专利名称：IgA结合性肽以及利用其的IgA的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及由随机肽文库得到的人IgA结合性肽以及利用该肽的IgA的分析方法或纯化方法。
背景技术：
免疫球蛋白A (IgA)不仅在粘膜免疫中是重要的抗体，而且在血中是继免疫球蛋白G (IgG)的第2个主要的抗体家族，发挥对于细菌、病毒感染的防御功能。IgA中存在具有二聚体结构的分泌型IgA (slgA)与单体结构的IgA (mlgA)o slgA具有通过SS键所形成的连接链(J-链)连接的二聚体结构，分泌至粘液中，但mlgA多数存在于血液中。另外，IgA中存在主要是绞链区的长度不同的2种亚型(IgAl与IgA2)，IgA2缺少富含Pro的13 个残基的区域。对于IgA在医药品中的功能，由于在感染免疫中的重要性，在粘膜疫苗的开发中受到关注(非专利文献I和2)，由于血液中的IgA特别是被报道有嗜中性粒细胞介导的对于癌细胞的ADCC (非专利文献3和4)，因此，与作为癌症或自身免疫疾病的治疗药的临床应用不断扩大的抗体药物形式的IgG相同地，IgA也被期待作为靶向癌症的抗体药物(非专利文献5)。但是，作为妨碍IgA开发为医药品的主要原因之一，可举出无法确立如IgG制造中的蛋白质A/G亲和柱那样能够对应于工业性、制药规模的纯化方法。以往，作为IgA的纯化方法，报道有数种方法(非专利文献6)。例如，报道了利用识别IgAl特异性糖链的外源凝集素Jackalin (非专利文献7)或作为蛋白质A模拟合成配体的TG19318 (非专利文献8)来纯化IgA的方法，但它们由于结合能力或特异性中的问题，因而在利用上存在限制。另外，从链球菌来源的表面蛋白质M蛋白质家族(非专利文献9)的成员中发现了 IgA结合蛋白质(非专利文献10、11和专利文献1)，但与IgG等血清中的其它蛋白质的相互作用等(非专利文献12)成为问题，因而作为IgA特异性亲和性配体使用时存在障碍。另一方面，Sandin等人取出由该Streptococcal Sir22 (M22)蛋白中的48个残基组成的功能区肽(Streptococcal IgA-结合肽，Sap),利用经由Cys的SS键进行二聚体化，由此报道了与原来的Sir22蛋白质相比亲和性(以Kd值计为3 4nM)降低，但亲和性较高(以Kd值计为20nM)的IgA的纯化用亲和配体(非专利文献13、专利文献2)。实际上,该配体与IgA的Fe结合,可以用于sIgA、mIgA两者的纯化、以及抗原特异性的IgAl、Igkl单克隆抗体的检测。与上述IgA结合蛋白质相同地，对于IgG，本发明人开发了 IgG结合性肽(专利文献3)。现有技术文献
专利文献
专利文献I :国际公开第WO 1992/017588 专利文献2 :国际公开第WO 2000/063383 专利文献3 :国际公开第WO 2008/054030非专利文献
非专利文献 I :Holmgren，J. (1991) Fems Microbiology Immunology 89(1)，1-9非专利文献 2 Holmgren, J.，and Czerkinskyj C. (2005) Nat. Med. 11 (4)，S45-S53
非专利文献 3 :Dechant，Μ·，Beyer, Τ·，Schneider-Merckj Τ·，Weisnerj I，Peippj Μ·，vande Winkelj J. G.，and Valerius, T. (2007) J Immunol 179(5)，2936-2943非专利文献 4 :Zhao，J.，Kurokij M.，Shibaguchij H.，Wang, L，Huoj Q.，Takamij N. , Tanaka, T. , Kinugasaj T. , and Kurokij M. (2008) Oncol. Res. 17(5)，217-222
非专利文献5 :Beyer，T. , Lohsej S. , Berger, S. , Peippj M. , Valerius, T., andDechantj M. (2009) Journal of Immunological Methods 346(1-2)， 26-37
非专利文献6 Pack, T. D. (2001) Current protocols in Immunology / edited byJohn E. Coligan et al Chapter 2， Unit 2 IOB
非专利文献 7 :Kondoh，H.，Kobayashij K.，and Hagiwaraj K. (1987) Molecularimmunology 24(11)， 1219-1222
非专利文献 8 :Palombo，G.，De Falcoj S.，Tortoraj M.，Cassanij G.，andFassinaj G. (1998) J Mol Recognit 11(1-6)， 243-246
非专利文献 9 Frithz, E.，Hedenj L 0.，and Lindahl, G. (1989) MolecularMicrobiology 3(8)， 1111-1119
非专利文献 10 Russell-Jonesj G. J.，Gotschlichj E. C.，and Blake, M. S.(1984) The Journal of Experimental Medicine 160(5)， 1467-1475
非专利文献 11 :Lindahl，G. , Akerstromj B. , Vaermanj J. P. , and Stenbergj L(1990) European Journal of Immunology 20(10)， 2241-2247
