通过使用两个具有长短路径的流动池检测器的扩展的线性范围的制作方法

通过使用两个具有长短路径的流动池检测器的扩展的线性范围的制作方法
【专利摘要】样品检测装置（200），用于检测流过第一流动池（202）和流过样品分离系统（10）的第二流动池（204）的流体样品，其中，所述第一流动池（202）具有第一路径长度（D），所述第二流动池（204）具有小于第一路径长度（D）的第二路径长度（d），其中，所述样品检测装置（200）包括数据确定单元（206），其配置成用于确定第一流动池（202）中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第一关系的第一数据表示，并且配置成用于确定第二流动池（204）中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第二关系的第二数据表示；和数据组合单元（208），其配置成用于根据连续的加权函数组合所述第一数据与第二数据，从而得出检测信号强度与流体样品的浓度之间的加权关系，以使得该加权关系随着增加的浓度不断降低所述第一数据的贡献且不断增加所述第二数据的贡献。
【专利说明】通过使用两个具有长短路径的流动池检测器的扩展的线性范围
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用流动池的样品检测。
【背景技术】
[0002]在液相色谱中，流体分析物可被泵送通过导管及包括材料的柱子，该材料能够分离流体分析物的不同组分。这样的材料，即可能包括硅胶的所谓小球，可以填充到柱子管中，柱子管可以通过导管连接至其他元件(如控制单元、包括样品和/或缓冲液的容器)。当流体样品被泵送通过柱子管时，其被分离成不同的馏分。经分离的流体可被泵送到流动池中，在流动池中基于光学检测机理来识别不同的组分。
[0003]US5214593公开了一种方法及相应的设备，用于自动延伸包括多光路流动池的吸光度检测器的线性动态吸光度范围。在开发超出其线性动态范围用于样品路径的相对吸光度中，在相对较短的参考路径中的参考光束的吸光度乘以相对较长样品路径中样品光束的吸光度与参考路径吸光度的比例。
[0004]传统的检测池可能在待检测样品浓度值的足够大的范围上遭遇受限制的精度。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是使得基于流动池的样品检测能够具有适当的检测精度。此目的是由独立权利要求来解决的。进一步的实施例由从属权利要求示出。
[0006]根据本发明的示例性实施例，提供了一种样品检测装置，用于检测流过第一流动池和流过样品分离系统(比如液相色谱装置)的第二流动池(其可位于所述第一流动池的上游或下游，特别是可以与该第一流动池流体连通)的流体样品，其中，所述第一流动池具有第一路径长度，所述第二流动池具有小于(或短于)第一路径长度的第二路径长度，其中，所述样品检测装置包括数据确定单元(其可以是处理器或处理器的一部分)，其配置成用于确定表示第一流动池中检测信号强度(比如由流体样品吸收的电磁辐射)与流体样品的浓度(或流体样品的级分)之间的第一关系的第一数据，并且配置成用于确定表示第二流动池中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第二关系的第二数据，和数据组合单元(其可以是处理器或处理器的一部分)，其配置成用于根据连续的加权函数组合所述第一数据与第二数据(例如增加不同的贡献)，从而得出检测信号强度(即有效的或加权的检测信号强度)与流体样品的浓度之间的加权关系，以使得所述加权关系随着增加的浓度不断降低所述第一数据的贡献且不断增加所述第二数据的贡献(换句话说，所述加权关系可能加权具有强烈地以所检测到的流体样品的低浓度值并且更弱地以所检测到的流体样品的更大浓度值的较长流动池的第一流动池的贡献；相应地，所述加权关系可能加权具有强烈地以所检测到的流体样品的高浓度值并且更弱地以所检测到的流体样品的更低浓度值的较短流动池的第二流动池的贡献)。
[0007]根据另一示例性实施例，提供了一种用于分离流体样品组分的样品分离系统，所述样品分离系统包括分离单元(比如色谱柱)，其配置成用于将流体样品分离成组分;第一流动池，其与分离单元流体连通，用于接收来自分离单元的所分离的样品流体，其中，所述第一流动池具有第一路径长度；第二流动池，其与分离单元流体连通，用于接收来自分离单元的所分离的样品流体，其中，所述第二流动池具有小于第一路径长度的第二路径长度；以及具有上述特征的样品检测装置，其配置成用于检测所分离的组分。
[0008]根据另一示例性实施例，提供了一种检测流过第一流动池和流过样品分离系统的第二流动池的流体样品的方法，其中，所述第一流动池具有第一路径长度，所述第二流动池具有小于第一路径长度的第二路径长度，其中，所述方法包括确定表示第一流动池中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第一关系的第一数据；确定表示第二流动池中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第二关系的第二数据；以及根据连续的加权函数组合所述第一数据与第二数据，从而得出检测信号强度与流体样品的浓度之间的加权关系，以使得所述加权关系随着增加的浓度不断降低所述第一数据的贡献且不断增加所述第二数据的贡献。
[0009]根据本发明的另一示例性实施例，提供了一种软件程序或产品，优选地存储在数据载体上，用于当在数据处理系统(其可以包括数据确定单元和数据组合单元)比如计算机上运行时控制或执行具有上述特征的方法。
[0010]本发明的实施例可以由一个或多个合适的软件程序部分地或完全地体现或支持，所述软件程序可存储在数据载体上或者以其他方式由任何类型的数据载体提供，并且可能会在任何合适的数据处理单元中执行或由其执行。软件程序可以优选地应用在测量数据分析的上下文中。根据本发明实施例的测量数据分析方案可以由计算机程序即软件执行或协助，或者通过使用一个或多个特殊的电子最优化电路，即以硬件或者以混合的形式，即通过软件组件和硬件组件。
[0011]在本申请的上下文中，术语“流动池”可具体地表示由可能已经被分离的流体样品可流过的管划界的流体通道。在流动池中，电磁辐射可被引入，并且随后，流体样品的特征可通过检测由流体样品的电磁辐射的吸收而得到表现，或者通过在由主电磁辐射激发后检测由流体样品发射的荧光辐射而得到表现。
[0012]术语“路径长度”可具体地表示相应流动池的电磁辐射的入口接口与电磁辐射的出口接口之间的物理长度，即最短的距离，在其之间，电磁辐射传播，以便与通过相应流动池而引导的流体样品相互作用。沿着该路径的长度，可以使得流体样品与电磁辐射之间能够相互作用。术语“路径长度”可以更具体地表示流动池的光入口接口(例如光入口纤维的纤维末端)与光出口接口(例如光出口纤维的纤维开始)之间的最短距离。
[0013]术语“电磁辐射”可以具体地表示全体光子。例如，电磁辐射可以在可见光、紫外辐射或红外辐射的范围内。照射到流体样品上的主电磁辐射与响应于主电磁辐射的从流体样品中所接收的二次电磁辐射可能会或可能不会就波长来说而不同。这种主电磁辐射和这种二次电磁辐射可以是单色的或多色的。
[0014]术语“检测信号强度与流体样品的浓度之间的关系”可具体地表示这两个参数的特征相关性。换句话说，检测信号强度比如吸光度的某值(例如在峰值上积分)可能与对应于该峰值的流体样品级分的浓度的某值相关。根据Lambert Beer定律，检测信号的强度，特别是吸光度，以及在流动相内的流体样品(例如分子的某级分)的浓度可以在没有假象的情况下是线性的。然而，原始检测信号强度与流体样品的浓度之间的关系仍可能包括这样的假象。
[0015]术语“加权函数”可具体地表示这样的函数，也就是根据其，两个流动池的与测量相关的数据的贡献得以组合而得出结果。例如，加权函数可以定义来自第一流动池的测量信号将被考虑占x%，来自第二流动池的测量信号将被考虑占(100-X) %，其中，X可以随不同的吸光度(且因此浓度)值而不同。
[0016]术语“连续的加权函数”可具体地表示加权函数，对于其来说，输入的小变化导致输出的小变化，特别地，函数不是其中函数的值跳跃的不连续部分。换句话说，连续函数提供值的平滑过渡。在本申请的上下文中，加权函数是连续的，并且描述了一种贡献，其来自于在将要彼此组合的两个不同的流动池的检测信号强度与流体样品浓度之间的关系。为了获得没有假象的物理意义的加权函数，由于连续加权函数的原因，这两个流动池的贡献之间的过渡是平滑的。
