段包含图4A (SEQ ID NO: 19)的hPAM4 Vh氨基酸序列和图4B (SEQID NO: 16)的hPAM4VK氨基酸序列。在替代实施方案中，抗胰腺癌抗体可以是与嵌合PAM4(cPAM4)抗体结合到相同的 抗原决定簇(表位)上，或者与嵌合PAM4(cPAM4)抗体竞争结合到人胰腺粘蛋白上的鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。如下面所讨论的，cPAM4抗体是包含轻链可变区CDR序列CDRl(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:I)、CDR2(STSNLAS, SEQ IDNO:2)和CDR3(HQWNRYPYT, SEQID NO: 3)，以及重链可变区 CDR序列 CDRl (SYVLH, SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO:6)的抗体。结合到相同的抗原决定簇上的抗体可以通过本领域已知的多种技术鉴定，例如通过使用cPAM4抗体作为竞争抗体和使用人胰腺粘蛋白作为靶抗原的竞争性结合研究鉴定。(参见例如下面的实施例I)。阻断CPAM4抗体(与CPAM4抗体竞争)结合至人胰腺粘蛋白的抗体称为交叉阻断抗体。优选地，此类交叉阻断抗体是通过用包含人胰腺癌粘蛋白的提取物进行免疫来制备。另一个实施方案是癌细胞靶向性诊断免疫缀合物，其包含结合到至少一种诊断(或检测)剂上的抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白。优选地，所述诊断剂选自由放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂组成的组。还更优选所述诊断剂为能量介于20keV和4，OOOkeV之间的放射性核素，或者为选自由以下组成的组的放射性核素n°In、mIn、177Lu,18F,52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc, 1201 , 1231 , 1241 , 1251 , 131 I,154-158Gd、32P、nC、13N、150、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55CO、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其它 y 发射体、P发射体或正电子发射体。在特别优选的实施方案中，将诊断放射性核素18F用于标记和PET成像，如下面的实施例中所描述的。18F可以通过如下方式连接至抗体、抗体片段或肽使它与金属例如铝复合，然后使18F-金属复合物结合至缀合到靶向蛋白、肽或其它分子上的螯合部分。还优选地，所述诊断剂为顺磁离子，如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II )、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钦(III)和铒(III)，或不透射线的材料，如钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、碘肥胺、碘沙酸、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。在又其它实施方案中，所述诊断剂是选自由异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺组成的组的荧光标记化合物，选自由鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎗酯、咪唑、吖啶鎗盐和草酸酯组成的组的化学发光标记化合物，或选自由萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白组成的组的生物发光化合物。在另一个实施方案中，所述诊断免疫缀合物用于手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤诊断。另一个实施方案是癌细胞靶向性治疗免疫缀合物，其包含结合到至少一种治疗剂上的抗体或其片段或融合蛋白。优选地，所述治疗剂选自由放射性核素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、如反义寡核苷酸或siRNA的寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗剂、如药物或毒素的细胞毒性剂、血管生成抑制剂和促凋亡剂组成的组。在使用一种以上的治疗剂的实施方案中，所述治疗剂可以包含多个拷贝的相同治疗剂或者不同治疗剂的组合。在一个实施方案中，寡核苷酸，例如抑制bcl-2表达的反义寡核苷酸或siRNA描述于美国专利第5，734，033号(其实施例部分以引用方式并入本文)中，可以缀合到免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分上或者形成免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分。或者，所述寡核苷酸可以与裸或缀合的抗胰腺癌抗体或抗体片段例如PAM4抗体同时·施用或相继施用。在优选的实施方案中，所述寡核苷酸是针对癌基因或癌基因产物如bcl-2、p53、ras或其它熟知的癌基因的反义寡核苷酸。在优选的实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂，如药物或毒素。还优选地，所述药物选自由以下组成的组氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制齐U、表鬼白毒素、钼配位复合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮细胞抑制素(endostatin)、紫杉醇、喜树碱、SN-38、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-Il及其组
八
口 o在另一个优选的实施方案中，所述治疗剂是毒素，其选自由以下组成蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、a毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素及其组合。或者免疫调节剂，其选自由以下组成的组细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素及其组
口 o或者，所述治疗剂是酶，其选自由以下组成的组苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、
6-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、a -甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此类酶可以，例如与以相对无毒形式施用并在靶位被所述酶转化成细胞毒性剂的前药组合使用。在其它替代实施方案中，药物可以被受试者内源酶转化成毒性较低的形式，但可被所述治疗酶再转化成细胞毒性形式。其它治疗剂包括放射性核素，例如14C、13N、150、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、67Ga、75Br、75Se、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo、99mTc、103mRh、103Ru, 105Rh, 105Ru,107Hg, 109Pd, 109Pt, 111Ag,111In,113mIn, 119Sb, 121mTe, 122mTe, 1251 , 125mTe, 1261,131I,1331 , 142Pr, 143Pr, 149Pm, 152Dy, 153Sm, 161Ho, 161Tb, 165Tm, 166Dy, 166Ho, 167Tm, 168Tm, 169Er, 169Yb, 177Lu,186Re,188Re,189m0s,189Re,192Ir, 194Ir,197Pt, 198Au,199Au,199Au,201TU203Hg,211At,211Bi,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,215Po,217At,219Rn,221Fr,223Ra^224Ac,225Ac 或 255Fm0还涵盖多价、多特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原有亲和性的结合位点，和一个或多个对半抗原分子有亲和性的半抗原结合位点。优选地，所述抗体或其片段为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体或其片段。所述半抗原分子可以缀合到用于递送一种或多种治疗和/或诊断剂的可靶向构建体上。在某些优选的实施方案中，所述多价抗体或其片段可以通过停靠和锁定(DNL)技术制备，如下面的实施例中所描述的。并入hPAM4抗体片段的示例性DNL构建体命名为TFlO，如下所述。还涵盖双特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原有亲和性的结合位点，和至少一个对可靶向构建体/缀合物有亲和性的结合位点，所述可靶向构建体/缀合物选自由以下组成的组DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG)-D-Asp-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 271)；DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG)-D-Glu-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 277)；DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG)-D-Glu-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 288)；DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Glu-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 0281)；NOTA-ITC 苄基-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 449)；NODA-Ga-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP460)；NOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2QMP 461)；NOTA-D-Asp-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 462)；NOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2QMP 465)；C-NETA-琥珀酰基 _D_Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP467)；S-NETA-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP 469);和L-NETA-琥珀酰基 _D_Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP470)，其能够携带至少一种诊断剂和/或治疗剂。其它适用的可靶向构建体公开于，例如美国专利第6，576，746号、第6，962，702号、第7，052，872号、第7，138，103号、第7，172，751 号、第 7，405，320 号、第 7，597，876 号、第 7，563，433 号，以及 2008 年 12 月 24 日提交的美国专利申请序列第12/343，655号、2009年4月30日提交的美国专利申请序列第12/433，212号、2009年6月17日提交的美国专利申请序列第12/485，998号、2009年8月14日提交的美国专利申请序列第12/541,527号以及2010年12月I日提交的美国专利申请序列第12/958，889号中，这些专利和专利申请的实施例部分都以引用方式并入本文。其它实施方案涉及包含至少两种本文所述的抗胰腺癌抗体及其片段的融合蛋白。或者，所述融合蛋白或其片段可以包含至少一种第一抗胰腺癌抗体或其片段和至少一种第二 MAb或其片段。优选地，第二 MAb结合到肿瘤相关抗原上，所述肿瘤相关抗原例如选自由以下组成的组CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、Lea、路易斯抗原Le (y)、CSAp、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮糖蛋白_1 (EGP-I)、上皮糖 蛋白-2(EGP-2)、CD-80、胎盘生长因子(PlGF)、碳酸酐酶IX、肌腱蛋白、IL-6、HLA-DR、CD40、CD74(例如，milatuzumab)、CD138(多配体聚糖-I)、MUC-l、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC_5ac、MUC-16、MUC-17、TAG-72、EGFR、血小板衍生生长因子(I3DGF)、血管生成因子(例如，VEGF和P1GF)、癌基因产物H^i^n，bcl-2、Kras、p53)、cMET、HER2/neu，以及与胃癌和结肠直肠癌相关的抗原。所述抗体融合蛋白或其片段可以进一步包含至少一种诊断剂和/或治疗剂。