非专利文献 12 :Stenberg，L·，O’Toole，P. I，Mesteckyj J.，and Lindahl, G.(1994) TheJournal of Biological Chemistry 269(18)， 13458-13464
非专利文献 13 :Sandin，C.，Linsej S.，Areschougj T.，Woof, J. M.，ReinholdtjJ·，and Lindahl, G. (2002) J Immunol 169(3)，1357-1364。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供对人IgA特异性或选择性地具有结合性的肽。另外，本发明的目的还在于提供使用该肽来纯化或分析(例如，检测或定量)人IgA的方法。用于解决技术问题的手段
人IgA如背景技术所述存在于粘膜和血中，在对于感染等的防御中发挥重要的功能。由于这种特性，IgA被作为抗体药物用于感染疾病、肿瘤等疾病的治疗中。本发明鉴于上述情况而完成，通过提供对可以特异性或选择性地与人IgA结合的肽，认为可用于能过作为药物使用的IgA的纯化和分析。
对本发明进行归纳，则具有以下的特征。[I] 一种肽，其特征在于，含有下述式I :
(Xi-3) _c_ (X8_10) -C- (X^3) (I)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基)
所示的由12 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。[2]上述[I]所述的肽，其特征在于，含有下述式II
(X3) -C-L- (X7-9) -C- (X3) (II)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为 半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。[3]上述[2]所述的肽，其特征在于，含有下述式III
(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (III)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。[4]上述[3]所述的肽，其特征在于，含有下述式IV
(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (IV)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者或者任一者或两者缺失，以及从N末端起第16个和第18个氨基酸残基独立地为疏水性氨基酸残基)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。[5]上述[I] [4]中任一项所述的肽，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第I 3、5 14、16 18个的各氨基酸残基为
第I个氨基酸残基=Q，H, K, R, S或P ;
第2个氨基酸残基=M, K, R, L, V, A或D ;
第3个氨基酸残基=R，L, M或V ;
第5个氨基酸残基=L ；
第6个氨基酸残基=S，H, Q, T, K, R, N或A ;
第7个氨基酸残基=Y ；
第8个氨基酸残基=K或R ;
第9个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失；
第10个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失；
第11个氨基酸残基=G；
第12个氨基酸残基=R，S，T或K ;第13个氨基酸残基=R，Μ, K, Ε, N或P;
第14个氨基酸残基=V ；
第16个氨基酸残基=L，F，V或I ;
第17个氨基酸残基=W，L, R, Ε, Τ, S，Q, P或A ;或者 第18个氨基酸残基=L，I, Y, A或V。[6]上述[I] [5]中任一项所述的肽，其中，上述式I 式IV的肽中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第16个氨基酸残基X为亮氨酸或苯丙氨酸残基。[7]上述[I] [6]中任一项所述的肽，其中，上述式I 式IV的肽中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第18个氨基酸残基X为亮氨酸残基。
[8]上述[I] [7]中任一项所述的肽，其中，其由以下I) 26)中任一氨基酸序列组成
1)HMRCLHYKGRRVCFLL (序列编号 I)
2)QMRCLSYKGRRVCLffL (序列编号 2)
3)HKRCLHYRGRMVCFLI (序列编号 3)
4)KRLCLQYKGSKVCFRL (序列编号 4)
5)RMRCLTYRGRRVCLEL (序列编号 5)
6)SMRCLQYRGSRVCLTL (序列编号 6)
7)QKRCLKYKGSRVCFFL (序列编号 7)
8)HLRCLRYKGTRVCFSL (序列编号 8)
9)HVRCLSYKGREVCVQL (序列编号 9)
10)PRMCLHYKGRRVCIPY (序列编号 10)
11)HVRCLRYRGKNVCFLL (序列编号 11)
12)SDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 15)