[0017]根据本发明的示例性实施例，流动池布置特别是液相色谱设备的线性范围通过使用两个流动池(其可被串联流体地联接)及因此两个检测器而得以扩展，其中，所述不同的流动池具有不同的长度。使用具有不同长度的两个流动池涉及这样的事实，也就是与长流动池相比，对于短流动池来说，其中相应流动池的检测信号强度由于噪声而示出假象的流体样品的浓度值的子范围更高。另一方面，在检测信号强度的线性度根据其而受到干扰的高浓度值的饱和效应涉及这样的效应，也就是大多数的使用光被样品吸收并且一些不适合可吸收的光传播通过流动池，基本上不与流体样品相互作用。与短流动池相比，此假象可能会已经在长流动池中的较低浓度值出现达显著的程度。本发明的实施例现在考虑这两个效应，并且使用相对于从所测量的数据中可得出的浓度特性的检测信号强度，所测量的数据是以这样的方式从这两个流动池中获得的，也就是考虑了两个流动池的选择性的长处和短处。这根据连续的加权函数通过考虑来自长流动池与短流动池的贡献而得以反映，所述连续的加权函数专门或主要使用在相对小的浓度值的较长流动池的贡献，专门或主要使用来自在相对高的浓度值的短流动池的贡献，并提供在这些高低浓度值之间的中间范围内的平滑过渡。通过模拟在考虑上述物理边界条件下的加权函数且同时需要加权函数在浓度值的整个范围上总是连续的可以抑制假象并获得广泛的准线性范围，其中在加权的检测信号强度与流体样品的浓度之间的得出的相关性提供了高度精确的结果。
[0018]在下文中，将对样品检测装置的进一步的示例性实施例进行说明。然而，这些实施例同样适用于所述样品分离系统、所述方法以及所述软件程序或产品。
[0019]在实施例中，所述数据组合单元配置成用于根据连续的可微加权函数组合所述第一数据与第二数据。在这样的优选实施例中，限定长流动池与短流动池的各个贡献的加权函数不仅是连续函数，而且在浓度值的整个范围上是连续可微的。在此上下文中，术语可微指的是不仅加权函数本身而且加权函数的一阶导数关于浓度是连续的。已经表明，不仅使加权函数连续而且可微进一步改善所得出的数据的意义。
[0020]在实施例中，所述数据组合单元配置成用于组合所述第一数据与第二数据，以通过这样得出所述加权关系:专门使用第一数据，不考虑低于所述检测信号强度的下限阈值的第二数据(其可以特别是吸光度值，例如在峰值上积分)；专门使用第二数据，不考虑高于大于所述检测信号强度下限阈值的上限阈值的第一数据；根据所述下限阈值与上限阈值之间的加权函数使用第一数据与第二数据，从而使加权关系是连续的，特别是示出在下限阈值与上限阈值的平滑过渡。这里应该说的是，吸光度还表示流体样品的所检测到的级分的浓度(在级分中的分子越多，吸光度就越强)。本优选实施例基于的认知是，长流动池具有特别的强度并且显示已经在相当小的浓度值(及相应的小的吸光度值)的适当的线性，在该值，短流动池仍然遭受噪声，而在非常高的浓度值(及相应的高吸光度值)，短流动池具有适当的非线性行为，而长流动池已经遭受基于饱和度的假象。因此，仅长流动池的检测信号强度使用在达下限阈值的小的浓度/吸光度值，并且仅短流动池的贡献用在浓度/吸光度的另一上限阈值之上。然而，在其中两个流动池提供可接受的线性度的这两个阈值之间的区域中，流动池的吸光度相关(因而浓度相关)的贡献是在考虑这样的条件下被选择的，也就是在下限阈值与上限阈值，加权函数都示出平滑过渡。更优选的是，加权函数也是可微的，特别是在这些值，即下限与上限阈值。
[0021]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于基于从相应流动池所接收的测量信号来确定相应的数据，测量信号表示检测信号强度与测量时间之间的关系。测量信号可以是检测信号强度(比如在基于吸收测量的电磁辐射的情况下的吸光度)与测量时间之间的关系。当流体样品通过具有强烈吸收电磁辐射(或附带有荧光标签)的分子的检测器时，检测器将会检测吸光度的峰值。因此，信号强度的值可以随时间测量。在其中这样的峰具有最大的时间也可以记为液相色谱的保留时间。然后，在这样的峰上积分可以允许获得检测信号强度与流体样品的浓度之间的上述关系。
[0022]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于基于响应于因主电磁辐射的流体样品的照射从流体样品所测量的二次电磁辐射来确定相应的数据，所测量的二次电磁辐射构成从相应的流动池所接收的测量信号。在这样的实施例中，电磁辐射源发出电磁辐射到沿着流动池通过的流体样品上。此所谓的主电磁辐射可以与流体样品相互作用(例如，流体样品可以从该主电磁辐射中吸收特定的波长)。因此，可在主电磁辐射与样品相互作用后被检测的所谓的二次电磁辐射得以产生，并且可以用作待检测的流体样品的指纹。
[0023]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于单独地为所述二次电磁辐射的不同测量波长而确定相应的数据。相应地，所述数据组合单元配置成用于根据不同于所述二次电磁辐射的不同测量波长的波长相关的加权函数来组合所述第一数据与第二数据。在本优选实施例中，多色电磁辐射，即具有不同波长的主电磁辐射，被发射到流体样品上。因此，多波长测量可同时进行。来自不同波长的贡献可以通过将其引导到光栅或任何其他波长的选择性部件上与二次电磁辐射分离，从而使全体波长可以沿着例如可以是线性阵列光电池的检测器在空间上传播。因此，测量可以同时执行，用于显著增加所检测到的结果的意义的多个波长。然而，由于检测信号强度与浓度之间的关系还取决于波长，所以可以使用单独的加权函数用于每个波长，或在其他方面，波长可以是加权函数所依赖的参数。
[0024]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于选择性地添加延迟至第一流动池(当布置在第二流动池的上游时)的测量信号，以便与第一流动池相比，至少部分地补偿第二流动池中的测量信号延迟。另外或可选地，延迟可以选择性地从第二流动池的测量信号中被减去，用于至少部分地补偿测量信号延迟。通过采取这一措施，假象可以得到补偿，也就是与第一流动池相比，已首先通过第一流动池且然后流向第二流动池的流体样品带有时间延迟到达第二流动池。为了使得可以直接比较两个流动池的测量信号，可对延迟进行建模，以使得由第一流动池所检测到的峰值可向后面的时间转移，以便补偿这样的延迟。另外，第二流动池的信号可向前面的时间转移。
[0025]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于根据流体样品的流率来添加选择性的延迟。流率可由压力传感器或者由沿着流路布置的流率传感器测量。流率可以表示为每个时间间隔的流动流体体积。如果该流率是已知的，则第一流动池与第二流动池之间的延迟时间可以被计算，且然后可以得到补偿。
[0026]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于选择性地仅扩大第一流动池(当布置在第二流动池的上游时)的测量信号，以便与第一流动池相比，至少部分地补偿第二流动池中的测量信号扩大。另外或可选地，所述数据确定单元可以配置成用于选择性地仅缩小第二流动池的测量信号，以便与第一流动池相比，至少部分地补偿在第二流动池中的测量信号扩大。沿着流路发生在流体样品的流动期间的物理过程的结果是可能会出现峰的扩大。换句话说，当流体样品流过整个流路时，峰的半峰全宽可能会增加。因此，为了使得可以直接比较不同流动池之间的检测信号强度，在(下游)第二流动池所检测到的额外的扩大应考虑在内。
[0027]在实施例中，所述数据确定单元包括滤波器，特别是无限脉冲响应滤波器，用于进行选择性的扩大。一般来说，任何适当的滤波器可以用来模拟这样的扩大。然而，已经表明，使用无限脉冲响应滤波器(IIR滤波器)是特别精确和简单的。IIR滤波器可以具有在无限长度的时间上非零的脉冲响应函数。已经表明，这样的滤波器正确地模拟流动流体样品的扩大效应。
[0028]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于缩放相对于彼此的第一流动池及第二流动池的测量信号(沿信号强度轴)，以便至少部分地补偿在第一流动池及第二流动池中的不同路径长度。吸收信号与浓度值之间的绝对相关性取决于流动池的长度，因为在较长池中的吸收可能比较短池中更多，由于流体样品与电磁辐射之间的较大的相互作用时间。为了使得可以直接比较不同长度的流动池的信号，对两个信号中的至少一个进行重新缩放是有利的。
[0029]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于通过归一化测量信号至可定义为标准的归一化的路径长度来缩放相对于彼此的第一流动池及第二流动池的测量信号。例如，归一化的路径长度可以是I厘米。然后，可能具有超过I厘米(或更一般地大于归一化的路径长度)的流路的第一流动池可缩小尺寸至该更短的长度。相应地，可能具有比归一化的路径长度更短的流路的第二流动池可能会扩展或放大。通过归一化来自不同流动池的信号至归一化的路径长度，可以使得能够直接比较不同流动池的不同检测信号。