本文还描述了包含编码如本文所述的抗胰腺癌抗体、融合蛋白、多特异性抗体、双特异性抗体或其片段的核酸的DNA序列。其它实施方案涉及包含所述抗体编码DNA序列的表达载体和/或宿主细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞可以为用突变Bcl-2基因，例如用三重突变Bcl-2基因(T69E、S70E、S87E)转化的、已适应于细胞转化和在无血清培养基中生长的Sp2/0细胞系。(参见，例如，美国专利第7，531，327号、第7，537，930号和第7，608，425号，其中每篇的 实施例部分均以引用方式并入本文)。另一个实施方案涉及将诊断或治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括(i)提供包含缀合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上的抗胰腺癌抗体或片段例如PAM4抗体或片段的组合物，和(ii)将本文要求保护的抗体、抗体片段或融合蛋白中的任一者的诊断或治疗缀合物施用给需要它的受试者。还涵盖将诊断剂、治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括(a)向受试者施用对PAM4抗原有亲和性并包含一个或多个半抗原结合位点的多价、多特异性或双特异性抗体或其片段中的任一者；(b)等待足够长的时间以便未结合到PAM4抗原上的抗体从受试者血流中清除；和(c)向所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到所述抗体的结合位点上的载体分子。优选地，所述载体分子结合到所述抗体的一个以上的结合位点上。本文描述了用于诊断或治疗癌症的方法，其包括(a)向受试者施用对PAM4抗原有亲和性并包含一个或多个半抗原结合位点的本文要求保护的多价、多特异性抗体或其片段中的任一者；(b)等待足够长的时间以便未结合抗体从受试者血流中清除；和(C)向所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到所述抗体的结合位点上的载体分子。在优选的实施方案中，所述癌症是胰腺癌。还优选地，所述方法可用于手术中鉴定患病组织、经内窥镜检查鉴定患病组织，或血管内鉴定患病组织。另一个实施方案是治疗受试者的恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的结合到PAM4抗原上并任选地缀合到至少一种治疗剂上的抗体或其片段。所述抗体或其片段可以替代地为裸抗体或其片段。在更优选的实施方案中，所述抗体或片段在施用如上所述的另一种治疗剂之前施用、与它同时施用或在它之后施用。本文涵盖诊断受试者的恶性肿瘤，特别是癌症的方法，其包括(a)向所述受试者施用包含可结合到PAM4抗原上的抗体或其片段的诊断缀合物，其中所述MAb或其片段缀合到至少一种诊断剂上；和(b)检测结合到胰腺癌细胞或其它恶性肿瘤细胞上的标记抗体的存在，其中所述抗体的结合是对胰腺癌或另一种恶性肿瘤的存在的诊断。在优选的实施方案中，所述抗体或片段结合到胰腺癌上，而不结合到正常胰腺组织、胰腺炎或其它非恶性病状上。在次优选的实施方案中，所述抗体或片段以与非恶性细胞相比显著较高的水平结合到癌细胞上，允许癌症与非恶性病状的鉴别诊断。在最优选的实施方案中，所述诊断剂可以是通过PET成像检测的F-18标记分子。在更优选的实施方案中，使用抗胰腺癌抗体例如hPAM4抗体允许在恶性疾病最早期以高特异性和敏感度检测和/或诊断胰腺癌。优选地，所述诊断抗体或片段能够标记至少70%，更优选至少80%，更优选至少90%，更优选至少95%，最优选约100%的高分化、中分化和低分化的胰腺癌以及90%或更多的侵袭性胰腺腺癌。有用的抗胰腺癌抗体优选能够检测85%或更多的PanIN-lA、PanIN-lB、PanIN-2、IPMN和MCN前驱病变。最优选地，使用抗胰腺癌抗体的免疫测定能够检测89%或更多的总PanIN、86%或更多的IPMN以及92%或更多的MCN。替代实施方案是通过体外分析血液、血浆或血清样品检测个体中的PAM4抗原和/或诊断个体的胰腺癌的方法。优选地，在针对利用抗胰腺癌抗体例如PAM4抗体的免疫检测处理样品之前，使用有机溶剂例如丁醇对它进行有机相萃取。有机相萃取之后，采用本领域已知的多种免疫测定技术中的任一种，例如ELISA、三明治免疫测定、固相RIA和类似技术对所萃取的水相分析所述样品中PAM4抗体的存在。令人惊讶地，有机相萃取除去了可结合到PAM4靶抗原上的PAM4抑制剂，使得新鲜血清样品中的PAM4靶抗原能被检测到。更令人惊讶地，利用本文所述的体外分析技术，可以分析血清样品来检测和/或诊断处于胰腺腺癌最早期的受试者的胰腺癌。这些意外结果提供了第一种基于血清的诊断早期胰腺癌的存在的测定技术。
另一个实施方案是治疗受试者的癌细胞的方法，其包括向所述受试者施用包含可结合到PAM4抗原上的裸抗体或其片段或者裸抗体融合蛋白或其片段的组合物。优选地，所述方法进一步包括施用选自由以下组成的组的第二裸抗体或其片段CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、抗-CEA、抗-CEACAM6、抗-EGP-1、抗-EGP-2、抗 _Lea、由路易斯抗原Le (y)定义的抗体，以及针对以下的抗体CSAp、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC_5ac、1^016、1^017、了46-7236 1 、0)40、111^-01 、0)74、0)138、血管生成因子(例如，VEGF 和胎盘样生长因子(PlGF))、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、癌基因产物、cMET和HER2/neu。又其它实施方案涉及诊断受试者的恶性肿瘤的方法，其包括(i)用包含可结合到PAM4抗原上的抗体或其片段的组合物对来自所述受试者的样本进行体外诊断分析；和
(ii)检测结合到样本中恶性肿瘤细胞上的抗体或片段的存在。优选所述恶性肿瘤是癌症。还优选所述癌症是胰腺癌。附图简述图I.鼠PAM4抗体的可变区cDNA序列和推导的氨基酸序列。图IA示出鼠PAM4Vk的DNA(SEQ ID NO:9)序列和氨基酸(SEQ ID NO: 10)序列。图 IB示出鼠PAM4 DNA(SEQID NO: 11)序列和氨基酸(SEQ ID NO: 12)序列。由相应DNA序列编码的氨基酸序列在核苷酸序列之下以单字母密码子给出。核苷酸序列的编号位居右侧。CDR区中的氨基酸残基用粗体和下划线表示。利用Kabat Ig分子编号对氨基酸残基进行编号，如氨基酸残基上面的编号所示。用字母编号的氨基酸残基是根据Kabat编号方案定义的插入残基。插入残基具有与前面残基之前的数字相同的数字。例如，图IB中的残基82、82A、82B和82C分别表示为 82、A、B，和 C0图2.在Sp2/0细胞中表达的嵌合PAM4(cPAM4)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。图2A示出cPAM4 Vk的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。图2B示出cPAM4 Vh的氨基酸序列(SEQ ID N0:14)。该序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体和下划线表示。氨基酸的编号与图I相同。图3.人抗体、PAM4和hPAM4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列比对。图3A 示出人抗体 Walker (SEQ ID NO: 15)与 PAM4(SEQ ID NO: 10)和 hPAM4(SEQ ID NO: 16)的乂1(氨基酸序列比对，图 3B 示出人抗体 Wil2(FRl-3) (SEQ ID NO: 17)和 NEWM(FR4) (SEQ IDNO: 18)与PAM4(SEQ ID NO: 12)和hPAM4(SEQ ID NO: 19)的Vh氨基酸序列比对。圆点表示与人或人源化抗体相应残基相同的PAM4的残基。方框内区域代表CDR区。hPAM4的N端和C端残基(加下划线)都用所用的分期载体固定。利用Kabat Ig分子编号方案对残基进行编号，如同图I。图4.在Sp2/0细胞中表达的人源化PAM4(hPAM4)重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图4A示出hPAM4VK的DNA(SEQ ID NO:20)序列和氨基酸(SEQ IDNO: 16)序列，图 4B 示出 hPAM4 Vj^DNAGEQ ID N0:21)序列和氨基酸(SEQ ID NO: 19)序列。核苷酸序列的编号位居右侧。由相应DNA序列编码的氨基酸序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体加下划线表示。利用Kabat Ig分子编号方案对氨基酸残基进行编号，如同图IA和图1B。图5.人源化PAM4抗体hPAM4与嵌合PAM4 cPAM4的结合活性比较。hPAM4用菱形表示，cPAM4用实心圆表示。当与结合到CaPanl抗原上的125I_cPAM4竞争时，结果表明hPAM4抗体和cPAM4的相当的结合活性。
图6.用分次9°Y_hPAM4加吉西他滨治疗的不宜手术的转移性胰腺癌患者在治疗前(左侧)和治疗后(右侧)的PET/CT融合图像。圆圈指示原发病变的位置，其显示在治疗后PET/CT强度显著降低。图7.用分次9°Y_hPAM4加吉西他滨治疗的不宜手术的转移性胰腺癌患者在治疗前(左侧)和治疗后(右侧)的3D PET图像。箭头指向原发病变位置(右侧)和转移瘤位置(左侧)，每个均显示在用放射性标记hPAM4加吉西他滨治疗之后PET图像强度显著降低。图8.在存在或不存在预靶向性TFlO双特异性抗胰腺癌粘蛋白抗体的情况下，利用111In-标记的diHSG肽(MP 288)的肿瘤体内成像。图8A-小鼠示出肿瘤位置(箭头)。图SB示出在存在(上面)或不存在(下面)TFlO双特异性抗体的情况下利用111In-标记IMP 288检测到的肿瘤。图 9. TF10、PAM4-IgG、PAM4-F (ab，)2 和单价 bsPAM4 化学缀合物(PAM4_Fab，x抗-DTPA-Fab’)的示例性结合曲线。与靶粘蛋白抗原的结合通过ELISA测定法测量。图10. CaPanl人胰腺癌异种移植物( 0. 25g)的免疫闪烁成像。(A)注射双特异性 TFlO (80 u g, 5. 07xl(T10mol)，接着在 16 小时后施用 luIn-IMP-288 (30 u Ci, 5. 07xl(Tnmol)的小鼠的图像。该图像是在3小时后获取的。增加图像本底的强度从而使其与施用单独111In-IMP-288(30uCi, 5. 07xl0_11mol)时获得的图像强度匹配。(B)在给予单独mIn-MP_288的小鼠中未观察到靶向。(C)给予mIn-D0TA-PAM4-IgG(20 u Ci, 50 u g)、在24小时之后成像的小鼠图像。虽然可见肿瘤，但在这个时间点仍然存在相当强的本底活性。图11.荷有CaPanl人胰腺癌异种移植物(预靶向和IgG动物组的平均肿瘤重量+/-SD分别为0. 28+/-0. 21和0. 10+/-0. 06g)的裸小鼠中ulIn-D0TA-PAM4-IgG(20 u Ci, 50 u g)和 TFlO-预靶向的 luIn-IMP-288 (80 u g, 5. 07xl(T10moI TF10,16 小时后 30 u Ci, 5. 07xl0_nmolmIn-MP-288)的延长生物分布。图12.用 0. 15mCi 9°Y_hPAM4IgG 或者 0. 25 或 0. 50mCi TFlO-预靶向的 9°Y_MP_288对所形成的CaPanl肿瘤CO. 4cm3)进行的单次治疗的治疗活性。图13.吉西他滨对PT-RAIT疗法的增强作用。图14.西妥昔单抗与吉西他滨和PT-RAIT的组合的作用。图15.利用基于PAM4的免疫测定的胰腺癌鉴别诊断。红色线表示基于ROC分析选定的阳性结果的截断水平。图16.来自健康志愿者和处于不同分期的胰腺癌个体的患者血清中PAM4抗原的频率分布。图17. PAM4血清免疫测定的ROC曲线。图18. PAM4免疫测定的准确度确定为在2. 40单位/mL的截断值处或之上测得的标称浓度的10%范围内。计算得线性趋势，方程为y=0. 965x+0. 174，拟合优度r2=0. 999。图19.患者血清中PAM4反应性抗原根据病期的频率分布。截断值=2. 4单位/mL(红色线)。示出每个研究组的中位值(单位/mL)。
图20.针对基于PAM4的免疫测定执行情况的接受者操作特征(ROC)曲线；胰腺腺癌与健康成体的比较。提供了曲线下面积(AUC)和95%置信限的值。详述定义除非另有说明，否则“一个”或“一种”表示一个(种)或多个(种)。本文所用的“约”表示加或减10%。例如“约100”将包括介于90和110之间的任
何数字。本文所述的术语“PAM4抗体”包括鼠PAM4抗体、嵌合PAM4抗体、人源化PAM4抗体和人PAM4抗体。在优选的实施方案中，PAM4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: I至SEQ ID NO: 6 的 CDR 序列。本文所用的“PAM4抗原”是被PAM4抗体结合的抗原。在优选的实施方案中，通过用DTT或高碘酸盐处理PAM4抗原来抑制或阻止PAM4抗体的结合。在更优选的实施方案中，PAM4抗原是由胰腺癌细胞表达的粘蛋白如MUC-I或MUC-5的表位。本文所用的“抗胰腺癌抗体”是表现出与PAM4抗体相同的诊断、治疗和结合特征的抗体。在优选的实施方案中，“抗胰腺癌抗体”与PAM4抗体结合到相同的表位上。“非内分泌性胰腺癌” 一般是指由外分泌胰腺产生的癌症。该术语不包括胰腺胰岛素瘤，而包括胰腺癌、胰腺腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌和巨细胞癌以及前驱病变，如胰腺上皮内瘤变(PanIN)、粘液性囊性赘生物(MCN)和胰腺内粘液性赘生物(IPMN)，它们是赘生性的，但还不是恶性的。术语“胰腺癌”和“非内分泌性胰腺癌”在本文互换使用。本文所述的抗体是指全长(即，天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分如抗体片段。抗体片段是抗体的一部分,如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。无论何种结构,抗体片段所结合的抗原都与全长抗体所识别的抗原相同。术语“抗体片段”也包括由抗体可变区组成的分离片段，如由重链和轻链可变区组成的〃Fv〃片段，以及其中轻和重可变区由肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。裸抗体是未缀合到治疗或诊断剂上的抗体或其片段。一般地，抗体分子的Fe部分提供效应子功能，例如补体介导的细胞毒性(CDC)和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，其启动可导致细胞裂解的机制。然而，Fe部分可能不是治疗功能所需要的，而是其它机制如信号诱导的凋亡发挥作用。裸抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及融合蛋白和某些重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