13)RDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 16)
14)HDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 17)
15)SMVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 19)
16)SAVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 20)
17)SDVCLNYRGRPVCFQV (序列编号 24)
18)SDVCLHYRGRPVCFQV (序列编号 25)
19)SDVCLAYRGRPVCFQV (序列编号 26)
20)SDVCLRYRGRPVCFRV (序列编号 37)
21)SDVCLRYRGRPVCFLV (序列编号 38)
22)SDVCLRYRGRPVCFAV (序列编号 39)
23)SDVCLRYRGRPVCFQL (序列编号 41)
24)SDVCLRYRGRPVCFQA (序列编号 42)
25)HMVCLAYRGRPVCFAL (序列编号 43)
26)HMVCLSYRGRPVCFSL (序列编号 44)。[9]上述[I] [8]中任一项所述的肽，其中，肽在2个半胱氨酸(C)残基间形成有二硫键。
[10]上述[I] [9]中任一项所述的肽，其与IgA的血清型(单体)和分泌型(二聚体)结合。[11]上述[I] [10]中任一项所述的肽，其结合有标记。[12]融合蛋白质，其由上述[I] [11]中任一项所述的肽与所连接的蛋白质组成。[13]固定化肽，其是将上述[I] [11]中任一项所述的肽与固相结合而成。[14]核酸，其编码上述[I] [11]中任一项所述的肽。[15] IgA的纯化方法，其包括使上述[I] [11]中任一项所述的肽或上述[13]所述的固定化肽与IgA结合，以及使结合的IgA游离而回收IgA。
[16] IgA的检测方法，其包括使样品中的IgA与上述[I] [11]中任一项所述的肽或上述[13]所述的固定化肽结合而检测结合的IgA。[17]用于人IgA的分析或纯化的试剂盒，其含有上述[I] [11]中任一项所述的肽或上述[13]所述的固定化肽的至少I种。[18] IgA分离用柱，其含有上述[13]所述的固定化肽。本说明书包含作为本申请优选权基础的日本专利申请2010-118508号的说明书和/或附图中记载的内容。本发明的人IgA结合性肽具有下述优点 与IgG、IgM和IgE相比，对IgA具有更高的选择性，可以与人IgA结合。这意味着可以由例如人血清等中选择性地分离IgA。
[图I]显不5次淘选后所得曬菌体的利用ELISA的相对于人IgA的结合特异性。[图2]显示人IgA结合噬菌体克隆的利用ELISA的结合特异性。[图3]显示hIgA-2肽模体(motif)的氨基酸序列与DNA序列。[图4]显示来自部分突变文库的人IgA特异性的噬菌体的浓缩。[图5]显示hIgA-2合成肽的结合特异性。其中，IgG-BP表示人IgG特异性的肽、LF-Al表示人乳铁传递蛋白特异性肽。[图6]表示利用表面等离子的hIgA-2合成肽对人IgA的结合分析的结果。[图7]表示利用固定化了hIgA-2肽的柱的人IgA的特异性吸附和洗脱。[图8]表示利用固定化了hIgA-2肽的柱从人血清中纯化IgA。[图9]表示由固定化了hIgA-2肽的柱回收的IgA的SDS-PAGE (左侧)与Westernblotting (右侧)。[图10]表示用于分离对hlgA的亲和性高的模体的最优化文库的设计。[图11]表示通过从最优化文库中淘选来浓缩hlgA特异性的噬菌体。[图12]表示A3-1展示噬菌体克隆的利用ELISA的对hlgA的结合特异性。[图13]表示利用表面等离子共振分析的A3-1(0pt2)合成肽对人IgA的结合分析的结果。[图14]表示利用固定化了A3-1 (0pt2)合成肽的柱从人血清中纯化IgA。
具体实施方式
本发明中，本发明人发现的对人IgA具有特异性或选择性的结合性的肽是参考通过T7噬菌体展示系统构建的在分子内含有I个二硫键的随机肽文库(Sakamoto，K., Ito,Y. , Hatanaka, T. , Soni, P. B., Mori, Τ., and Sugimura, Κ. (2009) The Journal ofbiological chemistry 284(15)，9986-9993),利用生物淘选法由新设计、构建的文库分离而得的，此时所得的4种特异性克隆可观察到相互共通的序列的相同性，基于该序列进行各种置换或缺失而制备的合成肽显示对于IgA的优异的特异性与亲和性。对这些肽的结合IgA所必需的残基进行鉴定，使得增强亲和性的方法以及使用该肽从人血清中纯化IgA中的应用成为可能。本发明的IgA结合性肽是最为精简、即小的IgA结合性肽，是12或13个残基，即使与非专利文献13中记载的Streptococcus Sir22 (M22)来源的约50个残基的Sap肽(C末端具有I个Cys)相比，也要小至1/4左右，由此，可期待以低成本的肽为基础来构建IgA的纯化系统。以下，对本发明进一步详细说明。具体地，对本发明的IgA结合性肽、利用该肽的IgA的纯化方法和分析方法、用于 这种IgA纯化或检测的试剂盒进行说明。(IgA结合性肽)
本发明的肽是从含有大量随机肽的噬菌体文库之中作为与人IgA特异性或选择性地具有结合性的肽而筛选出的，与以往公知的如非专利文献13中记载的多肽相比，其来源、一次结构不同。本说明书中使用的人IgA是指IgAl和/或IgA2。S卩，对于本发明的肽，作为最为广义的一次结构，是下述肽，该肽的特征在于，含有下述式I :