[0030]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于进行基线校正，以便至少部分地除去隐藏在第一流动池及第二流动池的测量信号中的信号。由于流体样品中的杂质和其他效应，一些额外的非特征性的信号可能被叠加至测量信号。这种非特异的信号可能会在组合第一及第二流动池的测量信号之前被至少部分地除去，以进一步提高精度。
[0031]在实施例中，所述数据确定单元配置成用于通过例如确定和减去用于模拟隐藏的信号的来自第一及第二流动池的测量信号的线性函数来进行基线校正。已经表明，线性函数即函数y=ax+t对于许多杂质来说是用于隐藏的非特异性信号贡献的适当的近似，并且对于数据分析系统来说不涉及太多的计算负担。然而，其他的函数，比如多项式函数，也可以用于模拟隐藏的信号。
[0032]在实施例中，所述检测信号强度表示通过流体样品的在相应路径长度上沿着相应流动池传播的电磁辐射的吸收(或吸光度)。术语“吸收”可以表示通过与流体样品相互作用的主电磁辐射的信号强度的降低。然而，与吸收测量对比，还可以执行过渡测量，荧光测
且雄里寺。
[0033]在实施例中，相应的数据可以表示在相应流动池中的除以流体样品浓度的相应检测信号强度与流体样品的浓度之间的相应关系。根据Lambert Beer定律，流动池的检测信号强度(更精确地说是吸光度)是流体样品的浓度的线性函数。然而，通过将该检测信号强度除以浓度，可以得出在没有假象情况下的常数函数。然而，由于在低浓度值的噪声且由于在高浓度值的饱和效应，所以这样的常数函数的偏差可能会出现。
[0034]在实施例中，所述样品检测装置还配置成用于检测流过具有不同于所述第一路径长度与第二路径长度的第三路径长度的第三流动池的流体样品，其中，所述数据确定单元配置成用于确定表示第三流动池中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第三关系的第三数据，并且其中，所述数据组合单元配置成用于根据连续的加权函数组合第一数据、第二数据和第三数据。因此，可以添加第三流动池(并且如果需要的话，甚至更多的流动池)，以进一步细化和扩展线性范围。然后，可将这些两个以上流动池的各个信号的组合以如上文所述的相应方式估计。换句话说，所述数据确定单元与数据组合单元可以适于以如本文所述的相应方式来组合至少三个贡献。
[0035]在实施例中，加权函数是在考虑这样的边界条件下而被选择的，也就是基于噪声的假象(在显著程度上，即在大于预定噪声阈值的程度上)以仅比第二流动池中更低的浓度出现在第一流动池中。可以认为，这种影响产生于这样的事实，也就是用于线性行为的足够的统计基础在非常低的浓度值不具有足够的精度，但是取决于相应流动池的长度。
[0036]在实施例中，加权函数是在考虑这样的边界条件下而被选择的，也就是产生于杂散辐射(比如杂散光)的基于饱和度的假象(在显著程度上，即在大于预定饱和度阈值的程度上)已以比第二流动池中更低的浓度出现在第一流动池中。可以认为，如果大多数的可用光已经在流动池中被吸收，则此效应会出现，从而以已在较长流动池中较低的浓度值出现这种效应。
[0037]在实施例中，所述第一路径长度与第二路径长度被选择成使得其上第一流动池示出检测信号强度与流体样品的浓度之间的线性关系的流体样品的浓度值的范围与其上第二流动池示出检测信号强度与流体样品的浓度之间的线性关系的流体样品的浓度值的另一范围重叠。因此，对于用户来说，根据示例性实施例的多个流动池布置有效地表现为具有非常长的范围的线性行为的液相色谱装置。
[0038]在实施例中，所述加权函数具有用于第一流动池的贡献exp (-A/ ξ ) κ，并且具有用于第二流动池的贡献1-exp (_Α/ξ)κ，其中，A是标称的吸光度，ξ定义了第一流动池的贡献等于第二流动池的贡献的吸光度值，κ是定义了加权函数斜率的参数。已经表明，相应的加权函数导致两个信号贡献的无假象组合。
[0039]在下文中，将对样品分离系统的进一步的示例性实施例进行说明。然而，这些实施例同样适用于所述样品检测装置、所述方法及所述软件程序或产品。
[0040]在实施例中，所述第二流动池布置在第一流动池的下游并且与之流体连通，用于接收来自第一流动池的所分离的样品流体。换言之，流体样品然后将先通过第一流动池，并且随后将仅通过串联连接的第二流动池。
[0041]在实施例中，所述第一路径长度大于约15毫米，第二路径长度小于约8毫米。在实施例中，所述第一路径长度在约10毫米与约100毫米之间的范围内，特别是在约30毫米与约80毫米之间的范围内。在实施例中，所述第二路径长度在约I毫米与约9毫米之间的范围内，特别是在约2毫米与约5毫米之间的范围内。已经表明，流动池的这些长度是适合的，以便允许组装这两个流动池的线性子范围。例如，与标准的流动池相比，本发明的示例性实施例可以使较大流动池的长度增加6倍，而可以使较短流动池的长度降低3倍。
[0042]在实施例中，所述样品分离系统包括用于每个第一与第二流动池的电磁辐射源，所述电磁辐射源配置成用于产生主电磁辐射，以便照射在相应流动池中的流体样品。所述电磁辐射源可以配置成用于产生作为主电磁辐射的光学光束、紫外光束及红外光束之一，以便照射在相应流动池中的流体样品。所述电磁辐射源可以配置成用于产生多色主电磁辐射，以便照射在相应流动池中的流体样品。所述电磁辐射源可以配置成包括氘灯、氙灯和钨灯的组中的一个。
[0043]在实施例中，所述样品分离系统包括用于每个第一与第二流动池的电磁辐射检测器，其中，所述电磁辐射检测器包括光学光检测器与紫外辐射检测器中的一个。所述电磁辐射检测器可以包括单个检测元件、线性阵列检测元件及二维阵列检测元件中的一个。所述电磁辐射检测器可以包括电磁辐射敏感单元和在流体样品的流路与所述电磁辐射敏感单元之间的光栅。
[0044]在实施例中，所述第一与第二流动池中的每个配置为全内反射(TIR)流动池。更具体地，可以设置流体样品通过其在相应流动池中流动的管。照射在相应流动池中流动的流体样品的电磁辐射源可以与所述管一起布置且配置成用于实现在该管外壁的电磁辐射的全反射。通过全内反射流动池的传输基本上独立于流动池的长度，因为基本上没有电磁辐射可以从全内反射流动池中逃离。因此，与常规的流动池相比，TIR流动池提供适当的基础用于延伸检测信号的线性范围。因此，优选的是使用根据示例性实施例的TIR流动池，因为各个流动池的线性子范围的重叠可能在这种流动池中特别明显。
[0045]所述样品分离系统可以包括填充有分离材料的分离元件。还可以表示为固定相的这样的分离材料可以是任何材料，其允许与流体样品的可调节程度的相互作用，以能够分离这样的流体样品的不同组分。分离元件可以布置在检测器上游的流体路径中，以使得由分离元件所分离的样品的级分随后可由检测器设备检测。
[0046]所述分离材料可以是液相色谱柱填充材料或包装材料，其包括由聚苯乙烯、沸石、聚乙烯醇、聚四氟乙烯、玻璃、聚合物粉末、二氧化硅和硅胶构成的组中的至少一个，或具有化学改性(涂层、覆盖等)的表面的上述中的任何一个。然而，可以使用具有允许穿过该材料的分析物被分离成不同组分的材料性能的任何包装材料，例如，由于包装材料与分析物的级分之间的不同种类的相互作用或亲合力。
[0047]所述分离元件的至少一部分可以填充有流体分离材料，其中，所述流体分离材料可以包括尺寸在约Iym至约50 μπι范围内的小球。因此，这些小球可以是可填充在微量样品分离系统的分离部分中的小颗粒。所述小球可以具有尺寸在约0.01 μ m至约0.2 μ m范围内的孔。流体样品可穿过这些孔，其中，在流体样品与孔之间可能会发生相互作用。[0048]所述样品分离系统可以配置为用于分离样品组分的流体分离系统。当包括流体样品的流动相通过该样品分离系统时，例如采用高压，所述柱的填充物与流体样品之间的相互作用可以允许分离样品的不同组分，如在液相色谱设备中所进行的那样。
[0049]然而，所述样品分离系统还可以配置为用于净化流体样品的流体净化系统。通过在空间上分离流体样品的不同级分，多组分的样品可以得到净化，例如蛋白质溶液。当蛋白质溶液已在生化实验室中被制备时，其可能还包括多个组分。例如，如果仅该多组分液体的单个的蛋白质是有益的，则样品可能被强制通过所述柱。由于不同蛋白质级分与所述柱的填充物的不同的相互作用(例如，使用液相色谱设备)，所以不同的样品可以得到区分，并且一个样品或材料带可被选择性地分离为净化的样品。然后，检测器可用于控制净化的成功。
[0050]所述样品分离系统可以配置成引导流动相通过具有高压的系统，例如50bar至lOObar、特别地至少600bar、更特别地至少1200bar。
[0051]所述样品分离系统可以配置为微量样品分离系统。术语“微量样品分离系统”可具体地表示如本文所述的样品分离系统，其允许输送流体通过具有小于500 μ m、特别地小于200 μ m、更特别地小于100 μ m或小于50 μ m以下的数量级的尺寸的微通道。
[0052]示例性实施例可以基于最传统可用的HPLC系统，比如Agilent 1200系列快速高分