嵌合抗体是重组蛋白，其含有包括来源于一种物种的抗体，优选啮齿动物抗体的互补决定区(CDR)的可变结构域，而所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体恒定结构域。对于兽医学应用，所述嵌合抗体的恒定结构域可以来源于其它物种如猫或狗的恒定结构域。人源化抗体是重组蛋白，其中来自一种物种的抗体，例如啮齿动物抗体的⑶R已从所述啮齿动物抗体的重和轻可变链转移到人重和轻可变结构域(例如，构架区序列)中。所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，可以将亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的构架区氨基酸残基置换到人抗体构架区序列中。人抗体是例如从已经过“工程化”从而在响应于抗原攻击时产生特定人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基因座元件引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源性鼠重链和轻链基因座的靶向性破坏。该转基因小鼠可以合成对特定抗原有特异性的人抗体，并且该小鼠可以用来生成人抗体分泌杂
交瘤。从转基因小鼠获取人抗体的方法在Green等，Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg等，Nature 368:856 (1994),和 Taylor 等，Int. Tmmun. 6:579 (1994)中有描述。全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，所有这些技术都是本领域已知的。参见，例如，McCafferty等，Nature 348:552-553 (1990)，该文献描述了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库于体外生成人抗体及其片段的方法。在这种技术中，将抗体可变结构域基因框内克隆到丝状噬菌体的较大或较小外壳蛋白基因中，并作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择还导致对编码表现出这些特性的抗体的基因的选择。以这种方式，噬菌体模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，关于它们的综述参见，例如 Johnson 和 Chiswell, Current Opinion in StructuralBiology3:5564-571 (1993)。人抗体也可以由体外激活的B细胞产生。参见美国专利第5，567，610号和第5，229，275号，其实施例部分以引用方式并入本文。治疗剂是与抗体部分单独、同时或相继施用或者缀合到抗体部分，即抗体或抗体片段或亚片段上，并且可用于治疗疾病的化合物、分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、细胞毒性剂、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。下面更详细地描述了有用的治疗剂。诊断剂是分子、原子或其它可检测部分，其可以通过缀合到抗体部分或可靶向构建体上施用，并且对于通过定位含有靶抗原的细胞来检测或诊断疾病有用。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料、造影剂、荧光化合物或分子和磁共振成像(MRI)或正电子发射断层成像(PET)扫描用增强剂(例如，顺磁离子)。优选地，所述诊断剂选自由放射性同位素、用于磁共振或PET成像的增强剂和荧光化合物组成的组。为了用放射性金属、顺磁离子或其它诊断阳离子加载抗体组分，可能需要使它与具有连接多个螯合基团以结合所述离子的长尾的试剂反应。这样的尾可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其它衍生化链或可衍生链，所述螯合基团为例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、D0TA、NOTA, NETA、卩卜啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。采用标准化学方法使螯合物偶联至抗体。所述螯合物通常通过能够以使免疫反应性损失最小、聚集和/或内部交联最小的方式与所述分子形成键的基团连接至抗体。用于使螯合物缀合到抗体上的其它较不寻常的方法和试剂公开在美国专利第4，824，659号中，该专利的实施例部分以引用方式并入。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60至4，OOOkeV的诊断同位素一起用于放射成像，所述同位素为例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、mIn、67Ga、68Ga、99niTC、94mTC、nC、13N、150、76Br。所述螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可与本发明抗体一起用于MRI。大环螯合物如NOTA(l，4，7-三氮杂环壬烷-N，N’，N"-三乙酸)、DOTA (1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸)和TETA (对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)可分别与多种金属和放射性金属，最特别是与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其它环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于放射免疫疗法(RAIT)的223Ra有价值。最近，用可用于PET成像的18F原子标记几乎任何分子的通用技术描述于美国专利第7，563，433号中，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文。免疫缀合物是缀合到至少一种治疗剂和/或诊断剂上的抗体、抗体片段或抗体融合蛋白。所述诊断剂和/或治疗剂如上所定义。
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表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达处于某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型启动子或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。据说此种基因“可操作地连接至”调节元件。重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。这个术语还包括经基因工程化从而在宿主细胞染色体或基因组中含有克隆基因的那些原核或真核细胞以及转基因动物。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如SP2/0细胞和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞系和其它可用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞。此外，用于表达mAb和其它融合蛋白的特别有用的宿主细胞是用凋亡抑制剂如Bcl-EEE基因转染并适应于在无血清条件下生长和进一步转染的SP2/0细胞，如美国专利第7，531，327号、第7，537，930号和第7，608，425号中描述的，这些专利的实施例部分以引用方式并入本文。PAM4 抗体本发明各种实施方案涉及相对于正常或良性胰腺组织以非常高的选择性与胰腺癌反应的抗体。所述抗胰腺癌抗体及其片段优选针对来自人胰腺肿瘤的粗粘蛋白制剂产生，虽然可以利用部分纯化或甚至纯化的粘蛋白。此类抗体的非限制性实例为PAM4抗体。鼠PAM4 (mPAM4)抗体通过采用来源于异种移植的RIP-I人胰腺癌的胰腺癌粘蛋白作为免疫原来制备。(Gold等，Int. J. Cancer, 57:204-210, 1994)。如下所讨论，抗体交叉反应性和免疫组织化学染色研究表明PAM4抗体识别靶胰腺癌抗原上的独特的新表位。免疫组织化学染色研究，例如实施例2中所描述的研究，已证明PAM4 MAb结合到由乳腺癌、胰腺癌和其它癌症细胞表达的抗原上，与正常人组织的结合受限；然而，最高的表达通常来自胰腺癌细胞。因而，PAM4抗体对胰腺癌有相对特异性，并优先结合胰腺癌细胞。PAM4抗体与可内化的靶表位起反应。这个表位主要由与胰腺癌相关而与局灶性胰腺炎或正常胰腺组织无关的抗原表达。PAM4抗体与PAM4抗原的结合通过用DTT或高碘酸盐处理所述抗原来抑制。在动物模型中使用放射性标记PAM4MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向性和治疗效力。
PAM4抗体结合到PAM4抗原上，PAM4抗原由许多器官和肿瘤类型表达，但优先表达于胰腺癌细胞中。利用例如实施例3中的PAM4MAb进行的研究表明，所述抗体表现出数种重要的特性，使其成为临床诊断和治疗应用的良好候选物。PAM4抗原提供了对于胰腺癌和其它癌症的诊断和治疗有用的靶。PAM4抗体显然识别出胰腺癌抗原的表位，其与由非PAM4抗胰腺癌抗体(CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、CEACAM5、B72. 3、抗-Lea和其它抗路易斯抗原)识别的表位不同。令人惊讶地，下面的实施例表明患有非常早期的胰腺癌患者的血清中存在可检出浓度的PAM4抗原。还令人惊讶的是，新鲜人血清中似乎存在可结合到PAM4抗原上的PAM4抗体的内源性抑制剂。所述抑制剂通过长期冷冻储存血清样品除去，或通过对新鲜血清进行有机相萃取除去。这些意外的结果为利用血液、血清或血浆样品进行的相对非侵入性的胰腺癌早期测试提供了基础。对于治疗使用，适合于与PAM4抗体组合使用或结合使用的抗体包括，例如，抗体 CA19. 9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72. 3、CC49、抗-CEA、抗-CEACAM6、抗-Lea、抗-HLA-DR、 抗-⑶40、抗-⑶74、抗-⑶138，和由路易斯抗原Le (y)定义的抗体，或针对以下的抗体结肠特异性抗原-P(CSAp)、MUC-U MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC_5ac、MUC-16、MUC-17, EGP-UEGP-2、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF和P1GF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6及癌基因产物(bcl-2、Kras、p53)、cMET,以及针对肿瘤坏死物质的抗体，例如授予Epstein等的专利(美国专利第6，071, 491号、第6. 017, 514号、第5，019，368号和第5，882，626号)中描述的。此类抗体可用于补充PAM4抗体免疫检测和免疫治疗方法。当在PAM4抗体施用之前施用、与PAM4抗体一起施用或在PAM4抗体施用之后施用时，这些和其它治疗剂可以与抗胰腺癌抗体如PAM4抗体协同作用。在治疗应用中，与抵抗肿瘤细胞的效应细胞功能有关的免疫调节剂激动或拮抗性抗体也可以与单独的PAM4抗体组合使用，或者与其它肿瘤相关性抗体组合使用，一个实例是针对 CD40 的抗体。Todryk 等，J. TmmunoI Methods, 248:139-147 (2001) ; Turner 等，J. Immunol, 166:89-94(2001)。此外，也可使用针对标记或癌基因产物(例如，bcl_2、Kras、p53、cMET)的抗体，或针对血管生成因子，如VEGFR和胎盘样生长因子(PlGF)的抗体。另一种可结合到PAM4抗原不同表位上的PAM4样抗体的可利用性对于可用来检测临床样品中PAM4抗原的双决定簇酶联免疫吸附测定(ELISA)的开发是重要的。ELISA实验描述于实施例I和5中。本文所述的鼠PAM4抗体、嵌合PAM4抗体、人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体及其片段是用于诊断和/或治疗方法中的示例性抗胰腺癌抗体。下面的实施例公开了人源化PAM4抗体的构建和使用的优选实施方案。因为非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白，并且重复注射可以导致有害的超敏反应，所以鼠抗体序列的人源化可以减少患者可能经历的不良免疫响应。对于基于鼠的单克隆抗体，这通常称为人抗小鼠抗体(HAMA)响应。优选将人源化抗胰腺癌抗体或其片段的构架区中的某些人残基用它们的鼠对应物替代。还优选将来自两种不同人抗体的构架序列的组合用于VH。所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。抗体制备针对特定抗原的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如，Kohler 和 Milstein, Nature 256:495(1975)，和 Coligan 等，(编著)，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第 I 卷，第 2. 5. 1-2. 6. 7 页(John Wiley & Sons 1991)(在下文称为"Coligan")。简言之，抗胰腺癌MAb可以通过如下方法获得给小鼠注射包含来自胰腺癌的粘蛋白例如PAM4抗原的组合物，通过取出血清样品来证实抗体产生的存在，取出脾脏从而获得B淋巴细胞，使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对PAM4抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对PAM4抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤培养物中分离出抗胰腺癌抗体。在初始产生针对所述免疫原的抗体之后，可以对所述抗体进行测序，随后通过重组技术来制备所述抗体从而产生嵌合抗体或人源化抗体。鼠抗体和抗体片段的嵌合是本领域技术人员熟知的。