(Xi-3) _c_ (X8_10) -C- (X^3) (I)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基)
所示的由12 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。上述式中，N末端或C末端的Xn的表述意指半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续I 3个，构成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，但优选由3个均不为相同残基的序列组成。相同地，X8-K1也意指半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续8 10个，构成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，但优选由3个以上不为相同残基的序列组成。另外，以下式中有X3、X7_9、X2等表述，它们也具有同样的含义。式I的2个半胱氨酸残基可以形成二硫键从而形成环状肽。通常，式I的肽形成有二硫键。式I的肽的氨基酸序列中，进一步特定了氨基酸残基X的式II、式III和式IV所示的肽示于以下。SP，式II所示的肽的特征在于，含有 (X3) -C-L- (X7-9) -C- (X3) (II)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。
式III所示的肽的特征在于，含有
(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (III)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。式IV所示的肽的特征在于，含有
(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (IV)
(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨·酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者或者任一者或两者缺失，以及从N末端起第16个和第18个氨基酸残基独立地为疏水性氨基酸残基)
所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。上述式II IV的肽的氨基酸序列中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X优选均缺失，这样的肽由16个氨基酸长度组成。本说明书中使用的“为18个氨基酸残基时”是在将肽的氨基酸残基按氨基酸位置编号来称呼时，为了从作为最长氨基酸长度的18个残基的N末端起依次由第I个至第18个进行编号，而方便地表现的用语。进而，上述各式的肽的氨基酸序列的半胱氨酸(C)之外的氨基酸残基，S卩，为18个氨基酸残基时，从N末端起第I 3、5 14、16 18个各氨基酸残基优选选自以下。其中，各大写的字母表示氨基酸的单字母符号。第I个氨基酸残基=Q，H, K, R, S或P、优选H 第2个氨基酸残基=M，K, R, L, V, A或D、优选M 第3个氨基酸残基=R，L, M或V、优选V
第5个氨基酸残基=L
第6个氨基酸残基=S，H, Q, T, K, R, N或A、优选S或A 第7个氨基酸残基=Y 第8个氨基酸残基=K或R、优选R
第9个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失、优选缺失 第10个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失、优选缺失 第11个氨基酸残基=G 第12个氨基酸残基=R，S，T或K、优选R 第13个氨基酸残基=R，Μ, K, Ε, N或P、优选P 第14个氨基酸残基=V
第16个氨基酸残基=L，F，V或I、优选L或F 第17个氨基酸残基=W，L, R, Ε, T, S，Q, P或A、优选S或A 第18个氨基酸残基=L，I, Y, A或V、优选L本发明的肽的数个具体例列举为以下I) 26)，但并不受其限定。这种肽相对于人IgA，与其它种系的免疫球蛋白相比，均具有显著更高的结合特异性或结合选择性。I) HMRCLHYKGRRVCFLL (序列编号 I)
2)QMRCLSYKGRRVCLffL (序列编号 2)
3)HKRCLHYRGRMVCFLI (序列编号 3)
4)KRLCLQYKGSKVCFRL (序列编号 4)
5)RMRCLTYRGRRVCLEL (序列编号 5)6)SMRCLQYRGSRVCLTL (序列编号 6)
7)QKRCLKYKGSRVCFFL (序列编号 7)
8)HLRCLRYKGTRVCFSL (序列编号 8)
9)HVRCLSYKGREVCVQL (序列编号 9)
10)PRMCLHYKGRRVCIPY (序列编号 10)
11)HVRCLRYRGKNVCFLL (序列编号 11)
12)SDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 15)
13)RDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 16)
14)HDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 17)