离LC系统或AgilentllOOHPLC系列(二者均由 申请人:Agilent Technologies提供-参
见WWW.aqilent.com-其通过引用并入本文)而得以体现。
[0053]优选地，所述分离设备包括提供固定相的色谱柱(例如参见http://en.wikipedia.0rg/wiki/Column chromatography)。该柱可以是玻璃管或钢管(例如直径为50μπι至5mm且长度为Icm至Im)或微流体柱(例如公开在EP1577012或由 申请人:Agilent Technologies 提供的 Agi lent 1200 系列 HPLC-Chip/MS 系统中，例如参见 http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.asp IPage=38308)。例如，衆料可以米用固定相的粉末制备，然后将其倾倒并压入柱中。各个组分由固定相不同地保留，并且彼此分开，同时它们以不同的速度传播通过具有洗脱液的柱。在柱的末端，它们一次洗脱一个。在整个色谱过程中，洗脱液也可能会以一系列的级分被收集。在柱色谱法中的固定相或吸附剂通常是固体材料。用于柱色谱法的最常见的固定相是硅胶，然后是氧化铝。过去常用的是纤维素粉末。还有可能的是离子交换色谱法、反相色谱法(RP)、亲和色谱法或扩张床吸附(EBA)。固定相通常是精细研磨的粉末或凝胶和/或是用于所增加的表面的微孔，虽然在EBA中使用了流化床。
[0054]流动相(或洗脱液)可以是纯溶剂或不同溶剂的混合物。例如，其可以被选择成使得尽量减少保留有益的化合物和/或流动相的量以运行色谱。流动相还可以选择成使得可以有效地分离不同的化合物。流动相可以包括比如例如甲醇或乙腈(通常用水稀释)的有机溶剂。为了梯度操作，水与有机物输送在单独的瓶子中，梯度泵从其中输送所编程的共混物至系统。其它常用的溶剂可以是异丙醇、THF、己烷、乙醇和/或其中的任何组合或具有上述溶剂的这些的任意组合。
[0055]流体样品可以包括任何类型的处理液、比如果汁的天然样品、比如血浆的体液，或者其可以是比如来自发酵液中的反应的结果。
[0056]HPLC系统可能包括用于将流体样品引入到流动相流中的采样单元、用于检测流体样品的所分离的化合物的检测器、用于输出流体样品的所分离的化合物的级分单元、或其中任意的组合。
【专利附图】

【附图说明】
[0057]结合附图，参照实施例的以下更详细的说明，本发明的其它目的及实施例的许多伴随的优点将很容易理解且变得更好明白。基本上或功能上相同或类似的特征采用相同的附图标记。
[0058]图1示出了根据本发明实施例的例如用在高性能液相色谱(HPLC)中的样品分离系统。
[0059]图2示出了根据本发明示例性实施例的用于检测流过两个不同流动池的流体样品的样品检测装置。
[0060]图3是示出用于流动池的吸光度与浓度之间的相关性的图。
[0061]图4是示出吸光度、归一化浓度和流动池的浓度之间的相关性的图。
[0062]图5示出了用于短流动池的类似于图4的图，图6示出了用于长流动池的类似于图4的表明流动池的线性操作范围重叠且取决于流动路径长度的图。
[0063]图7示意性地示出了表示吸光度与测量时间的相关性且表明短流动池与长流动池之间的信号特性的差异取决于短流动池是否布置在长流动池的上游或下游的图。
[0064]图8是示出了根据本发明示例性实施例的用于从测量数据中得出浓度信息的样品检测装置的数据确定单元与数据组合单元的功能的方框图。
[0065]图9示出了根据本发明示例性实施例的示意性地示出了连续的加权函数的图。
[0066]图10是示出了流过流动池的流体样品的吸光度特性(对数刻度)的图。
[0067]图11示出了绘制组合不同流动池的两个信号的过渡范围的图，并且示出了放大的过渡范围的另一图。
[0068]图12示出了绘制用于组合来自涉及两个流动池的不同长度的两个流路的信号的加权函数的图。
[0069]图13示出了使用根据本发明示例性实施例的加权函数用于组合来自两个流路的信号的计算规则。
[0070]图14不出了表不不同长度的两个流动池的归一化信号的图。
[0071]图15示出了用于确定根据本发明示例性实施例的加权函数的系数的计算规则。
[0072]图16示出了表示用于组合来自取决于吸光度的两个流路的信号的加权函数的系数的图。
[0073]图17示出了类似于图16的另一曲线。
[0074]图18示出了表示随时间变化的吸光度的测量信号。
[0075]图19示出了随时间变化的测量信号，以及其中应用基线校正的随时间变化的组
合信号。
[0076]图20示出了考虑基线校正的用于确定组合信号的计算规则。
[0077]图21示出了表示在峰图(左)上的光谱中和在峰图(右)上的归一化光谱中的波长与吸光度之间的相关性的图。
[0078]图22示出了类似于图21的图。
[0079]图23示出了用于计算随时间和波长限定的结果矩阵的计算规则。[0080]附图中的图示是示意性的。
【具体实施方式】
[0081]现在更详细地参见附图，图1示出了根据本发明实施例的作为样品分离系统的液体分离系统10的总体图。泵20通常经由除气器27接收来自溶剂供给器25的流动相，除气器除去气体并由此减少流动相中溶解的气体的量。泵20—作为流动相驱动器一驱动流动相通过包括固定相的分离设备30 (比如色谱柱)。样品单元40可设置在泵20与分离装置30之间，以将流体样品导入或添加(通常称为样品引入)到流动相中。分离设备30的固定相配置成分离样品流体的化合物。检测器50用于检测样品流体的所分离的化合物。级分单元60可用于输出样品流体的所分离的化合物。
[0082]图1仅以示意性方式示出了检测器50。然而，下述附图将会提供关于这种检测器如何根据示例性实施例配置的细节。所述检测器50包括第一流动池202和第二流动池204，第二流动池具有比第一流动池更短的流路。
[0083]虽然流动相可以仅包括一种溶剂，但是其也可以由多个溶剂混合。这样的混合可能是低压混合并设置在泵20的上游，以便泵20已经接收和泵送作为流动相的混合溶剂。另外，泵20可能包括多个单独的泵送单元，多个泵送单元均接收和泵送不同的溶剂或混合物，从而使流动相(如由分离设备30所接收的)的混合在高压下发生并在泵20 (或作为其一部分)的下游。流动相的成分(混合物)可在时间上保持恒定，即所谓的等度模式，或者随时间而变化，即所谓的梯度模式。
[0084]可以是常规PC或工作站的数据处理单元70可联接到(如虚箭头所指示)液体分离系统10中的一个或多个部件，以接收信息和/或控制操作。例如，数据处理单元70可控制泵20的操作(例如设定控制参数)，并且从其接收关于实际工作状况的信息(比如在泵出口的输出压力、流率等)。数据处理单元70还可控制溶剂供给器25的操作(例如设定待供给的溶剂或溶剂混合物)和/或除气器27的控制操作(例如设定控制参数，比如真空水平)，并且可从其接收关于实际工作状况的信息(比如随时间供给的溶剂成分、流率、真空水平等)。数据处理单元70还可控制样品单元40的操作(例如控制样品注射或使泵20的操作状况与样品注射同步)。分离设备30还可由数据处理单元70控制(例如，选择特定的流路或柱，设定操作温度等)，并反过来将信息(例如操作状况)发送至数据处理单元70。因此，检测器50可由数据处理单元70控制(例如，相对于光谱或波长设定，设定时间常数、开始/停止数据获取)，并且将信息(例如关于所检测的样品化合物)发送至数据处理单元70。数据处理单元70还可控制级分单元60的操作(例如，与从检测器50接收的数据协作)，并提供数据备份。
[0085]如可从图1中进一步看出，检测器50包括两个不同的流动池202、204，它们仅在图1中示意性地示出，而在图2中得到更详细地描述。然而，已从图1中可看出，第一流动池202的长度大于检测器50的第二流动池204的长度。
[0086]下面参见图2，说明根据本发明示例性实施例的样品检测装置200。简言之，样品检测装置200涉及图1中参考标号50和70的组合。
[0087]如图2示意性所示，已在色谱柱(见图1中的参考标号30)中分离的流体样品经由管222中的孔流过导管250，到达第一流动池202的流体入口端口 252。第一流动池202限定管道腔254，流体样品在经由第一流动池202的流体出口界面256离开管222中的另一孔之前可流过该管道腔。因此，第一流动池202的流动路径的长度为D，如图2所示。
[0088]为了检测流体样品的一定级分，作为光源210的氘灯发射光，并且经由入口波导(比如光纤)258将该光耦合到管道腔254中。当流体在流体入口界面252与流体出口界面256之间流动时，流体样品与由光源210产生的光之间会发生相互作用。来自光源210的光与流体样品之间的这种相互作用可包括取决于波长的对光的部分吸收。相应产生的二次光(即，通过流体样品所传输的光和/或由流体样品所产生的光)经由出口波导260 (比如另一光纤)而被导向光栅218。光栅218在空间上根据光的波长分割二次光,并朝向光检测器214投射各种波长贡献。光检测器214包括线性阵列的检测元件，比如光电池。鉴于二次光(由图2中箭头及“ λ ”示意性地示出)的不同波长的空间分布，检测器214的每个检测器元件可检测不同的波长。