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的通用技术在例如以下出版物中有描述0rlandi等，Proc Nat’l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)，其以引用方式并入本文。一般而言，鼠抗体的Vk(轻链可变区)和Vh (重链可变区)序列可以通过多种分子克隆程序，例如RT-PCR、5’ -RACE和cDNA文库筛选获得。具体地，通过RT-PCR，通过PCR扩增从杂交瘤细胞中克隆出鼠PAM4 MAb的Vh和Vk序列，然后通过DNA测序测定它们的序列。为了证实它们的真实性，可以按照 Orlandi 等，(Proc Natl. Acad. Sci. , USA, 86:3833, 1989)所述使克隆的 Vk^PVh基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab。在优选的实施方案中，嵌合PAM4抗体或抗体片段包含鼠PAM4MAb的互补决定区(CDR)和构架区(FR)以及人抗体的轻链和重链恒定区，其中嵌合PAM4的轻链可变区的CDR包含包含 SASSSVSSSYLY (SEQ ID NO: I)的氨基酸序列的 CDRl、包含 STSNLAS (SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列的⑶R2，和包含HQWNRYPYT (SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列的⑶R3 ;并且嵌合PAM4 MAb的重链可变区的⑶R包含包含SYVLH (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列的⑶R1、包含YINPYNDGTQYNEKFKG (SEQ ID NO :5)的氨基酸序列的 CDR2 和包含 GFGGSYGFAY (SEQ ID NO :6)的氨基酸序列的CDR3。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少与鼠恒定区的免疫原 性相关的潜在问题。鼠抗体和抗体片段的人源化也是本领域技术人员熟知的。生成人源化MAb的技术公开在例如以下文献中Carter 等，Proc Nat’l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Singer等，J. Tmmun. 150:2844 (1992)，Mountain 等，Biotechnol Genet Eng Rev. 10:1 (1992),和Coligan第10. 19. 1-10. 19. 11页，这些文献以引用方式并入本文。例如，可以通过将来自小鼠免疫球蛋白重和轻可变链的鼠互补决定区转移到人可变结构域中，然后取代鼠对应物构架区中的人残基，产生人源化单克隆抗体。除了人恒定区序列之外，人构架区序列的使用还进一步减少诱导HAMA反应的概率。按照Leung等(Mol Immunol. 32:1413 (1995))所描述,可以基于如上所述获得的PAM4可变区序列，设计和构建人源化PAM4抗体，该文献以引用方式并入本文。实施例I描述了用于构建hPAM4 MAb的人源化方法。用于制备hPAM4抗体的引物的核苷酸序列在下面的实施例I中有讨论。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或抗体片段包含上面所公开的轻链和重链CDR序列(SEQ IDNO: I至SEQ ID NO:6) o还优选所述人源化抗体的轻链和重链可变区的FR包含至少一种被鼠PAM4 MAb的所述相应FR取代的氨基酸。全人抗体，例如人PAM4可以从转基因非人动物中获得。参见，例如，Mendez等，Nature Genetics, 15:146-156(1997);美国专利第5，633，425号。例如，可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收人抗体。通过灭活内源免疫球蛋白基因和引入人免疫球蛋白基因座，将小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂，并包含大量的不连续区段，这些不连续区段总共几乎占据人基因组的0. 2%。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体库，必须将人重链和轻链基因座的大部分引入小鼠基因组中。这以分步法完成，从在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)的形成开始。因为每个插入片段大小约为1Mb，所以YAC构建需要免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。通过使含有YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞融合将一个含有重链基因座而另一个含有轻链基因座的两个YAC单独地引入小鼠中。然后将胚胎干细胞克隆显微注射到小鼠囊胚中。根据通过其种系传输YAC的能力筛选所得嵌合雄鼠，然后使其与鼠抗体产生缺陷型小鼠品种。繁育两个转基因品系，一个含有人重链基因座，另一个含有人轻链基因座，产生 在响应于免疫时产生人抗体的后代。然而，这些技术不是限制性的，也可以采用本领域已知的生成人抗体的其它方法，例如使用噬菌体展示来生成人抗胰腺癌抗体。可以采用本领域已知的方法通过细胞培养技术生成抗体。在一个实例中，转染瘤培养物适应于无血清培养基。为了生成人源化抗体，使用HSFM使细胞在滚瓶内生长成500ml培养物。离心培养物，并通过0. 2 ii m膜过滤上清液。使过滤的培养基以lml/min的流速通过蛋白A柱(1x3cm)。然后用约10个柱体积的PBS洗涤树脂，并用含有IOmM EDTA的0. IM甘氨酸缓冲液(pH 3. 5)从柱上洗脱蛋白A结合的抗体。将I. Oml级分收集在含有IOu I 3 M Tris (pH 8.6)的管中，从280/260nm处的吸光度确定蛋白质浓度。汇集峰级分，对PBS透析,例如用Centricon 30过滤器(Amicon, Beverly, MA)浓缩抗体。通过ELISA测定抗体浓度，并使用PBS将其浓度调节至约lmg/ml。向样品中适当地加入0. 01%(w/v)叠氮化钠作为防腐剂。可以通过多种良好建立(well-established)的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化抗体。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见，例如，Coligan第2. 7. 1-2. 7. 12页和第2. 9. 1-2. 9. 3页。另外，参见Baines等，〃Purification of Immunoglobulin G (IgG)，〃，于 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10 卷，第 79-104 页(The Humana Press, Inc. 1992)。可以通过本领域技术人员熟知的多种技术表征抗胰腺癌MAb。例如，可以利用间接酶免疫测定、流式细胞仪分析、ELISA或蛋白质印迹分析验证抗体结合至PAM4抗原的能力。抗体片段抗体片段是抗体的抗原结合部分，例如F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFv等。识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。F(ab' )2片段，例如可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生。这些和其它方法描述于，例如Goldenberg，美国专利第4，036，945号和第4，331，647号以及其中所包含的参考文献中。另外，参见Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960) ; Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman等，于 METHODS IN ENZYM0L0GY,第 I 卷，第 422 页(Academic Press 1967)，和 Coligan第2. 8. 1-2. 8. 10页和第2. 10. -2. 10. 4页。或者，可以构建Fab’表达文库(Huse等，1989，Science, 246:1274-1281)，以允许快速且容易地鉴定出具有所需特异性的单克隆Fab’片段。单链Fv分子(scFv)包含\结构域和Vh结构域。\结构域和Vh结构域联合形成革El结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。如果Vlj结构域是scFv分子的N端部分，则scFv分子表示为Vf L-Vh，或者如果Vh结构域是scFv分子的N端部分，则scFv分子表示为Vh-L-'。用于制备scFv分子和设计合适的肽接头的方法描述于美国专利第 4，704，692 号，美国专利第 4，946，778 号，R. Raag 和 M. Whitlow，"Single ChainFvs. "FASEB,第 9 卷73-80 (1995)以及 R. E. Bird 和 B. W. Walker, Single Chain AntibodyVariable Regions, TIBTECH,第 9 卷132-137(1991)。其它抗体片段，例如单结构域抗体片段是本领域已知的，并可以用于要求保护的构建体中。可以例如采用标准免疫技术从骆5它(camel)、羊5它(alpaca)或美洲5它(llama)中获得单结构域抗体(VHH)。(参见，例如，Muyldermans 等，TIBS 26:230-235, 2 001; Yau 等，J TmmunOI Methods 281:161-75，2003;Maass 等，J TmmunoI Methods 324:13-25,2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规Vh-'对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG含有约50%的只有骆驼重链的IgG抗体(HCAb)(Maass等，2007)。可以用已知抗原如TNF- a免疫羊驼，然后可以分离出结合到靶抗原上并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可以将它用来构建羊驼VHH噬菌体展示文库，可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等，2007)分离抗体片段。可通过使全长抗体蛋白水解或者通过在大肠杆菌或另一宿主中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可采用常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶裂解抗体来产生抗体片段，从而提供称为F(ab' )2的约IOOKd片段。这种片段可以利用硫醇还原剂和任选的用作由二硫键裂解形成的巯基的保护基进一步裂解，从而产生约50Kd Fab’单价片段。或者，利用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fe片段。也可以使用裂解抗体的其它方法，如分离重链从而形成单价轻链-重链片段，片段的进一步裂解，或其它酶、化学或遗传技术，只要所述片段可结合到由完整抗体识别的抗原上即可。抗体融合蛋白和多价抗体包含目标抗胰腺癌抗体的融合蛋白可以通过多种常规程序制备，范围为从官能团之间的戊二醛连接至更多特定连接。包含本文所述的融合蛋白的抗体和/或抗体片段优选彼此直接共价结合或通过接头部分，通过抗体或片段上的一个或多个官能团，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基而共价结合。除戊二醛之外，还可以使用各种常规接头，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯
坐寸o用于生成融合蛋白的一个简单方法是在戊二醛的存在下混合抗体或抗体片段。初始的希夫(schiff)碱键合可以例如通过用硼氢化物将其还原成仲胺来稳定化。可以用二异硫氰酸酯或碳二亚胺代替戊二醛作为非位点特异性接头。在一个实施方案中，抗体融合蛋白包含抗胰腺癌MAb或其片段，其中所述MAb可结合到PAM4抗原上。这种融合蛋白及其片段优先结合胰腺癌细胞。这种单价单特异性MAb可用于直接靶向抗原，其中所述MAb连接至治疗剂、诊断剂或其组合，并且将蛋白质直接施用给患者。所述融合蛋白可以替代地包含可结合到PAM4抗原不同表位上的至少两种抗胰腺癌MAb。例如，所述MAb可以产生抗原特异性双链抗体、三链抗体和四链抗体，它们对于PAM4抗原是多价的但为单特异性的。两个或更多个scFv分子的非共价缔合可以形成功能性双链抗体、三链抗体和四链抗体。单特异性双链抗体是相同scFv的同型二聚体，其中每个scFv均包含来自所选抗体的Vh结构域,其通过短接头连接至相同抗体的Vlj结构域。双链抗体是由两个scFv的非共价缔合形成的二价二聚体,产生两个Fv结合位点。三链抗体是由三个scFv形成的三价三聚体，产生三个结合位点，四链抗体是由四个scFv形成的四价四聚体，产生四个结合位点。已使用含有包含VhI-接头-'I的重组基因构建体的表达载体制备数种单特异性双链抗体。参见，Holliger等，Proc Natl. Acad. Sci USA90:6444-6448(1993);Atwell 等，Molecular Immunology 33:1301-1302(1996);Holliger等，Nature Biotechnology 15 : 632-631 (1997) ;Helfrich 等，Int J Cancer76:232-239(1998);Kipriyanov 等，Int J Cancer 77:763-772(1998);Holiger 等，Cancer Research 59:2909-2916 (1999))。构建 scFv 的方法公开在美国专利第 4，946，778 号(1990)和美国专利第5，132，405号(1992)中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。基于scFv生成多价单特异性抗体的方法公开在美国专利第5，837，242号(1998)、美国专利第5，844，094号(1998)和W0-98/44001 (1998)中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。所述多价单特异性抗体融合蛋白结合到两个或更多个相同类型的表位上，所述表位可以位于相同的抗原或不同的抗原上。增加的化合价允许额外的相互作用、增加的亲和性和更长的停留时间。