15)SMVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 19)
16)SAVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 20)
17)SDVCLNYRGRPVCFQV (序列编号 24)
18)SDVCLHYRGRPVCFQV (序列编号 25)
19)SDVCLAYRGRPVCFQV (序列编号 26)
20)SDVCLRYRGRPVCFRV (序列编号 37)
21)SDVCLRYRGRPVCFLV (序列编号 38)
22)SDVCLRYRGRPVCFAV (序列编号 39)
23)SDVCLRYRGRPVCFQL (序列编号 41)
24)SDVCLRYRGRPVCFQA (序列编号 42)
25)HMVCLAYRGRPVCFAL (序列编号 43)
26)HMVCLSYRGRPVCFSL (序列编号 44)。上述26种肽之中，序列编号43 (A3-1 (Optl))和序列编号44 (A3_l (0pt2))的肽尤其具有与人IgA(也记载为“hlgA”)的高亲和性。如前所述，本发明涉及的上述式的肽的特征在于，各氨基酸序列中具有离开的2个半胱氨酸(C)残基，且半胱氨酸残基被配置为能够在该半胱氨酸残基间形成二硫键，优选的肽是2个半胱氨酸残基形成二硫键从而形成环状肽，各半胱氨酸残基的N末端侧和C末端侧具有I 3个、优选3个半胱氨酸之外的任意氨基酸残基。第I 3、16 18个的这类氨基酸残基如上述例示。本发明的肽与人IgA的结合亲和性与其它人免疫球蛋白(IgG、IgE或IgM)相比，高约10倍以上、优选约50倍以上、更优选约200倍以上。关于本发明的肽与人IgA的结合的离解常数(Kd)，可以通过表面等离子共振谱分析(使用例如BIAC0RE系统(蛋白质相互作用分析))来决定，例如，为1父101 小于1父10_1优选为小于1X10_8M、更优选为小于I X 1(Γ9Μ、进一步优选为小于I X 1(T1QM。使用固定化于固相的本发明的肽，在实际中尝试与人血清中的IgA的结合时，明确了与IgA的血清型(单体)和分泌型(二聚体)结合的事实，暗示了任何一种IgA的分离均可进行。本发明的肽可以通过惯用的液相合成法、固相合成法等肽合成法、利用自动肽合成机的妝合成等来制造(Kelley et al. , Genetics Engineering Principles andMethods, Setlow, J. K. eds. , Plenum Press NY. (1990) Vol. 12, p. 1-19; S tewart etal. , Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) ff.H. Freeman Co. ; Houghten, Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p. 5132，《新生化学実験講座I蛋白质IV》(1992)日本生化学会编，东京化学同人，东京，日本)。或者，也可以通过使用了编码本发明的肽的核酸的基因重组方法或噬菌体展示法等来制造肽。例如，可以将编码本发明的肽的氨基酸序列的DNA整合至表达载体中，导入宿主细胞中进行培养，由此制造目标肽。制造的肽可以通过常法，例如，凝胶过滤层析、离子交换柱层析、亲和层析、反相柱层析、HPLC等层析、硫酸 铵分级沉淀、超滤、免疫吸附法等进行回收或纯化。肽合成是准备保护了各氨基酸的、除要结合的α-氨基与α-羧基之外的官能团的氨基酸类，在各氨基酸的α-氨基与α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，将位于肽的C末端的氨基酸残基的羧基通过适当的间隔体(7 一寸一)或连接体('J >力一)与固相结合。将以上得到的二肽的氨基末端的保护基选择性地除去，在与下一氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续地进行这样的操作而制造侧基被保护的肽，最后除去全部保护基，由固相分离。保护基的种类或保护方法、肽键法的具体内容详细记载于上述文献中。基因重组方法包括将编码本发明肽的DNA插入适当的表达载体中，将载体導入至适当的宿主细胞中，培养细胞，由细胞内或由细胞外液回收目标肽。载体没有限定,例如,为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒等载体。质粒载体没有限定,但可举出来源于大肠杆菌的质粒(例如 pET22b (+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript 等)、来源于枯草杆菌的质粒(例如pUBllO、pTP5等)、来源于酵母的质粒(例如YEpl3、YCp50等)等。噬菌体载体没有限定，但可举出T7噬菌体展示载体(T7SelectlO_3b、T7Selectl_lb、T7Selectl_2a、T7Selectl_2b、T7Selectl_2c 等(Novagen))、λ 曬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λ gtlO、λ gtll、λ ZAP、λ ZAPII 等)。病毒载体没有限定，可举出例如反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、仙台病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒等。