[0089]应该提及的是，图2所示的各光学构件可由其它构件代替(例如，棱镜作为光栅的替代物可用于分割波长)。而且，可设置其它光学部件，比如透镜、准直仪等。
[0090]经由连接导管262 (其应尽可能地短，并应具有尽可能小的内部体积)，已在第一流动池202内分析的流体样品通过第二流动池204的流体入口界面252而被引入。第二流动池204可以以类似的方式配置成第一流动池202。相应的参考符号用于第一流动池202及第二流动池204的相应部件。然而，第二流动池204的流体路径d的长度明显小于第一流动池202的流体路径D。另一光栅202和另一检测器216检测第二流动池204中的相应信号。
[0091]如仅为第二流动池204示意性地所示，流动池202、204都是全内反射(TIR)流动池。换言之，管222可由这样的材料制成，也就是使得在管222的外柱形表面发生全反射。因此，基本上所有电磁辐射可保持在管222内，从而进一步增加系统的精确性。管222可以是石英毛细管，具有至空气的外界面。流过第二流动池204的流动出口界面256的流体样品可被弓I导至废物容器(未示出)。
[0092]如可从图2中看出，检测信号强度可从检测器214、215被供给到数据确定单元206。数据确定单元206与数据组合单元208 —起可评估由检测器214、216所捕获的测量信号，以便得出测量结果，比如基于保留时间的对流体样品的级分的识别、对流体样品的级分的浓度的估计等。数据确定单元206和数据组合单元208可配置成单独的处理器，或可形成共同处理器的一部分。
[0093]输入/输出单元280可允许用户与数据确定单元206和数据组合单元208双向通信。例如，用户可以输入用于数据评估的指令，比如待应用的加权函数的参数。还可将来自数据确定单元206与数据组合单元208的评估结果经由输入/输出单元280报告给用户。
[0094]数据确定单元206配置成确定表示由第一流动池202的检测器214所检测的流体样品的吸光度与浓度之间的第一关系的第一数据。尽管检测器214以波长相关的方式检测随时间的吸光度，但是数据确定单元206可处理这种测量数据，以获得检测信号强度与流过第一流动池202的流体样品的浓度之间的相互关系。这种评估可基于Lambert Beer定律。类似地，数据确定单元206可确定表示由第二流动池204中的检测器216所检测的流体样品的吸光度与浓度之间的第二关系的第二数据。如下面特别参见图8详细地所述，一定的校正、补偿和重新调节操作可通过数据确实单元206进行，以使得可以直接比较来自检测器214、216的数据。应注意的是，数据确定单元206可以以波长相关的方式在多个波长同时被检测的配置中评估从检测器214、216中所获得的数据。
[0095]如由数据确定单元206所确定的第一和第二数据然后可被供给至数据组合单元208。数据组合单元208配置成根据预定的连续加权函数执行第一数据与第二数据的加权组合。因此，在数据组合单元208内通过以浓度相关的方式执行两个检测器214、216的结果的线性组合而确定流体样品的吸光度与浓度之间的加权关系。这是以这样的方式进行的，也就是加权关系随着增加的浓度不断降低第一数据以及由此第一流动池202的贡献，同时不断增加第二数据的贡献以及由此第二流动池204的影响。下面参见图3和图7，将会使这样的原因是看似有道理的。
[0096]换言之，数据组合单元208将第一数据片与第二数据片组合起来。因此，和第二流动池204相比其中第一流动池202具有更好精度的浓度范围可以与和第一流动池202相比其中第二流动池204具有更好精度的其它浓度范围组合，以扩展样品检测装置200可沿其操作的线性范围。其可使用其中具有长路径长度D的第一流动池202具有其强度的数据部分，并且其可使用其中具有短路径长度d的第二流动池204具有其强度的其它部分。例如，长度d可以是3、4mm,而长度D可以为60mm。流路202、204串联连接。而且,其可在两个流动池202、204均具有良好精度的过渡范围中将第一数据的一部分与第二数据的一部分组合。因此，其结果是，通过样品检测装置200获得大的线性范围，即，流体样品的浓度和吸光度之间的相关性在宽范围上是线性的。
[0097]图3示出了具有横坐标302的图300，沿该横坐标绘制了流体样品的浓度。沿纵坐标304，绘制了由检测器214或216测量的吸光度。图3示出了吸光度与浓度之间的理想的线性相关性。然而，在非常小的浓度值处，如参考标号306所示，信号上的噪声将会相当大，因为用于确定吸光度与浓度之间的线性关系的统计基础是尚不足够的。如由参考标号308示意性地所示，当发生饱和效应时，吸光度与浓度之间的相关性在非常高的浓度值处源自线性Lambert Beer行为。作为这种饱和效应的结果，测量的曲线会低于线性曲线。可以认为，这种饱和效应源于进入流动池202或204的作为寄生贡献的杂散光。在区域306与308之间，即在中间的线性范围310上，相应的流动池示出了适当的线性行为。
[0098]图4示出了表示与图300类似的特征的图400，然而具有纵坐标402，沿该纵坐标绘制了除以浓度的吸光度。因此，当吸光度除以浓度时，图3的线性行为被转换为理想的恒定行为。
[0099]图5示出了短流动池比如第二流动池204的与图400类似的图500。图6示出了与图400类似的图600，然而用于长流动池，比如第一流动池202。这示出了与图6相比，在图5中，线性范围310移动到较高值，然而具有一些重叠610。由于流体样品与光之间的相互作用时间在短流动池204中较短,所以与长流动池202相比,在短流动池204中，噪声范围306扩展到较高浓度值。由于与短流动池202相比，在长流动池204中，由光的强吸收所产生的饱和效应已发生在较低浓度值处，所以与图6相比，在图5中，线性范围310延伸至较高值。
[0100]图7在第一图710中和在第二图720中示出了与时间700相关的吸光度304。第一图710对应于长流动池202布置在短流动池204上游的布置，如图2所示。与之相比，图720对应于相反的配置，其中，长流动池202布置在短流动池204下游，即流体样品首先流过短流动池204，随后仅流过长流动池202。可以看出两种效果。首先，与图720相比，在图710中，由参考标号730示意性表示的保留时间之间的差别明显较小。其次，两条曲线的半峰全宽在图710中差不多相同，而在图720中显著不同。这产生于这样的事实，也就是与图710相比，在图720的情形下，由沿流动池流动的流体产生的延迟显著地更加明显。而且，与图710相比，在图720中，由扩散效应产生的峰加宽也更显著。鉴于图7，优选的是短池204布置在长池202下游，如图710和图2所示。
[0101]图8示意性地示出了由数据确定单元206所特定执行的若干任务，用于处理分别由第一流动池202和第二流动池204的检测器214、216直接检测的测量信号。
[0102]首先，如在图7中可以看出，示出吸光度和测量时间之间关系的从流动池202、204供给至数据确定单元206的测量信号可首先在加宽方面被校正。与上游流动池相比(见图710)，在下游流动池中对信号的稍微加宽可仅通过由无限脉冲响应滤波器800过滤来自长上游流动池202的信号而得到补偿。因此，根据彼此带来来自不同流动池的信号的半峰全宽值。或者，还可使短池204的峰值变窄，如由虚线所示的块850示意性地示出。然而，作为块850的替代，可以不对短池信号进行信号加宽控制。
[0103]而且，由于流动路径的不同长度，不同流动池202和204中的信号强度通常是不同的。为了至少部分地补偿这种差别，可以在归一化块802和804中将来自相应流动池202、204的信号归一化至一定值的路径长度。例如，它们可以被归一化为具有Icm流动长度的标准流动池。作为两个单独标准块802、804的替代，还可以省略块802、804中的一个，并将来自一个流动池(202或204)的信号归一化为另一流动池的长度(204或202)。
[0104]而且，基线校正块806、808可用在数据确定单元206中，以补偿隐藏的信号(其可近似为线性曲线y=ax+t)，并且其可能源于样品中的杂质等。
[0105]然后，如此形成的操纵信号可插入数据组合单元208中。
[0106]参见图9所示的图900，描述了在数据组合单元208中进行的加权。沿纵坐标902，第二流动池204的吸光度信号对数据组合单元208的输出信号的贡献由参考标号904表不，而第一流动池202的吸光度信号对数据组合单兀208的输出信号的贡献由参考标号906指出。换言之，数据组合单元208组合由数据确定单元206输出的第一数据和第二数据，以通过专门使用第一数据并不管低于下限阈值吸光度值thl的第二数据而得出加权关系。在上限阈值吸光度值th2以上，仅使用第二数据，不管第一数据。在thl和th2之间，以加权的方式使用两个数据，随着增加的吸光度(且因此浓度)值，数据906的重要性减小，数据904的重要性增加。从图9可看出，曲线904、906尤其在第一阈值thl和第二阈值th2处的过渡是平滑的，即示出了连续行为且以及在这些吸光度值处是可微的。这还允许获得对thl和th2附近的吸光度值没有假象的评估。然而，本发明的其它实施例可使用其它的加权方法。