这些抗体融合蛋白可以用于直接靶向系统中，其中所述抗体融合蛋白缀合到治疗剂、诊断剂或其组合上，并直接施用给需要它的患者。优选的实施方案是多价多特异性抗体或其片段，其包含一个或多个对PAM4靶表位有亲和性的抗原结合位点，和一个或多个另外的针对与胰腺癌相关的其它表位的结合位点。这种融合蛋白是多特异性的，因为它结合至少两个不同的表位，该表位可位于相同或不同的抗原上。例如，所述融合蛋白可以包含一个以上的抗原结合位点，第一抗原结合位点对PAM4抗原表位有亲和性，第二抗原结合位点对另一种靶抗原如TAG-72或CEA有亲和性。另一个实例是可包含CA19. 9MAb (或其片段)和PAM4 MAb (或其片段)的双特异性抗体融合蛋白。此种融合蛋白将对CA19.9和PAM4抗原有亲和性。所述抗体融合蛋白及其片段可以用于直接靶向系统中，其中所述抗体融合蛋白缀合到治疗剂、诊断剂或其组合上，并直接施用给需要它的患者。另一个优选的实施方案是多价多特异性抗体，其包含至少一个对PAM4抗原表位有亲和性的结合位点和至少一个对半抗原分子有亲和性的半抗原结合位点。例如，双特异性融合蛋白可以包含679MAb (或其片段)和PAM4 MAb (或其片段)。单克隆679抗体以高亲和性结合到含有三肽部分组胺琥珀酰亚胺甘氨酰(HSG)的分子上。如上所述，此种双特异性PAM4抗体融合蛋白可以例如通过获得来自679的F(ab' )2片段来制备。用DTT温和地还原679F (ab’) 2片段的链间二硫桥键，需小心避免轻链-重链键合形成，从而形成Fab’ -SH片段。该SH基团用过量的双马来酰亚胺接头(1，I’-(亚甲基二-4，I-亚苯基)双-马来酰亚胺)活化。将PAM4 MAb转化成Fab’ -SH,然后使其与活化的679 Fab’ -SH片段反应从而获得双特异性抗体融合蛋白。双特异性抗体融合蛋白例如这种蛋白可以用于亲和性增强系统中，其中所述靶抗原用融合蛋白进行预靶向，随后用连接至含有一种或多种HSG半抗原的载体部分(可靶向构建体)的诊断或治疗剂靶向。在替代的优选实施方案中，基于DNL的hPAM4-679构建体，如TFlO可以按照下面的实施例中所描述的方法制备和使用。双特异性抗体可以通过多种常规方法和基因工程制备，所述常规方法为例如完整IgG或优选F(ab’)2片段的混合物的二硫化物裂解和重新形成，一个以上的杂交瘤融合以形成产生具有一种以上的特异性的抗体的多瘤(polyoma)。已通过氧化裂解由不同抗体的还原裂解产生的Fab’片段来制备双特异性抗体融合蛋白。这可有利地如下进行将由两种不同的抗体的胃蛋白酶消化产生的两种不同的？(&13’)2片段混合，还原裂解从而形成Fab’片段混合物，接着氧化重新形成二硫键从而产生Fab’片段混合物，其包括含有对每个原始表位有特异性的Fab’部分的双特异性抗体融合蛋白。制备抗体融合蛋白的通用技术可见于例如 Nisonoff 等，Arch Biochem Biophys. 93:470 (1961)，Hammerling 等，J ExpMed. 128:1461 (1968)，和美国专利第 4，331，647 号。
更具选择性的键合可以通过使用异型双功能接头如马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯实现。所述酯与抗体或片段的反应将使所述抗体或片段上的氨基衍生化，然后所得衍生物可以与，例如具有游离巯基的抗体Fab片段(或具有通过例如Traut试剂附接在其上的巯基的较大片段或完整抗体)反应。此种接头与同一抗体中的基团交联的可能性较小，并提闻键合的选择性。将抗体或片段在远离抗原结合位点的位点处连接是有利的。这可以通过，例如对如上所述的裂解的链间巯基进行连接来完成。另一种方法涉及使具有氧化糖部分的抗体与另一种具有至少一个游离胺官能的抗体反应。这产生初始希夫碱键合，所述希夫碱键合优选通过还原成仲胺来稳定化，例如通过硼氢化物还原，从而形成最终的复合物。对于小分子，此类位点特异性键合公开在美国专利第4，671，958号中，而对于较大附加物则公开在美国专利第4，699，784号中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。具有长度大于12个氨基酸残基的接头(例如，15个或18个残基接头)的ScFv允许在同一链上的V1^P '结构域之间相互作用，一般形成单体、二聚体(称为双链抗体)和少量较高质量的多聚体的混合物(Kortt等人，Eur J Biochem. (1994) 221:151-157)。然而，具有5个或更少氨基酸残基的接头的ScFv阻止同一链上的Vh和\结构域的分子内配对，迫使与不同链上的Vh和'结构域配对。介于3个残基和12个残基之间的接头主要形成二聚体(Atwell 等，Protein Engineering(1999) 12:597-604)。对于介于 0 个残基和 2个残基之间的接头，形成scFv的三聚体(称为三链抗体)、四聚体(四链抗体)或更高的寡聚结构；然而，除接头长度之外，寡聚化的确切模式似乎还取决于V结构域的组成和取向。最近，用于构建几乎任何组合中的抗体、抗体片段和/或其它效应部分的混合物的新技术已描述于美国专利第7，550，143号、第7，521,056号、第7，534，866号、第7，527，787号和第7，666，400号中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。该技术一般称为停靠和锁定(DNL)，涉及在其N或C端包含两个互补肽序列之一的融合蛋白的生成，所述两个互补肽序列称为二聚化和停靠结构域(DDD)序列和锚定结构域(AD)序列。在优选的实施方案中，DDD序列来源于cAMP依赖性蛋白激酶的调节亚基，而AD序列来源于A激酶锚定蛋白(AKAP)的序列。DDD序列形成结合到AD序列上的二聚体，这允许三聚体、四聚体、六聚体或多种其它复合物中的任一种的形成。通过将效应部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD序列，可以由任何所选的抗体或抗体片段的组合形成复合物。DNL复合物可以通过形成二硫键或其它键合而共价稳定化。已知抗体可以利用包含任何已知抗-TAA抗体的抗原结合可变区序列的双特异性抗体，其包括但不限于hPAM4(美国专利第7，282，567号)、hA20(美国专利第7，251，164号)、hA19 (美国专利第7，109，304号)、hIMMU31 (美国专利第7，300，655号)、hLLl (美国专利第 7，312，318 号)、hLL2 (美国专利第 7，074，403 号)、hMu_9 (美国专利第 7，387，773 号)、hL243 (美国专利第7，612，180号)、hMN-14 (美国专利第6，676，924号)、hRS7 (美国专利第7，238，785号)、hMN_3 (美国专利第7，541，440号)、hMN_15 (2010年7月29日提交的美国专利申请序列第12/846，062号)和hRl(2010年3月12日提交的美国专利申请序列第12/772，645号)，所列举的每篇专利或专利申请的实施例部分均以引用方式并入本文。其它有用的抗体可以从多种已知来源商购获得。例如，多种抗体分泌杂交瘤是得自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC, Manassas, VA)。针对包括但不限于肿瘤相关抗原的各种疾病靶的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于要求保护的方法和组合物中。参见，例如，美国专利第7，312，318号、第 7，282，567 号、第 7，151，164 号、第 7，074，403 号、第 7，060，802 号、第 7，056，509 号、第 7，049，060 号、第 7，045，132 号、第 7，041，803 号、第 7，041，802 号、第 7，041，293 号、第 7，038，018 号、第 7，037，498 号、第 7，012，133 号、第 7，001，598 号、第 6，998，468 号、第 6，994，976 号、第 6，994，852 号、第 6，989，241 号、第 6，974，863 号、第 6，965，018 号、第 6，964，854 号、第 6，962，981 号、第 6，962，813 号、第 6，956，107 号、第 6，951，924 号、第 6，949，244 号、第 6，946，129 号、第 6，943，020 号、第 6，939，547 号、第 6，921，645 号、第 6，921，645 号、第 6，921，533 号、第 6，919，433 号、第 6，919，078 号、第 6，916，475 号、第 6，905，681 号、第 6，899，879 号、第 6，893，625 号、第 6，887，468 号、第 6，887，466 号、第 6，884，594 号、第 6，881，405 号、第 6，878，812 号、第 6，875，580 号、第 6，872，568 号、第 6，867, 006 号、第 6，864, 062 号、第 6，861, 511 号、第 6，861, 227 号、第 6，861, 226 号、第 6，838，282 号、第 6，835，549 号、第 6，835，370 号、第 6，824，780 号、第 6，824，778 号、第 6，812，206 号、第 6，793，924 号、第 6，783，758 号、第 6，770，450 号、第 6，767，711 号、第 6，764，688 号、第 6，764，681 号、第 6，764，679 号、第 6，743，898 号、第 6，733，981 号、第 6，730，307 号、第 6，720，15 号、第 6，716，966 号、第 6，709，653 号、第 6，693，176 号、第 6，692，908 号、第 6，689，607 号、第 6，689，362 号、第 6，689，355 号、第 6，682，737 号、第 6，682，736 号、第 6，682，734 号、第 6，673，344 号、第 6，653，104 号、第 6，652，852 号、第 6, 635, 482 号、第 6, 630, 144 号、第 6, 610, 833 号、第 6, 610, 294 号、第 6, 605, 441 号、第 6，605，279 号、第 6，596，852 号、第 6，592，868 号、第 6，576，745 号、第 6，572;856 号、第 6, 566, 076 号、第 6, 562, 618 号、第 6, 545, 130 号、第 6, 544, 749 号、第 6, 534, 058 号、第 6, 528, 625 号、第 6, 528, 269 号、第 6, 521, 227 号、第 6, 518, 404 号、第 6, 511, 665 号、第 6，491，915 号、第 6，488，930 号、第 6，482，598 号、第 6，482，408 号、第 6，4 79，247 号、第 6, 468, 531 号、第 6, 468, 529 号、第 6, 465, 173 号、第 6, 461, 823 号、第 6, 458, 356 号、第6，455，044 号、第 6，455，040 号、6，451，310 号、第 6，444，206 号、6，441，143 号、第 6，432，404号、第 6，432，402 号、第 6，419，928 号、第 6，413，726 号、第 6，406，694 号、第 6，403，770 号、第 6，403，091 号、第 6，395，276 号、第 6，395，274 号、第 6，387，350 号、第 6，383，759 号、第 6，383，484 号、第 6，376，654 号、第 6，372，215 号、第 6，359，126 号、第 6，355，481 号、第 6, 355, 444 号、第 6, 355, 245 号、第 6, 355, 244 号、第 6, 346, 246 号、第 6, 344, 198 号、第 6，340，571 号、第 6，340，459 号、第 6，331，175 号、第 6，306，393 号、第 6，254，868 号、第 6，187，287 号、第 6，183，744 号、第 6，129，914 号、第 6，120，767 号、第 6，096，289 号、第 6，077，499 号、第 5，922，302 号、第 5，874，540 号、第 5，814，440 号、第 5，798，229 号、第 5，789，554 号、第 5，776，456 号、第 5，736，119 号、第 5，716，595 号、第 5，677，136 号、第5，587，459号、第5，443，953号和第5，525，338号，其中的每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。这些仅为示例性的，多种其它抗体及其杂交瘤是本领域已知的。技术人员将会意识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤都可以通过在ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单地检索针对选定的目标疾病相关靶的抗 体而获得。可以采用本领域熟知的标准技术，对克隆的抗体的抗原结合结构域进行扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并用于蛋白质生成。预靶向双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术中。预靶向是多步骤过程，最初开发用于解决直接靶向抗体的血液清除缓慢，导致对正常组织如骨髓造成不期望的毒性的问题。利用预靶向，放射性核素或其它治疗剂连接至小递送分子(可靶向构建体或可靶向缀合物)上，这种小分子可在几分钟内从血液中清除。首先施用具有针对可靶向构建体和靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使游离抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。预靶向方法是本领域熟知的，例如，如以下所公开的Goodwin等，美国专利第 4, 863, 713 号；Goodwin 等，J. Nucl. Med. 29: 226, 1988 ; Hnatowich 等，J. Nucl.Med. 28: 1294，1987; Oehr 等，J. Nucl. Med. 29:728，1988 ; Kl ibanov 等，J. Nucl.Med. 29:1951, 1988;Sinitsyn 等，J. Nucl. Med. 30:66，1989; Ka Iofonos 等，J.Nucl.Med. 31:1791, 1990 ; Schechter 等，Int. J. Cancer 48:167, 1991;Paganelli 等，CancerRes. 