粘粒载体没有限定，可举出Lorist 6、Charomid9-20、Charomid9-42等。卩遼菌粒载体没有限定，已知例如pSKAN、pBluescript、pBK、pComb3H等。载体中可以包含使目标DNA为可表达的调节序列、或用于筛选含有目标DNA的载体的选择标记物、用于插入目标DNA的多克隆位点等。这类调节序列中含有启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起始区、poly(A)位点等。另外，选择标记物可以使用，例如，氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因等。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌、枯草杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如，哺乳动物细胞)、植物细胞等，对这些细胞的转化或转染包括例如磷酸I丐法、电穿孔法、脂质体转染法、粒子枪法、PEG法等。培养转化细胞的方法按照宿主生物的培养中使用的通常方法来进行。例如，在大肠杆菌或酵母细胞等微生物的培养中，含有宿主微生物可进行同化的碳源、氮源、无机盐类等。为了使本发明的肽的回收变得容易，优选使表达生成的肽分泌至细胞外。因此，将编码可使肽从该细胞分泌的肽序列的DNA结合于编码目标肽的DNA的5’末端侧。转移至细胞膜的融合肽被信号肽酶切断，从而使目标肽分泌释放至培养基中。或者，也可以回收蓄积于细胞内的目标肽。此时，将细胞物理地或化学地破坏，使用蛋白质纯化技术来回收目标肽。因此，本发明进一步还涉及编码本发明的肽的核酸。其中，核酸包括DNA或RNA(例如 mRNA)。为了可以检测IgA，本发明的肽还可以被标记。标记没有限定，包括例如荧光色素、化学发光色素、酶、放射性同位素、荧光蛋白质、生物素等。优选的标记的例子为荧光素、FITC等荧光素衍生物、若丹明、四甲基若丹明等若丹明衍生物、德克萨斯红等荧光色素。对于本发明的肽，也可以使之与任意蛋白质融合。蛋白质只要是GFP (绿色荧光蛋白质)之类的荧光蛋白质、过氧化物酶等酶等，则可将该蛋白质用作标记。此时，可以根据需要通过适当的连接体通过基因重组方法以融合蛋白质的形式制作本发明的肽和该蛋白 质。此时，本发明的肽应该以无损与人IgA的结合性的方式制作融合蛋白质。本发明的肽还可以进一步以能够用于人IgA的分离纯化、分析等的方式固定化在能够填充于亲和柱的固相上。适用于将肽固定化的固相没有限定，可举出例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯聚合物、氟树脂、硅胶、交联葡聚糖、多糖、琼脂糖等多糖类、玻璃、金属、磁性物质、和它们的组合等。这类固相的形状可以为例如盘、球、纤维、粒子、棒、平板、容器、池、微板、试管、膜(film或membrane)、胶体、片等任意形状。具体地，可举出例如磁性珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、精制琼脂糖珠、硅胶珠、多糖类珠、聚苯乙烯板、玻璃板、聚苯乙烯管等。本发明的肽固定化于这些固相可使用本领域技术人员公知的方法进行，例如，可通过物理吸附法、共价键法、离子键法等进行。固定化优选通过共价键来进行，使固相表面具有化学官能团(例如羟基、氨基、N-羟基琥珀亚胺基等)，优选具有含有作为间隔体的碳原子数约4 20的亚烷基链的化学官能团，使其与肽的羧基末端进行化学反应而形成酯键或酰胺键等。固定化了本发明的肽的固相填充于亲和层析柱、HPLC柱等柱中，可以用于检测、纯化或分离人IgA。(IgA的纯化方法)
本发明进一步提供IgA的纯化方法，该方法包括使上述本发明的肽或固定化肽与IgA结合，以及使结合的IgA游离而回收IgA。将固定化了本发明的肽的固相填充于亲和层析柱、HPLC柱等柱中，用适当的缓冲液平衡，在室温 0°c、优选约10°C 0°C的低温(进一步优选约4°C)下施以含有人IgA的液体，使人IgA与固相上的肽结合。例如在分离血清中的IgA时，可以使用中性范围的pH、例如pH6. O 7. 5的缓冲液，上柱，进行结合操作。洗脱可以在柱中流动酸性范围的pH、例如pH2 4的缓冲液(例如含有O. 3M NaCl的ρΗ3· 5至ρΗ2· 5的O. 2Μ甘氨酸-HCl缓冲液)来进行。IgA是否已被回收可通过，例如，电泳、之后的使用抗人IgA抗体的Western印迹法来测定。电泳条件如下可以进行使用了 5 20%丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-PAGE，另外，Western印迹条件如下可以将电泳后的蛋白质转印至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭后，利用抗人IgAa链山羊抗体与HRP标记抗山羊IgG小鼠抗体进行检测。
本发明的方法可用于由各种方法生成的含IgA的产物中纯化IgA的工序中获得富集IgA的级分。因此，亲和层析、HPLC等柱层析中优选使用本发明的方法。纯化IgA时，除了这类层析法之外，还可以适宜组合蛋白质的惯用纯化技术，例如，凝胶过滤层析、离子交换柱层析、反相柱层析等层析、硫酸铵分级沉淀、超滤等。(IgA的分析方法)
本发明进一步提供IgA的检测方法，该方法包括使样品中的IgA与上述本发明的肽或固定化肽结合而检测结合的IgA。其中，检测中包含定性或定量的任一种分析。IgA的检测可以如下进行使用适合操作中的缓冲液，同时使样品与膜或聚苯乙烯孔板等结合，使其与本发明的标记肽接触，根据需要进行洗涤后，对标记的水平进行定性或定量。