[0107]作为示例，吸光度值可以是Atlt5 Atl可以是从流动池202和/或204中所获得的测量和处理的数据，例如平均值或参考值。在吸光度的该值Atl,图9的加权函数表示流动池202的信号的70%以及流动池204的信号的30%将会用于确定浓度。
[0108]应强调的是，加权函数(比如可从图9中得出的加权函数)取决于波长。因此，对于不同波长，上限阈值th2、下限阈值thl以及线性区域的宽度可以不同。因此，引入加权函数特别适合于多λ检测系统，因为在这种布置中线性行为是特别重要的。
[0109]下面参见图10至图23描述本发明的更详细的示例性实施例。[0110]根据本发明的示例性实施例，两个具有不同路径长度流动池的二极管阵列检测器串联地连接在液相色谱设备中。由分离柱所分离的样品的组分相继通过液压串联连接的流动池的两个流动池。一个检测器的池具有比另一检测器的池更长的路径长度。因此，具有长路径长度的检测器能够执行非常灵敏的测量，并还能够检测浓度中的非常小的变化。换言之，还可以测量样品中的非常小量的物质。另一方面，具有短路径长度的检测器还能够测量具有非常高浓度的样品(Lambert Beer定律)。
[0111]给定路径长度的检测器覆盖一定可用的吸收区域。对于给定的物质，该吸收区域给出了相应的浓度范围。下部吸收区域受基线上的噪声及可能的波动的限制，并因杂散光的影响而被限制至上部浓度。这种贡献，也表示为假光，由源自与所选择的波长叠加的测量波长的光谱贡献产生。这在吸收值的上部区域导致非线性行为，因为光的这些光谱贡献示出了源自测量波长的消光，即一定物质组分的吸收能力。
[0112]为了采用流动池的两个检测器覆盖足够大的浓度范围，本发明的示例性实施例使用具有大池(大路径长度)的检测器，以尽可能精确地覆盖下部吸收范围。这与第二检测器和短池(短路径长度)结合，以添加上部吸收范围。
[0113]对于为两个流动池选择适当的路径长度，认为重要的是，可用的浓度范围在相应限值的考虑之下重叠。在这些情形下，通过合适的计算规则将两个检测器的信号组合是合理的，以使得形成共同组合的信号。现在该信号在下部至中间浓度区域中具有带有大路径长度的信号属性。具有短路径长度的信号的属性用于上部浓度区域。如已提及，在中间(或中央)浓度区域中可能有重叠区域，其中可以使用两个检测器的信号。
[0114]根据本发明的示例性实施例，可以使用两种信号，并且适当的独特计算规则可用于以这种方式组合两种信号，也就是得到的信号显示这样的属性，即好像消除了在其上部浓度范围中具有大路径长度的检测器的限值以及具有短池的检测器的限值。结果，获得了可用的浓度范围，其通过两个检测器的路径长度比例而增加。
[0115]图10通过在图1000中以对数比例绘制吸光度特性示出这种状况。参考标号1010表示长路径上的理想和实际信号，而参考标号1020示出短路径上的理想和实际信号。
[0116]而且，图11示出了第一图1100和第二图1150，其中，第一图1100绘制组合两种信号的过渡范围。图1150示出过渡范围的放大视图。因此，图11再次绘制具有两个检测器的限值的扩展的线性范围。
[0117]根据本发明的示例性实施例，考虑用于信号组合的计算规则，串联联接的两个检测器对信号的影响可有利地被补偿。通过流动池的体积和所需的连接毛细管，流动池中的浓度相关性在时间上可不同，使得一个信号相对于另一个会出现延迟。而且，由于扩散效应，峰形状会受到影响。为了获得正确的结果，最好在计算组合的信号时考虑这种情形。
[0118]下面讨论考虑浓度分布的延迟。
[0119]与上游流动池相比，下游流动池的浓度相关性的延迟取决于流动池和连接毛细管的几何状况。其与流率(每时间间隔的流动流体体积)成反比。取决于流率的延迟因素可通过实验确定。可基于对当前流率的了解在上游检测器处执行对时间上发生较早的信号的补
\-ZX O
[0120]下面讨论扩散对峰形状的影响。
[0121]扩散对峰形状的影响以加宽峰的形式发生。可通过无限脉冲响应(IIR)滤波器操纵或处理上游检测器的信号来以适当的近似模拟这种加宽。
[0122]通过采取这种措施，可至少部分地补偿信号的暂时延迟，并以良好的近似加宽峰形状。
[0123]现在，有必要以适当的方式将两种信号组合成所产生的信号，其然后被供给至进一步的处理。在第一处理中，两个检测器的信号可被归一化为独特的路径长度(例如1cm)。然后，可使用加权函数相加两种信号。加权函数可指向相互重叠的范围，其中两个检测器在线性范围中操作。在该区域，除了系统特定偏差之外，两个检测器的归一化信号的值是相同的。
[0124]图12示出了图1200，其中，绘制了用于组合两个流路的信号的加权函数。沿横坐标1202,显示了标称吸光度,而沿纵坐标1204显示了表示加权函数的系数。
[0125]图13示出了加权函数的系数Cf_smooth(mA?，ξ , κ )以及用于信号组合的计算规贝U。κ是具有对图12所示曲线的陡度有影响的参数。ξ是具有对其中两个流动池的贡献相同的50%点的位置有影响的参数。mA?代表标称吸光度。加权函数的系数的值介于O和I之间。
[0126]这导致用于两个预处理信号的组合(Combine)的计算规则(函数f)。这也可从图13中看出。A代表对应于信号sig的吸光度，L代表相应的路径长度。Thres代表相应阈值，Ig为长，sh为短，模式用于相应的参数。
[0127]这意味着具有长路径长度的检测器的信号在下部浓度值范围中占主导地位，而在浓度值的上部范围中，专门使用具有较短路径长度的检测器的信号。在中间范围中，加权函数提供连续或平滑过渡。
[0128]图14示出了进一步 详细示出该情形的图1400。图14绘制短路径的信号、长路径的信号以及组合信号。
[0129]下面描述加权函数的处理。
[0130]加权函数的所示系数Coef=f (吸光度/cm)涉及归一化的吸光度轴[mAU/cm]。在简单的情况下，该轴基础可评估成使得高达一定的阈值，使用长池的归一化信号，并且使用从所选择的阈值向前的短池的归一化信号。阈值在此称为长池的归一化信号，并以这样的方式选择，也就是长池在线性区域中操作。
[0131]然而，使用这种方法可能会导致在形成组合信号期间的突然过渡，所以吸收轴的基础可显示间隙，或者轴部分可能重叠。这种效果可由从相应信号偏移或漂移形式的附加误差项引起。
[0132]鉴于这些考虑，用于形成吸光度轴基础的显著改进的方法是在两个选定的阈值内的连续过渡。根据本发明示例性实施例的此方法对应于加权函数的第一近似。换言之，轴基础由来自具有长池的检测器的信号的100%贡献形成于第一阈值之下，并且由具有短路径长度的检测器的信号的100%贡献形成于该阈值之上。在这些阈值之间，轴基础由两个归一化信号的加权相加形成，其中，用于具有长路径长度的信号的加权从I至O运行线性，并且以相反的方式，用于具有短路径长度的信号的加权从O至I。
[0133]图15中示意性地表示了相应的计算规则。相应的加权函数的系数示出在图16所示的图1600中。由于这样的轴基础，具有所提出的加权函数的实际加权然后根据图17所示的图1700进行。[0134]这样的附加过程是有利的，因为提供此可以实现长池的归一化信号连续过渡至短池的归一化信号。通过参数ξ和κ，加权函数可以适应用户的参数选择。参数ξ限定过渡的位置，参数κ限定过渡的斜率。例如，合理的值是ξ=0.2，κ =2。更一般地，ξ的合理范围是0.05至0.5，特别是0.1至0.3。κ的合理范围是I至5，特别是1.5至3。
[0135]通过采取这些措施，在突出灵敏度的线性范围的同时扩展是可能的。突出灵敏度允许低级别的杂质检测，基线噪声可以< I μ AU/cm。该线性范围可以得到扩展。可用的线性范围可以大于6个数量级。吸光度可高达8AU/cm。60mm流动池的所有应用可以得到匹配。将不会有额外的峰扩散。
[0136]图18示出了其中示出的峰具有其吸光度-时间特性的图1800。图18示出了短路
径信号、长路径信号和组合信号。
[0137]为了进一步细化数据的评估，可以在考虑基线偏移和/或漂移的影响下进行加权。
[0138]因此，用于计算组合信号的进一步考虑是，在不希望的情况下，可能发生两个检测器的基线的信号彼此漂移远离。这可能源于折射率的变化的影响或其他物理或化学参数的其他影响因素的影响。在这种情况下，两个检测器的归一化信号的值可以彼此偏离至相应的程度。由于测量值在这种情况下通过不与路径长度成比例而重叠，所以这可能导致在归一化信号的加权相加中的假象。
[0139]图19使这一问题变得清晰。在没有偏离基线序列的相应补偿的情况下，计算可能会导致错误的信号。图1900示出了短路径与长路径的情形，而图1950示出了组合信号的情况。