51:5960，1991;Paganelli 等，Nucl. Med. Commun. 12:211，1991 ;美国专利第 5，256，395号;Stickney 等，Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan 等，Cancer Res. 51:3119, 1991;美国专利第6，077，499号；美国专利第6，090，381号；美国专利第6，472，511号；和美国专利第6，962，702 号。治疗或诊断受试者的疾病或病症的预靶向方法可以通过如下提供(I)向受试者施用双特异性抗体或抗原结合抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并允许所述组合物从循环中清除抗体；和(3)向受试者施用含有一种或多种螯合或化学结合的治疗剂或诊断剂的可靶向构建体。该技术也可以用于抗体依赖性酶前药疗法(ADEPT)，方法是施用缀合到可靶向构建体上的酶，接着施用可被所述酶转化成活性形式的前药。抗体的治疗和诊断用途某些实施方案涉及诊断或治疗受试者的恶性肿瘤的方法,其包括向受试者施用抗胰腺癌MAb、融合蛋白或其片段，其中所述MAb、融合蛋白或片段结合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上。还优选诊断或治疗癌症的方法，其包括向受试者施用包含一个或多个针对PAM4抗原的抗原结合位点和一个或多个半抗原结合位点的多价多特异性抗体或其片段，等待足够长的时间以便未结合抗体从受试者血流中清除；和然后向受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到定位抗体的半抗原结合位点上的载体分子。在更优选的实施方案中，所述癌症是非内分泌性胰腺癌。MAb在体外诊断中的用途是熟知的。参见,例如，Carlsson等，Bio/Technology7(6) :567(1989)。例如，可以利用MAb检测来自活检样品的组织中肿瘤相关抗原的存在。采用诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定的技术，MAb也可用来测量临床流体样品中肿瘤相关抗原的量。下面进一步详细讨论体外和体内诊断方法。肿瘤靶向的MAb和毒素的缀合物可以用来在体内选择性地灭杀癌细胞(Spalding,Bio/Technology 9 (8):701 (1991) ;Goldenberg, Scientific AmericanScience & Medicine I⑴64(1994))。例如，在实验性动物模型中进行的治疗研究已证明携带细胞毒放射性核素的抗体的抗肿瘤活性(Goldenberg等，Cancer Res. 41:4354 (1981)，Cheung 等，J. Nat，I Cancer Inst. 77:739 (1986),和 Senekowitsch等，J. Nucl. Med. 30:531 (1989))。在优选的实施方案中，所述缀合物包含9qY标记的hPAM4抗体。所述缀合物可任选地与一种或多种其它治疗剂结合施用。在优选的实施方案中，将90Y标记的hPAM4与吉西他滨或5-氟尿嘧啶一起施用给胰腺癌患者。在进一步优选的实施方案中，9°Y缀合到用于连接至hPAM4的DOTA螯合物上。在又进一步优选的实施方案中，90Y-DOTA-hPAM4与吉西他滨以分次给药方式组合，包括，例如其中重复的较低的低毒性剂量的吉西他滨与较低的分次剂量的9°Y-D0TA-hPAM4组合的治疗周期。因为能耐受，所以这种分次给药方案的重复周期是适用的。举例来说，每周4剂200mg/m2吉西他滨与每周3剂8mg/m29°Y-D0TA_hPAM4组合，构成单个治疗周期，后者开始于吉西他滨施用的第二周。每种组分的又其它较高和较低的剂量也可构成分次剂量，分次剂量由评估造血毒性的常规方式确定(参见，例如，美国专利第6，649，352号、第7，112，409号、第7，279，289号、第7，465，551号)，因为这两种药剂的骨髓抑制作用可以累加。此种治疗干预的医师可以根据患者的骨髓状态和总体健康状态，根据包括先前暴露于骨髓抑制治疗剂在内的许多因素调整这些剂量。这些原则也可应用于放射性标记hPAM4与包括放射增敏药物例如5-氟尿嘧啶和顺钼在内的其它治疗剂的组合。嵌合抗体、人源化抗体和人抗体及其片段已用于体内治疗和诊断方法。因此涵盖将诊断剂或治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括(i)提供包含缀合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上的抗胰腺癌抗体或其片段(如嵌合、人源化或人PAM4抗体)的组合物，和
(ii)将所述诊断或治疗抗体缀合物施用给受试者。在优选的实施方案中，抗胰腺癌抗体及其片段是人源化或全人的。另一个实施方案涉及治疗恶性肿瘤的方法，其包括施用裸抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白，例如PAM4抗体，单独施用或与一种或多种其它治疗剂结合施用。所述其它治疗剂可以在所述抗体之前、与所述抗体同时，或在所述抗体之后加入。在优选的实施方案中，所述治疗剂是吉西他滨，并且在更优选的实施方案中，吉西他滨与hPAM4放射性缀合物一起按分次给药方案给予，以低于每周给予一次持续6周的吉西他滨的常规800-1，OOOmg/m2剂量的剂量。例如，当与分次治疗剂量的9°Y-PAM4组合时，重复输注旨在用作放射增敏剂的200-380mg/m2吉西他滨分次剂量。技术人员将会意识到，本文描述和要求保护的抗体、融合蛋白和/或其片段可以与包括但不限于热休克蛋白质90 (Hsp90)的任何已知或描述的治疗剂一起施用。在另一种形式的多元模式治疗中，受试者接受与标准癌症化疗结合的免疫缀合物。例如，〃CVB〃(1. 5g/m2 环磷酰胺、200-400mg/m2 依托泊苷(Etoposide)和 150_200mg/m2卡莫司汀(carmustine))是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。Patti等，Eur.J. Haematol. 51:18 (1993)。其它合适的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Freedman 等，〃Non_Hodgkin’ s Lymphomas, 〃 于 CANCER MEDICINE,第 2 卷，第三版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea& Febiger 1993)。举例来说，中间级非霍奇金淋巴瘤(NHL)治疗的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基苄肼(procarbazine)和强的松(prednisone))和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)。有用的第二代化疗方案为m-BAC0D(甲氨喋呤、博莱霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸(leucovorin))，而合适的第三代治疗方案为MACOP-B (甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。另外有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀(bendamustine)和苔藓抑制素-I (bryostatin-1)。本发明涵盖包括融合蛋白及其片段在内的抗胰腺癌抗体及其片段作为裸抗体或抗体片段的单独施用，或作为多元模式治疗施用。优选地，所述抗体是人源化或全人PAM4抗体或其片段。多元模式治疗进一步包括利用裸抗胰腺癌抗体进行的免疫治疗，其中施用裸抗体、融合蛋白形式或作为免疫缀合物的其它抗体作为补充。例如，人源化或全人PAM4抗体可以与另一种裸抗体，或缀合到同位素、一种或多种化疗剂、细胞因子、毒素或其组合上的人源化PAM4抗体或其它抗体组合。例如，本发明涵盖裸或缀合PAM4抗体或其片段的治疗，所述治疗在其它胰腺肿瘤相关抗体的治疗之前，与其组合或在其之后进行，所述其它胰腺肿瘤相关抗体例如CA19. 9、DUPAN2、SPANU Nd2、B72. 3、CC49、抗-Lea抗体，和针对其它路易斯抗原(例如Le (y))的抗体，以及针对以下的抗体癌胚抗原(CEA或CEACAM5)、CEACAM6、结肠特异性抗原-p (CSAp)、MUC-l、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC_17、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、HER2/neu、EGFR、EGP-U EGP-2、血管生成因子(例如 VEGF、P1GF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6及癌基因产物(例如bcl-2、Kras、p53)、cMET,以及针对肿瘤坏死物质的抗体。这些实体瘤抗体可以是裸抗体或缀合到尤其是药物、毒素、同位素、放射性核素或免疫调节剂上的抗体。可以构建许多不同的抗体组合，它们可以以裸或缀合形式使用。或者，不同的裸抗体组合可以用于与连续给予、同时给予或相继给予的其它治疗剂例如细胞毒性药物或辐射组合施用。所述抗体及其片段的施用可以通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、通过区域导管灌注，或直接病变内注射进行。当通过注射施用所述抗体时，所述施用可以是连续输注或单次或多次快速推注。可以配制本发明的免疫缀合物用于静脉施用，经由例如快速推注注射或连续输注施用。优选地，本发明抗体在少于约4小时的时间内输注,更优选在少于约3小时的时间内输注。例如，前25-50mg可以在30分钟内，优选甚至15分钟内输注，其余部分在接下来的2至3小时内输注。注射制剂可以单位剂量形式存在于例如安培瓶或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。该组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，其在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构建(constitution)。可以采用另外的药学方法控制治疗缀合物的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附免疫缀合物来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology 10:1446(1992)。免疫缀合物或抗体从此种基质释放的速率取决于免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀合物或抗体的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys. J. 55:163 (1989) ; Sherwood等，出处同上。其它固体剂型描述于以下文献中Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro (编)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18版(MackPublishing Company 1990),及其修订版。一般而言，免疫缀合物对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。期望为接受者提供在约lmg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的免疫缀合物、抗体融合蛋白的剂量，但如情况需要也可以施用较低·或较高的剂量。对于70kg患者而言l-20mg/kg的剂量例如为70-1，400mg,或者对于I. 7_m患者为41-824mg/m2。这个剂量可以根据需要重复给予，例如，每周一次持续4至10周、每周一次持续8周，或每周一次持续4周。它也可以根据维持疗法的需要，以更低的频率给予，例如每隔一周一次持续数月，或者每月或每季度一次持续多个月。或者，抗体可以按照每2周或3周一剂施用，总共重复至少3剂。或者，所述抗体可以每周施用2次，持续4至6周。如果将所述剂量减低至约200-300mg/m2 (对于I. 7-m患者为340mg/剂,或者对于70kg患者为4. 9mg/kg),则它可以每周施用一次或甚至两次,持续4至10周。或者,可以减少给药日程(dosage schedule),即，每2或3周一次持续2至3个月。然而，已经确定，在重复给药周期内即使较高的剂量例如每周一次或每2至3周一次的20mg/kg也可以通过缓慢的静脉输注施用。所述给药方案可任选地以其它间隔重复，并且可以通过各种肠胃外途径给药，并可适当地调整剂量和方案。免疫缀合物抗胰腺癌抗体及其片段可以缀合到至少一种用于治疗或诊断的治疗和/或诊断剂上。对于免疫疗法，目标是将细胞毒性剂量的放射性、毒素、抗体和/或药物递送至靶细胞，同时将暴露于非靶组织的量减至最小。优选将抗胰腺癌抗体用于诊断和/或治疗胰腺肿瘤。可采用本领域已知的多种技术，使所述抗体、抗体片段和融合蛋白中的任一者与一种或多种治疗或诊断剂缀合。可以使一种或多种治疗或诊断剂连接至每种抗体、抗体片段或融合蛋白上，例如通过使试剂缀合到所述抗体Fe区中的糖部分上进行。如果不存在Fe区(例如在使用某些抗体片段时)，则可以将糖部分引入到抗体或抗体片段的轻链可变区中，治疗剂或诊断剂可连接至所述糖部分。参见，例如，Leung等，JTmmun01. 154:5919 (1995) ;Hansen 等,美国专利第 5, 443, 953 号(1995), Leung等,美国专利第6，254，868号，每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。使肽与抗体组分经由抗体糖部分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Shih 等，Int J Cancer 41:832 (1988) ; Shih 等，Int J Cancer 46:1101 (1990);和 Shih等，美国专利第5，057，313号，其实施例部分以引用方式并入本文。通用方法涉及使具有氧化糖部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能并加载有多种治疗剂如肽或药物的载体聚合物反应。