或者，在如上所述使用固定化了本发明的肽的HPLC柱时，向该柱注入含有人IgA的样品，通入结合缓冲液，使人IgA与肽结合，在例如吸光度280nm、或280nm的激发光所致的350nm的荧光下，检测蛋白质进行记录，用洗脱缓冲液(例如，含O. 15M的NaCl的O. IM甘氨酸盐酸缓冲液PH2. 5中的梯度洗脱)从柱洗脱，通过出现的峰和峰面积，可以进行IgA的定性和定量。(试剂盒和柱)
本发明进一步提供用于人IgA的分析(定性、定量等)或纯化的试剂盒，其含有上述本发明的肽或固定化肽的至少I种。本发明的试剂盒中所含的各肽或固定化肽盛放于单独的容器中。另外，根据需要，试剂盒中还可以具备记载了人IgA的分析步骤、纯化步骤的使用说明书。进而，试剂盒中还可以含有分析所需的试剂、缓冲液、固定化肽填充柱等。本发明进而还提供IgA分离用柱，其含有上述本发明的固定化肽。固定化肽可以将肽共价地或非共价地与通常的层析用载体(填充材料)结合来制作。这类载体的例子为琼脂糖、精制琼脂糖等多糖类基质的载体、硅胶基质的载体、树脂基质或聚合物基质的载体等。将肽结合于载体时，可以通过烃链(例如C4 C16)之类的间隔体进行结合。上述IgA分离用柱是用于分离IgA的柱，具体包含用于IgA的分析或纯化分离获得的层析柱、高效液相层析(HPLC)柱等柱。柱的尺寸没有特别限制，可以根据分析用、纯化分离获得用等用途、施用(搭载)或注入的量等进行改变。另外，柱的材质可以可以是金属、塑料、玻璃等通常用作柱的材质。上述的柱可以通过将根据上述手法制作的本发明的固定化肽(干燥或湿润状态)紧密地填充于柱中来制造。
实施例以下，列举实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的限制。[实施例I]
由随机肽T7噬菌体文库分离人IgA特异性噬菌体
为了从已构建的使用了 T7噬菌体展示系统的随机肽文库(CX7_1(IC以及X3CXmciCX3)分离人IgA特异性的噬菌体，使用了以下的生物淘选的方法。即，将含有O. 5%BSA的PBS中的5 X 101° pfu的T7噬菌体文库(CX7_1QC与X3CX7_1QCX3的混合物)溶液加入涂布了人IgG (多克隆，ICN/Cappel Biomedicals) (I μ g/100 μ I/孔)并用 O. 5%BSA 进行了封闭的 96 孔微板(Nunc, Maxisorp)的孔中，反应I小时(吸收步骤)。接着,将其上清转移至涂布了人IgA(来自人血楽·，Athens Research &Technology, Athens, GA, USA) (I μ g/100 μ I/孔)并用0.5%BSA (牛血清白蛋白)进行了封闭的孔中，进行I小时反应(结合步骤)。除去上清的噬菌体溶液后，用含有O. l%Tween (注册商标)的PBS (磷酸缓冲盐水)洗涤孔5次(洗涤步骤)。加入大肠杆菌5615 (Novagen)的培养液(300 μ I)进行感染,与3ml的大肠杆菌培养液一起在37°C下孵育，直至增殖、溶菌(增殖步骤)。按照常法通过利用聚乙二醇的噬菌体沉淀法从溶菌后的培养液回收噬菌体。使所得噬菌体溶解于PBS中，通过O. 45 μ m的过滤器后，用于随后的淘选。包含上述进行5次淘选，由此浓缩IgA特异性的噬菌体。其中，在第3 5次淘选中，在吸收步骤中使用涂布了人IgG以及小鼠IgE (各自I μ g/孔)的孔，另外，在洗涤步骤中用含有O. 3%Tween (注册商标)的PBS进行了 10次洗涤。相对于5次淘选后所得噬菌体的各种免疫球蛋白的结合特异性通过ELISA来调查，结果如图I所示，与使用了原来文库的ELISA的结果相比，明显可见对人IgA的结合活·性的增大。因此，将这些噬菌体随机地克隆20个克隆后，对于由ELISA观察到结合活性的10个克隆，进行展示的肽模体的分析，确定氨基酸序列(表I)。
权利要求
1.一种肽，其特征在于，含有下述式I所示的由12 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合(Xi-3) -C- (X8_10) -C- (X^3) (I) 式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基。
2.权利要求I所示的肽，其特征在于，含有下述式II所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合(X3) -C-L- (X7-9) -C- (X3) (II) 式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失。
3.权利要求2所述的肽，其特征在于，含有下述式III所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (III) 式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者其任一者或两者缺失。
4.权利要求3所述的肽，其特征在于，含有下述式IV所示的由16 18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合(X3)—C-L-X-Y- (X^3)—G- (X2)—V-C- (X3) (IV) 式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，L为亮氨酸残基，Y为酪氨酸残基，G为甘氨酸残基，V为缬氨酸残基，其中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第9个和第10个氨基酸残基X独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，或者或者任一者或两者缺失，以及从N末端起第16个和第18个氨基酸残基独立地为疏水性氨基酸残基。