[0140]在考虑这些事实的情况下，这意味着为了高精度地计算组合的信号，有利的是将基线纠正峰的加权部添加至具有长路径长度的检测器的信号的基线Blg (t)。为此，需要知道峰的开始tbegin和峰的结束tmd。图20示出了相应的计算规则。在这里，B表示基线信号。
[0141]在下文中，将要论述与吸收光谱的计算有关的进一步的问题。
[0142]对于在峰宽上计算光谱应该有重点。在宽浓度范围上计算与线性有关的光谱的要求是具有挑战性的。
[0143]通过在浓度范围上比较光谱来监测或验证的峰的纯度要求不仅在所选择的测量波长的信号的宽度上而且在相应物质的所观察到的光谱范围上的线性行为。
[0144]在其中峰的浓度范围覆盖完整的线性吸收范围的情况下，非线性特性可能会发生在其中物质的消光系数比在测量波长更高的光谱区域中。就光谱范围的定义来说，选择测量波长可以基于其他标准。测量波长可以选择成在吸收谱带的顶点内，以考虑到高消光系数而获得高精度，并且在另一侧对光谱偏差的影响不敏感。
[0145]为了可靠地识别物质，可能需要有足够的广谱，因为这可以获得显著的特征。为了在考虑相关性的情况下监测物质的纯度，采用类似的考虑。在许多情况下，可以使用的光谱范围可以受到高消光系数区域中非线性特性的限制。
[0146]图21示出了具有波长沿着其绘制的横轴2102并具有吸光度沿着其绘制的纵轴2104的图2100。图2100示出了在峰行为上的光谱。相应的图2150具有沿着其绘制的归一化吸光度的纵坐标2152，从而图2150示出了在峰上的归一化光谱。
[0147]通过应用上述方法，所讨论的限制可能受到相当程度的限制和/或抑制。这允许获得待研究的样品的分析与定量的可靠的结果。
[0148]图22示出了通过使用所讨论的方法而得到的图2200 (对应于图2100)和图2250(对应于图2150)。
[0149]从归一化的光谱中可以得出，光谱在峰的整个范围上是相同的。
[0150]图23中示出的是用于计算在时间及波长轴上的结果矩阵的计算规则。
[0151]应当指出的是，术语“包括”不排除其它元件或特征，“一”、“一个”不排除多个。此夕卜，结合不同实施例所描述的元件可以组合。还应当指出的是，在权利要求中的附图标记不应理解为限制权利要求的范围。
【权利要求】
1.样品检测装置(200)，用于检测流过第一流动池(202)和流过样品分离系统(10)的第二流动池(204)的流体样品，其中，所述第一流动池(202)具有第一路径长度(D)，所述第二流动池(204)具有小于第一路径长度(D)的第二路径长度(d)，所述样品检测装置(200)包括 数据确定单元(206)，其配置成用于确定表示第一流动池(202)中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第一关系的第一数据，并且配置成用于确定表示第二流动池(204)中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第二关系的第二数据； 数据组合单元(208)，其配置成用于根据连续的加权函数组合所述第一数据与第二数据，从而得出检测信号强度与流体样品的浓度之间的加权关系，以使得所述加权关系随着增加的浓度不断降低所述第一数据的贡献且不断增加所述第二数据的贡献。
2.根据权利要求1所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据组合单元(208)配置成用于根据连续的微分加权函数组合所述第一数据与第二数据。
3.根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据组合单元(208)配置成用于组合所述第一数据与第二数据，以通过这样得出所述加权关系: 专门使用第一数据，不考虑比所述检测信号强度特别是吸光度的下限阈值低的第二数据， 专门使用第二数据，不考虑比大于所述检测信号强度特别是吸光度的下限阈值的上限阈值高的第一数据， 根据所述下限阈值与上限阈值之间的加权函数使用第一数据与第二数据， 从而使加权关系是连续的，特别是示出在下限阈值与上限阈值的平滑过渡。
4.根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于基于从第一流动池(202)所接收的第一测量信号来确定所述第一数据，并且配置成用于基于从第二流动池(204)所接收的第二测量信号来确定所述第二数据，相应的测量信号表示相应的流动池(202、204)中检测信号强度与测量时间之间的关系。
5.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于基于响应于因主电磁辐射的流体样品的照射从流体样品所测量的二次电磁辐射的评估来确定相应的数据，所测量的二次电磁辐射构成从相应的流动池(202、204)所接收的测量信号。
6.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于单独地为所述二次电磁辐射的不同测量波长而确定相应的数据。
7.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据组合单元(208)配置成用于根据不同于所述二次电磁辐射的不同测量波长的波长相关的加权函数来组合所述第一数据与第二数据。
8.根据权利要求4或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于选择性地添加延迟至第一流动池(202)的测量信号，或者配置成用于选择性地从第二流动池(204)的测量信号中减去延迟，以便与第一流动池(202)相比，至少部分地补偿第二流动池(204)中的测量信号延迟。
9.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于根据流体样品的流率来添加或减去选择性的延迟。
10.根据权利要求4或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于选择性地扩大第一流动池(202)的测量信号，或者配置成用于选择性地缩小第二流动池(204)的测量信号，以便与第一流动池(202)相比，至少部分地补偿第二流动池(204)中的测量信号扩大。
11.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)包括滤波器(800)，特别是无限脉冲响应滤波器，用于进行选择性的扩大。
12.根据权利要求4或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于缩放相对于彼此的第一流动池(202)及第二流动池(204)的测量信号，以便至少部分地补偿在第一流动池(202)中及在第二流动池(204)中的不同路径长度(D、d)。
13.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于通过归一化(802、804)测量信号至预定义的归一化的路径长度来缩放相对于彼此的第一流动池(202)及第二流动池(204)的测量信号。
14.根据权利要求4或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于进行基线校正(806、808)，以便至少部分地除去隐藏在第一流动池(202)及第二流动池(204)的测量信号中的信号。
15.根据前述权利要求所述的样品检测装置(200)，其中，所述数据确定单元(206)配置成用于通过分别确定相应的函数特别是线性函数以便模拟对于相应的测量信号来说隐藏的信号并且通过从相应的测量信号中减去相应的函数来进行所述第一及第二流动池(202,204)的测量信号的基线校正(806、808)。
16.根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述检测信号强度表示通过流体样品的在相应路径长度(D、d)上沿着相应流动池(202、204)传播的电磁辐射的吸收。
17.根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，还配置成用于检测流过具有不同于所述第一路径长度(D)与第二路径长度(d)的第三路径长度的第三流动池的流体样品， 其中，所述数据确定单元(206)配置成用于确定表示所述第三流动池中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第三关系的第三数据； 其中，所述数据组合单元(208)配置成用于根据所述连续的加权函数组合所述第一数据、第二数据和第三数据。