这种反应产生初始希夫碱(亚胺)键合，该键合可以通过还原成仲胺从而形成最终缀合物来稳定化。抗体融合蛋白或多特异性抗体包含两种或更多种抗体或其片段，它们中的每种均可连接至至少一种治疗剂和/或诊断剂。因此，所述抗体融合蛋白的一种或多种抗体或其片段可以具有一种以上连接的治疗和/或诊断剂。进一步地，所述治疗剂不必相同，而可以是不同的治疗剂，例如可以将药物和放射性同位素连接至同一融合蛋白。例如，IgG可用mI放射性标记并且可连接至药物。可以将131I并入到IgG的酪氨酸和连接至IgG赖氨酸的e氨基的药物中。也可以将治疗剂和诊断剂都连接至还原SH基团和连接至抗体的糖侧链。或者，双特异性抗体可以包含一种针对疾病抗原的抗体或其片段，和另一种针对连接至可靶向构建体的半抗原的抗体或其片段，以便用于如上所述的预靶向技术中。治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。作为 替代，可以使用异型双功能交联剂如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(STOP)将此类试剂连接至抗体组分。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。此种缀合的通用技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991);Upeslacis 等，"Modification of Antibodies by ChemicalMethods, 〃于 MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(编)，第 187-230 页(ffiley-Liss, Inc. 1995);Price, ^Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies,"于MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(编)第 60-84页(Cambridge UniversityPressl995)。点击化学将螯合部分、药物或其它官能团连接至抗体、片段或融合蛋白的替代方法涉及点击化学反应的使用。点击化学途径最初被设想为通过以模块化方式将小亚基接合在一起来迅速产生复杂物质的方法。(参见，例如，Kolb等,2004，Angew Chem Int Ed40:3004-31;Evans, 2007, Aust J Chem 60:384-95)。各种形式的点击化学反应是本领域已知的，如Huisgen 1，3-偶极环加成铜催化反应(Tornoe等，2002，J Organic Chem67:3057-64)，这通常称为“点击反应”。其它替代反应包括环加成反应，例如Diels-Alder反应、亲核取代反应(尤其对于小的张力环，如环氧和氮丙啶化合物)、尿素化合物的羰基化学形成反应，和涉及碳-碳双键如巯基-炔反应中的炔烃的反应。叠氮化物-炔烃Huisgen环加成反应在还原剂的存在下使用铜催化剂催化连接至第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子的存在下，该叠氮化物与活化炔烃反应从而形成1，4- 二取代的1，2，3-三唑。该铜催化的反应在室温下进行，并且具有足够的特异性以致反应产物通常不需要纯化。(Rostovstev等,2002，Angew Chem Int Ed41:2596; Tornoe等，2002，J Org Chem 67:3057)。叠氮和炔烃官能团对于水性介质中的生物分子在很大程度上是惰性的，使得该反应在复合溶液中进行。所形成的三唑是化学稳定的，并且没有发生酶裂解，使得点击化学产物在生物系统中高度稳定。虽然铜催化剂对活细胞有毒性，但基于铜的点击化学反应可以在体外用于免疫缀合物形成。
已建议将无铜点击反应用于生物分子的共价修饰。(参见，例如，Agard等，2004, JAm Chem Soc 126:15046-47)无铜点击反应使用环张力代替铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应(同上)。例如，环辛炔是包含内部炔键的8-碳环结构。该封闭环结构诱导乙炔的显著键角变形，其与叠氮基高度反应从而形成三唑。因而，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。另一类无铜点击反应在Ning等(2010，AngewChem Int Ed49:3065-68)中有报道，涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应。为了解决原始环辛炔反应速率慢的问题，将吸电子基团与三键邻接(同上)。此种取代的环辛炔实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛醇和氮杂环辛炔(同上)。替代的无铜反应涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成从而得到N-烷基化异噁唑啉(同上)。该反应据报道具有异常迅速的反应动力学并 用于位点特异性的肽和蛋白质修饰的一锅三步骤方案(同上)。硝酮由合适的醛与N-甲基羟胺缩合制备，该环加成反应在乙腈和水的混合物中进行(同上)。这些和其它已知点击化学反应可以用来在体外将螯合部分连接至抗体或其它靶向分子。治疗剂多种多样的治疗剂可以同时或相继施用，或者有利地缀合到本发明抗体上，例如，药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂、促凋亡剂，等等。此处列举的治疗剂是可用于缀合到抗体、片段或融合蛋白上或者与如上所述的裸抗体独立施用的那些试剂。治疗剂包括，例如化疗药物，如长春花生物碱、蒽环霉素、吉西他滨、表鬼白毒素、紫杉烷、抗代谢物、烷化剂、抗生素、SN-38、C0X-2抑制剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成和细胞凋亡剂，特别是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-II、喜树碱、蛋白酶体抑制剂、mTOR抑制齐[J、HDAC抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂，和其它来自这些和其它类别的抗癌剂的药物。其它有用的癌症化疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、C0X-2抑制剂、抗代谢物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、钼配合物、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、喜树碱和激素。合适的化疗剂描述于REMINGTON’ SPHARMACEUTICAL SCIENCES,第 19 版(Mack Publishing Co. 1995)，以及 GOODMAN ANDGILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第 7版(MacMillan PublishingCo. 1985)，以及这些出版物的修订版中。其它合适的化疗剂，例如实验用药物是本领域技术人员已知的。在优选的实施方案中，喜树碱和相关化合物，例如SN-38的缀合物可以缀合到hPAM4或其它抗胰腺癌抗体上，例如如美国专利第7，591，994号和2006年3月23日提交的美国专利申请序列11/388,032中所公开的，其每个的实施例部分以引用方式并入本文。在另一个优选的实施方案中，hPAM4抗体缀合到吉西他滨上，吉西他滨可以在裸或缀合的嵌合、人源化或人PAM4抗体之前、之后或同时给予。优选地，所述缀合的hPAM4抗体或抗体片段缀合到放射性核素上。毒素可以来源于动物、植物或微生物。毒素，例如假单胞菌外毒素也可以复合到抗胰腺癌的免疫缀合物和hPAM4抗体的治疗剂部分上，或者形成抗胰腺癌的免疫缀合物和hPAM4抗体的治疗剂部分。其它适用于此类缀合物或其它融合蛋白制备的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见，例如，Pastan 等，Cell 47:641(1986), Goldenberg, CA—A Cancer Journal for Clinicians44:43 (1994)，Sharkey 和 Goldenberg,CA—A Cancer Journal for Clinicians56:226 (2006)。另外的适用毒素是本领域技术人员已知的，公开在美国专利第6，077，499号中，其实施例部分以引用方式并入本文。免疫调节剂，例如细胞因子，也可以缀合到所述免疫缀合物的治疗剂部分上或者形成所述免疫缀合物的治疗剂部分，或者可以与抗体、抗体片段或融合蛋白一起施用但没有缀合到所述抗体、抗体片段或融合蛋白上。所述融合蛋白可以包含结合到不同抗原上的一种或多种抗体或其片段。例如，所述融合蛋白可以结合PAM4抗原以及结合免疫调节细胞或因子。或者，受试者可以接受裸抗体、抗体片段或融合蛋白和独立施用的细胞因子，所述细胞因子可在施用所述裸抗体之前、同时或之后施用。本文所用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡
刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、促乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-a、TGF-P、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-a、TNF-3、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-a、干扰素-P、干扰素 _Y、S1 因子、IL-l、IL-lcc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白、内皮细胞抑制素和LT。所述治疗剂可以包含可用于治疗患病组织的一种或多种放射性同位素。特别有用的治疗放射性核素包括但不限于 mIn、mLu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、9°Y、125I、mI、32P、33P、47Sc、mAg、67Ga、142Pr、153Sm, 161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re^212Pb、223Ra^ 225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、ici9Pd、143Pr、149Pm, 169Er、194Ir、198Au、199Au 和 211Pb。优选所述治疗放射性核素的衰变能量对于俄歇发射体在20至6，OOOkeV的范围内，优选在60至200keV的范围内，对于P发射体为100至2，500keV，对于a发射体为4，000至6，OOOkeV。有用的@粒子发射核素的最大衰变能量优选为20至5，OOOkeV,更优选100至4，OOOkeV,最优选500至2，500keV。还优选基本上为俄歇发射粒子衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-IlU Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和 Ir-192。有用的 3粒子发射核素的衰变能量优选〈1，OOOkeV,更优选〈lOOkeV，最优选<70keV。还优选基本上为产生a粒子衰变的放射性核素。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi_212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213 和 Fm-255。有用的 a 粒子发射放射性核素的衰变能量优选为2，000至10，OOOkeV,更优选为3，000至8，OOOkeV,最优选为 4，000 至 7，OOOkeV0例如，67Cu由于其61. 5小时的半衰期和充足的P粒子和Y射线供应而被认为是用于放射免疫疗法的较有前途的放射性同位素之一，可以利用螯合剂对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)使它缀合到抗体上。或者，可以利用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，或更优选利用DOTA使发射高能P粒子的9°Y可偶联至抗体、抗体片段或融合蛋白。使9°Y缀合到抗体或可靶向构建体上的方法是本领域已知的，并可以采用任何此类已知的方法。(参见，例如，美国专利第7，259，249号，其实施例部分以引用方式并入本文。另外参见Lind6n等，Clin Cancer Res. 11:5215-22，2005; Sharkey 等，J Nucl Med. 46:620-33, 2005; Sharkey等，J Nucl Med. 44:2000-18，2003)。另外的潜在的治疗放射性同位素包括nC、13N、150、75Br、198AU、224AC、126I、133I、77Br、113mln、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg^ 203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tnu 167Tnu 168Tnu 197Pt、ici9PcU在另一个实施方案中，放射增敏剂可以与裸或缀合抗体或抗体片段组合使用。例如，放射增敏剂可以与放射性标记抗体或抗体片段组合使用。当与用单独的放射性标记抗体或抗体片段治疗相比时，放射增敏剂的加入可以增强效力。放射增敏剂描述于 D.M. GoIdenberg(编)，CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRCPress (1995)中。可用于这个技术的其它典型的目标放射增敏剂包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和顺钼，它们已经与外部照射组合用于包括胰腺癌在内的多种癌症的治疗。因此，我们已研究被认为是吉西他滨放射增敏剂量(在4周内，每周一次200mg/m2)的剂量的吉西他滨与分次剂量的9°Y-hPAM4组合的组合，已观察到在被证明能很好耐受(无3-4级毒性，根据 NCI-CTC v.3标准)的单个周期的这种组合治疗后胰腺癌减轻的客观证据。通常将会按相似的方式产生具有加载硼附加物的载体用于供热中子激活疗法的抗体或其片段。