5.权利要求I 4中任一项所述的肽,其中，为18个氨基酸残基时,从N末端起第I 3、5 14、16 18个的各氨基酸残基为 第I个氨基酸残基=Q，H, K, R, S或P ; 第2个氨基酸残基=M, K, R, L, V, A或D ; 第3个氨基酸残基=R，L, M或V ; 第5个氨基酸残基=L ； 第6个氨基酸残基=S，H, Q, T, K, R, N或A ; 第7个氨基酸残基=Y ； 第8个氨基酸残基=K或R ; 第9个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失； 第10个氨基酸残基=C之外的任意氨基酸残基、或者缺失； 第11个氨基酸残基=G； 第12个氨基酸残基=R，S，T或K; 第13个氨基酸残基=R，Μ, K, Ε, N或P;第14个氨基酸残基=V ； 第16个氨基酸残基=L，F，V或I ; 第17个氨基酸残基=W，L, R, Ε, T, S，Q, P或A ;或者 第18个氨基酸残基=L，I, Y, A或V。
6.权利要求I 5中任一项所述的肽，其中，上述式I 式IV的肽中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第16个氨基酸残基X为亮氨酸或苯丙氨酸残基。
7.权利要求I 6中任一项所述的肽，其中，上述式I 式IV的肽中，为18个氨基酸残基时，从N末端起第18个氨基酸残基X为亮氨酸残基。
8.权利要求I 7中任一项所述的肽，其由以下I) 26)中任一氨基酸序列组成 1)HMRCLHYKGRRVCFLL (序列编号 I) 2)QMRCLSYKGRRVCLffL (序列编号 2) 3)HKRCLHYRGRMVCFLI (序列编号 3) 4)KRLCLQYKGSKVCFRL (序列编号 4) 5)RMRCLTYRGRRVCLEL (序列编号 5) 6)SMRCLQYRGSRVCLTL (序列编号 6) 7)QKRCLKYKGSRVCFFL (序列编号 7) 8)HLRCLRYKGTRVCFSL (序列编号 8) 9)HVRCLSYKGREVCVQL (序列编号 9) 10)PRMCLHYKGRRVCIPY (序列编号 10) 11)HVRCLRYRGKNVCFLL (序列编号 11) 12)SDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 15) 13)RDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 16) 14)HDVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 17) 15)SMVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 19) 16)SAVCLRYRGRPVCFQV (序列编号 20) 17)SDVCLNYRGRPVCFQV (序列编号 24) 18)SDVCLHYRGRPVCFQV (序列编号 25) 19)SDVCLAYRGRPVCFQV (序列编号 26) 20)SDVCLRYRGRPVCFRV (序列编号 37) 21)SDVCLRYRGRPVCFLV (序列编号 38) 22)SDVCLRYRGRPVCFAV (序列编号 39) 23)SDVCLRYRGRPVCFQL (序列编号 41) 24)SDVCLRYRGRPVCFQA (序列编号 42) 25)HMVCLAYRGRPVCFAL (序列编号 43) 26)HMVCLSYRGRPVCFSL (序列编号 44)。
9.权利要求I 8中任一项所述的肽，其中，肽在2个半胱氨酸(C)残基间形成有二硫键。
10.权利要求I 9中任一项所述的肽，其与IgA的血清型(单体)和分泌型(二聚体)彡口口
11.权利要求I 10中任一项所述的肽，其结合有标记标记。
12.融合蛋白质，其由权利要求I 11中任一项所述的肽与所连接的蛋白质组成。
13.固定化肽，其是将权利要求I 11中任一项所述的肽与固相结合而成。
14.核酸,其编码权利要求I 11中任一项所述的肽。
15.IgA的纯化方法，其包括使权利要求I 11中任一项所述的肽或权利要求13所述的固定化肽与IgA结合，以及使结合的IgA游离而回收IgA。
16.IgA的检测方法，其包括使样品中的IgA与权利要求I 11中任一项所述的肽或权利要求13所述的固定化肽结合而检测结合的IgA。
17.用于人IgA的分析或纯化的试剂盒，其含有权利要求I 11中任一项所述的肽或权利要求13所述的固定化肽的至少I种。
18.IgA分离用柱，其含有权利要求13所述的固定化肽。
全文摘要
肽、使用该肽的人IgA的分析或纯化方法，所述肽的特征在于，含有(X1-3)-C-(X8-10)-C-(X1-3)(式中，X各自独立地为半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基)所示的由12～18个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且可以与人IgA结合。
文档编号G01N33/53GK102892885SQ20118002561
公开日2013年1月23日 申请日期2011年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者伊东祐二 申请人:国立大学法人鹿儿岛大学, 大塚化学株式会社