18.根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其中，所述加权函数具有用于第一流动池(202)的贡献exp (-A/ ξ ) κ，并且具有用于第二流动池(204)的贡献1-exp (-A/ξ)κ，其中，A是标称的吸光度，ξ定义了第一流动池(202)的贡献等于第二流动池(204)的贡献的吸光度值，κ是定义了加权函数斜率的参数。
19.样品分离系统(10)，用于分离流体样品的组分，所述样品分离系统(10)包括 分离单元(30)，其配置成用于将流体样品分离成组分； 第一流动池(202)，其与分离单元(30)流体连通，用于接收来自分离单元(30)的所分离的样品流体，其中，所述第一流动池(202)具有第一路径长度(D)； 第二流动池(204)，其与分离单元(30)流体连通，用于接收来自分离单元(30)的所分离的样品流体，其中，所述第二流动池(204)具有小于第一路径长度(D)的第二路径长度Cd)； 根据权利要求1或上述权利要求中任一项所述的样品检测装置(200)，其配置成用于检测所分离的组分。
20.根据前述权利要求所述的样品分离系统(10)，其中，所述第二流动池(204)布置在第一流动池(202)的下游并且与之流体连通，用于接收来自第一流动池(202)的所分离的样品流体。
21.根据权利要求19或上述权利要求中任一项所述的样品分离系统(10)，其中，所述第一路径长度(D)大于15毫米，第二路径长度(d)小于8毫米。
22.根据权利要求19或上述权利要求中任一项所述的样品分离系统(10)，其中，所述第一路径长度(D)在10毫米与100毫米之间的范围内，特别是在30毫米与80毫米之间的范围内。
23.根据权利要求19或上述权利要求中任一项所述的样品分离系统(10)，其中，所述第二路径长度(d)在I毫米与9毫米之间的范围内，特别是在2毫米与5毫米之间的范围内。
24.根据权利要求19或上述权利要求中任一项所述的样品分离系统(10)，包括以下特征中的至少一个: 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(202、204)的相应的电磁福射源(210、212)，所述相应的电磁辐射源(210、212)配置成用于产生主电磁辐射，以便照射在相应流动池(202、204)中的流体样品； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射源(210、.212)，所述相应的电磁辐射源(210、212)配置成用于产生作为主电磁辐射的光学光束与紫外光束之一，以便照射在相应流动池(202、204)中的流体样品； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射源(210、.212)，所述相应的电磁辐射源(210、212)配置成用于产生多色主电磁辐射，以便照射在相应流动池(202、204)中的流体样品； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射源(210、.212)，所述相应的电磁辐射源(210、212)配置成用于产生主电磁辐射，以便照射在相应流动池(202、204)中的流体样品，并且配置成包括氘灯、氙灯和钨灯的组中的一个； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射检测器(214、216),其中，所述相应的电磁福射检测器(214、216)包括光学光检测器与紫外福射检测器中的一个； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射检测器(214、216)，其中，所述相应的电磁辐射检测器(214、216)包括单个检测元件、线性阵列检测元件及二维阵列检测元件中的一个； 样品分离系统(10)包括用于每个第一与第二流动池(204)的相应的电磁辐射检测器(214、216)，其中，所述相应的电磁辐射检测器包括电磁辐射敏感单元和在流体样品的流路与所述电磁辐射敏感单元之间的光栅(218、220)； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置为全内反射流动池； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置为全内反射流动池，其中，流体样品沿着其在相应流动池(202、204)中流动的管(222)和照射在相应流动池(202、204)中流动的流体样品的电磁辐射源(210、212)布置且配置成用于实现在管(222)外壁的电磁辐射的全反射； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置成采用高压引导流体样品； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置成采用至少50bar、特别是至少lOObar、更特别地至少500bar、还更特别地至少1000bar的压力引导流体样品； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置为引导液体样品； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置为微流体流动池； 第一流动池(202)与第二流动池(204)中的每个配置为毫微流体流动池； 样品分离系统(10)包括流体驱动装置(20)，特别是泵送系统，配置成驱动流体样品通过样品分离系统(10); 分尚单兀(30)包括色谱柱； 样品分离系统(10)包括配置成将流体样品流体引入到流动相中的样品注射器(40)； 样品分离系统(10)包括配置成收集流体样品的所分离的化合物的收集单元(60)； 样品分离系统(10)包括用于将流动相或流体样品除气的除气装置(27); 分离单元(30)配置成用于保留作为流动相的一部分的流体样品，并且用于允许流动相的其他组分通过分离单元(30)； 分离单元(30)的至少一部分填充有分离材料； 分离单元(30)的至少一部分填充有分离材料，其中，所述分离材料包括尺寸在I μπι至50 μ m范围内的小球； 分离单元(30)的至少一部分填充有分离材料，其中，所述分离材料包括具有尺寸在0.02 μ m至0.03 μ m范围内的孔的小球； 样品分离系统(10)配置成分析流体样品的至少一种化合物的至少一个物理、化学和/或生物参数； 样品分离系统(10)包括由用于化学、生物和/或医药分析的设备、毛细管电泳设备、液相色谱设备以及HPLC设备构成的组中的至少一个。
25.—种检测流过第一流动池(202)和流过样品分离系统(10)的第二流动池(204)的流体样品的方法，其中，所述第一流动池(202)具有第一路径长度(D)，所述第二流动池(204)具有小于第一路径长度(D)的第二路径长度(d)，所述方法包括 确定表不第一流动池(202)中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第一关系的第一数据； 确定表示第二流动池(204)中检测信号强度与流体样品的浓度之间的第二关系的第二数据； 根据连续的加权函数组合所述第一数据与第二数据，从而得出检测信号强度与流体样品的浓度之间的加权关系，以使得所述加权关系随着增加的浓度不断降低所述第一数据的贡献且不断增加所述第二数据的贡献。
26.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述加权函数是在考虑这样的边界条件下被选择的，也就是大于预定阈值的基于噪声的假象仅以比第二流动池(204)中更低的浓度出现在第一流动池(202)中。
27.根据权利要求25或上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述加权函数是在考虑这样的边界条件下被选择的，也就是产生于杂散辐射且大于预定阈值的基于饱和度的假象已以比第二流动池(204)中更低的浓度出现在第一流动池(202)中。
28.根据权利要求25或上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一路径长度(D)与第二路径长度(d)被选择成使得其上第一流动池(202)示出检测信号强度与流体样品的浓度之间的线性关系的流体样品的浓度值的范围与其上第二流动池(204)示出检测信号强度与流体样品的浓度之间的线性关系的流体样品的浓度值的另一范围重叠。
29.一种软件程序或产品，优选地存储在数据载体上，用于当在数据处理系统(206、208)比如计算机上 运行时控制或执行根据权利要求25或上述权利要求中任一项所述的方法。
【文档编号】G01N30/78GK103582813SQ201180071303
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2011年5月31日 优先权日:2011年5月31日
【发明者】H.库德雷尔 申请人:安捷伦科技有限公司