然而，等到非靶向的免疫缀合物清除之后才执行中子照射将是有利的。可以利用结合到抗胰腺癌抗体上的抗独特型抗体加速清除。有关这种一般原理的描述，参见美国专利第4，624，846号。可以将硼附加物例如碳硼烷连接至抗体。如本领域熟知的，可以用侧挂型侧链上的羧基官能制备碳硼烷。可以通过激活碳硼烷的羧基并与载体上的胺缩合，实现碳硼烷与载体例如氨基葡聚糖的连接。然后使中间缀合物缀合到抗体上。施用抗体缀合物后，硼附加物由热中子照射激活并转化成放射性原子，放射性原子通过a发射衰变从而产生高毒性短程效应。干扰RNA另一类治疗剂是RNAi或siRNA。RNA干扰(RNAi)由RNA诱导的沉默复合体(RISC)介导，并由与催化RISC成分argonaute相互作用的短双链RNA分子启动(Rand等，2005，Cell 123:621-29)。RNAi 分子的类型包括微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。RNAi物种可以通过互补碱基配对与信使RNA(mRNA)结合，并通过转录后基因沉默抑制基因表达。结合到互补mRNA物种上后,RNAi诱导RISC的argonaute成分裂解所述mRNA分子。除其它特征外，miRNA和siRNA的差异在于对特定基因靶的特异性程度，其中siRNA相对而言对特定靶基因有特异性，而miRNA抑制多个mRNA物种的翻译。已尝试将RNAi抑制选定基因表达的治疗用途用于多种疾病状态，例如黄斑变性和呼吸道合胞病毒感染(Sah，2006，Life Sci79:1773-80)。已表明siRNA在宿主细胞中起着抵抗病毒感染的作用，并已对siRNA作为抗病毒治疗的途径进行广泛地研究(参见，例如，Zhang等，2004，Nature Med 11:56-62;Novina等，2002，Nature Med8:681-86;Palliser等，2006，Nature 439:89-94)。也已尝试将 siRNA 用于癌症治疗。Fujii 等(2006，Int JOncol 29:541-48)用针对HPV E6和E7的siRNA转染HPV阳性宫颈癌细胞，并抑制了肿瘤生长。已报道乳腺癌细胞中siRNA介导的异粘蛋白(metadherin)表达敲低抑制实验性肺转移(Brown 和 Ruoslahti, 2004，Cancer Cell 5:365-74)。已尝试提供靶向的siRNA递送以便减少脱靶毒性的可能性。Song等(2005，NatBiotechnol 23:709-17)使用针对HIV包膜蛋白的鱼精蛋白缀合的Fab片段将siRNA递送至循环细胞。Schiffelers等(2004，Nucl Acids Res 32 :el49)使RGD妝缀合到纳米粒子上从而将抗_VEGFR2siRNA递送至肿瘤并抑制裸小鼠的肿瘤血管生成和生长速率。Dickerson等使用抗_EphA2受体肽官能化的纳米凝胶，用针对EGFR的siRNA来增加卵巢癌细胞对化疗的敏感度。树状高分子缀合的磁性纳米粒子已应用于反义存活素寡脱氧核苷酸的靶向递送(Pan 等，2007，Cancer Res 67:8156-63)。技术人员将会意识到任何siRNA或干扰RNA物种都可以连接至题述抗体。针对多种多样的靶的siRNA和RNAi物种是本领域已知的，而且在要求保护的方法和组合物中可以利用任何此类已知的寡核苷酸物种。具有潜在用途的已知siRNA物种包括对IKK-Y有特异性的那些(美国专利第7，022，828 号);VEGF、Flt-I 和 Flk_l/KDR(美国专利第 7，148，342 号)；Bcl2 和 EGFR(美国专利第7，541，453号);0^20(美国专利第7，550，572号);转导素(P ) _样3 (美国专利第7，576，196号);1(狀5(美国专利第7，576，197号);碳酸酐酶II (美国专利第7，579，457号)；补体成分3 (美国专利第7，582，746号)；白介素_1受体相关激酶4 (IRAK4)(美国专利第7，592，443号)；存活素(美国专利第7，608，7070号)；过氧化物歧化酶I (美国专利第7，632，938号);MET原癌基因(美国专利第7，632，939号)淀粉样前体蛋白(APP)(美国专利第7，635，771号);IGF-1R(美国专利第7，638，621号)；ICAMl (美国专利第7，642，349号);补体因子B (美国专利第7，696，344号)；p53 (7，781，575)，和载脂蛋白B (7，795，421)， 其中的每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。另外的siRNA物种可得自已知商业来源，例如Sigma-Aldrich(StLouis,MO)、Invitrogen(CarIsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA)、Ambion (Austin, TX)、Dharmacon (Thermo Scientific, Lafayette, CO)、Promega (Madison, WI) > Mirus Bio (Madison, WI)和 Qiagen (Valencia, CA),以及许多其它商业来源。siRNA物种的其它公开可用来源包括Stockholm Bioinformatics Centre的siRNAdb 数据库、MIT/ICBP siRNA 数据库、Broad Institute 的 RNAi Consortium shRNA 文库,和NCBI的Probe数据库。例如，NCBI Probe数据库中存在30，852个siRNA物种。技术人员将会意识到对于任何目标基因，siRNA物种已被设计或者可以容易地利用公开可用软件工具进行设计。任何此类siRNA物种都可以利用题述DNL复合物递送。已报道的示例性siRNA物种在表I中列出。虽然siRNA是作为双链分子递送的，但为简单起见仅在表I中给出正义链序列。表I.示例性siRNA序列
权利要求
1.一种检测或诊断胰腺癌的方法，其包括 a)从个体获取血液、血清或血浆样品；和 b)利用抗胰腺癌抗体进行免疫测定从而检测所述样品中胰腺癌粘蛋白的存在； 其中所述胰腺癌粘蛋白的存在指示所述个体患有胰腺癌，并且所述血清免疫测定可以检测早期胰腺癌。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测IA期、IB期和2期胰腺癌。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测80%或更多的总胰腺癌。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测60%或更多的I期胰腺癌。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测54%的IA期胰腺癌。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测75%的IB期胰腺癌。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测86%的2期胰腺癌。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测90%或更多的3期和4期胰腺癌。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定对于未患胰腺癌或胰腺炎的对照个体的假阳性率为5%或更小。
10.根据权利要求I所述的方法,其中所述血清免疫测定对于患有慢性胰腺炎的个体的假阳性率为38%或更小。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测无症状个体的胰腺腺癌。
12.根据权利要求I所述的方法，其中所述样品是血清样品，并且所述方法进一步包括在进行所述免疫测定之前对所述血清样品进行有机相萃取。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述有机相是丁醇。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述免疫测定检测PanIN-lA、PanIN_lB、PanIN-2、侵袭性胰腺腺癌、胰腺癌、粘液性囊性赘生物(MCN)、胰腺内粘液性赘生物(IPMN)和导管内乳头状粘液性瘤变的存在。
15.一种检测或诊断胰腺癌的方法，其包括 a)向个体施用抗体构建体,所述抗体构建体包含与嵌合PAM4(cPAM4)抗体结合到相同的表位上或者与嵌合PAM4(cPAM4)抗体竞争结合到胰腺癌粘蛋白上的至少一种抗胰腺癌抗体或抗原结合片段，所述嵌合PAM4(cPAM4)抗体包含轻链可变区CDR序列CDRl(SASSSVSSSYLY,(SEQ ID NO:I)、CDR2(STSNLAS, SEQ ID NO:2)和CDR3(HQWNRYPYT，SEQID NO: 3)，以及重链可变区 CDR序列 CDRl (SYVLH, SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO: 6);和 b)检测结合到胰腺癌细胞上的所述抗体构建体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使所述抗体构建体在体内或体外暴露于所述样品。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗体或其片段结合到包含氨基酸序列WTWNITKAYPLP (SEQ ID NO: 29)的线性肽上，或者结合到包含氨基酸序列ACPEffffGTTC(SEQ ID NO:30)的环状肽上。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体构建体是双特异性或多特异性抗体，其包含(i)至少一种PAM4抗体或其抗原结合片段；和(ii)至少一种结合到可靶向构建体上的半抗原上的抗体或片段；并且所述方法进一步包括施用连接至至少一种诊断剂的可靶向构建体。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗体或其抗原结合片段缀合到至少一种诊断剂上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述诊断剂选自由放射性核素、造影剂、荧光齐U、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂组成的组。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述诊断剂是选自由以下组成的组的放射性核素1201 , 123I,124I、125I、1311、154^158Gd,32P、nC、13N、150、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其它、发射体、P发射体或正电子发射体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述放射性核素是18F,并且所述方法进一步包括PET成像。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述顺磁离子选自由以下组成的组铬(III)、锰 II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钦(III)和铒(III)。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述诊断剂是选自由异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺组成的组的荧光标记化合物，或选自由鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎗酯、咪唑、吖啶鎗盐和草酸酯组成的组的化学发光标记化合物，或选自由萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白组成的组的生物发光化合物。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法用于手术中、内窥镜检查或血管内程序。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体构建体是DNL(停靠和锁定)构建体，其包含(i)至少一个拷贝的嵌合、人或人源化PAM4抗体或其片段，其中所述PAM4抗体或其片段包含轻链可变区 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, (SEQ ID NO: I), CDR2 (STSNLAS, SEQID NO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3),以及重链可变区 CDR序列 CDRl (SYVLH, SEQ IDN0:4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO :5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO :6);以及(ii)至少一个拷贝的半抗原结合抗体或其片段。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述半抗原结合抗体是h679抗体或h734抗体。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述DNL构建体包含两个拷贝的每个均连接至DDD部分的PAM4Fab片段，和一个拷贝的连接至AD部分的h679Fab片段，其中所述两个拷贝的DDD部分形成二聚体,所述二聚体结合到所述AD部分上从而形成所述DNL构建体。
全文摘要
本发明描述了使用抗胰腺癌抗体或其片段，例如鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体的组合物和方法。题述抗体表现出许多新的并且有用的诊断特征，例如以高特异性结合到胰腺癌和其它癌症上，但不结合到正常胰腺组织上，以及结合到高百分比的早期胰腺癌上。在优选的实施方案中，所述抗体结合到胰腺癌粘蛋白上。所述抗体和片段可用于检测和诊断早期胰腺癌。在优选的实施方案中，所述抗胰腺癌抗体可用于血清样品的免疫测定，其中所述免疫测定可以检测血清中早期胰腺癌的标记。更优选在免疫测定前用有机相例如丁醇萃取血清。
文档编号G01N33/53GK102713623SQ201180006262
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月20日 优先权日2010年1月22日
发明者D·M·戈登堡, D·V·戈德 申请人:免疫医疗公司