专利名称：一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液的制作方法
技术领域：
本发明涉及饲料营养价值评价技术领域，尤其涉及的是一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液。
背景技术：
粗饲料的采食量和消化率会极大影响反刍动物的生产性能，但通过体内法测定费时费力、价格昂贵，需要大量的饲料样品而且不能大量测定。所以，科学家一直在尝试通过实验室方法来测定粗饲料采食量和消化率。20世纪50年代以来建立的体外法，包括英国学者Ti I Iy-Terry (1963)建立的两阶段法、Raab等(1983)和德国荷恩海姆大学动物营养研究所Menke (1979)等发展的产气法 (The gas production method)、真菌纤维素酶法和尼龙袋法。体外产气法(Invitro gas production)是Raab L.等(1983)和德国荷恩海姆大学动物营养研究所Menke K. H.等人建立的，评定反刍动物饲料营养价值的一种非常有效的方法，是目前发达国家采用最多的用来评价反刍动物饲草饲料饲用价值的技术之一。体外产气法一次可进行大量样本的测定，与体内法相比，不需要大量的实验动物，并且结果与体内法具有高度相关性。体外产气法不仅可以通过体外产气量较真实地模拟牧草在瘤胃内的有机物质消化率、估计饲料的可降解蛋白量和单种饲料或混合饲料的代谢能值，而且还可以在添加与否聚乙醇的基础上掌握某种饲草是否含有单宁及其抗营养程度。目前体外产气法用的是碳酸缓冲液，这种缓冲液在使用过程中存在着一定的缺陷，从而影响到测定结果的准确性。目前体外产气法使用碳酸缓冲液组成为35gNaHC03+4. Og NH4CO3+蒸馏水配制成 IOOOrnl溶液，碳酸缓冲液pH值为7. 86，所述磷酸缓冲液使用前需要通入3次C02，每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次I小时，最后一次在使用前通入，以提高新磷酸缓冲液的 CO2保有量，然后进行使用。体外产气法中饲料发酵主要产生的气体为C02、CH4等。当利用碳酸盐缓冲液培养饲料时，产生的气体中有一部分CO2则是来源于碳酸缓冲液，并非饲料发酵产生，这样严重影响了测定的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液。本发明的技术方案如下一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液组成为94. 2g Na2HPO4,
5.2gNaH2P04 -H2OU. 4g NH4Cl,用蒸馏水将其配制成1000ml溶液，磷酸缓冲液pH值为7. 82， 所述磷酸缓冲液使用前需要通入3次C02，每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次I小时，最后一次在使用前通入，以提高新磷酸缓冲液的CO2保有量，然后使用。
本发明磷酸缓冲液避免了碳酸缓冲液本身产气的缺陷；通过增加通入CO2的次数用以增加其保有量，降低了饲料发酵的延迟时间，和碳酸缓冲液的延迟时间一致，新的磷酸缓冲液配方及其制备方法可用于体外产气法的研究和应用。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I本发明为一种磷酸缓冲液，一方面减少了缓冲液本身产出气体对测定结果准确性带来的不利影响，另一方面保证缓冲液具有良好的缓冲效果，对饲料体外发酵无负面影响。本发明的磷酸缓冲液组成为94.2g Na2HPO4,5. 2g NaH2PO4 · H2O, I. 4g NH4Cl,用蒸馏水将其配制成IOOOml溶液，磷酸缓冲液pH值为7. 82。本发明磷酸缓冲液使用前需要通入3次CO2,每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次I小时，最后一次在使用前处理，以提高新磷酸缓冲液的CO2保有量，然后进行使用。实施例2使用方法I、配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后计算人工唾液需要量体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30-100ml (10-30ml瘤胃液和20_70ml人工唾液)，依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量(预留20%，以备操作手法不当造成浪费)配制缓冲液；④配制还原剂溶液(E液)；⑤按顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体(气流不易过大)，使人工唾液由蓝色转变为粉红色蓝色转变为粉红色，最终为无色。人工唾液配方(1000ml) IOOOml人工唾液含有蒸馏水520. 2ml，微量元素溶液 (A液)0. lml，磷酸缓冲液(B液)208. 1ml，常量元素溶液(C液)208. Iml, O. I %刃天青溶液 (D液)I. Oml，还原剂溶液(E液)62. 4ml。A液、微量元素溶液13. 2g CaCl2 · 2H20 ；10. Og MnCl2 · 4H20 ；CoCl2 · I. Og 6H20 ；8. Og FeCl3 · 6H20，加蒸馏水至100ml ；B液、磷酸缓冲液94. 2g Na2HPO4,5. 2g NaH2PO4 ·Η20、1· 4g NH4Cl,加蒸馏水至 1000ml，磷酸缓冲液pH 值为7. 82。磷酸缓冲液使用前需要通入3次CO2，每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次I小时，最后一次在使用前处理，以提高新磷酸缓冲液的CO2保有量，然后进行使用。C液、常量元素溶液9. 45g Na2HPO4 · 12H20 ；6. 2g KH2PO4 ；0. 6g MgSO4 · 7H20，加蒸馏水至 1000ml ；D液、0. I %刃天青溶液IOOmg刃天青溶解于IOOml蒸馏水；E液、还原剂溶液(现用现配):IM NaOH 4. Oml ；625mg Na2S · 9H20，加蒸馏水 95ml。
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2.取瘤胃液瘤胃液在早饲前Ih或早饲后2h取回。①将热水倒入水桶，调节水温度至 39±0.5°C，用于瘤胃液保温(应经常用热水调节)用真空泵抽取三头反刍动物的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤(应尽量快，以保持微生物的活力)，获得的滤液用CO2气体饱和。3、称发酵底物①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200-1000mg， 置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。4、配制微生物培养液用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液按2 : I 4 : I的体积比例混合， 不间断地通入CO2气体。5、发酵用空的产气管吸取微生物培养液30 100ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管，对样品进行发酵，并收集发酵产生气体进行分析。实施例3如表I所示，本发明磷酸缓冲液在与碳酸缓冲液在使用前通入I次CO2，通气时间 I小时的情况下，磷酸缓冲液的最终pH、甲烷生成率与碳酸缓冲液差异不显著。但是饲料发酵反应延迟时间显著增长，从而延长了整个饲料发酵反应的时间，降低了体外发酵的效率， 对饲料体外发酵产生负面影响。表I.磷酸缓冲液和碳酸缓冲液对体外产气特性的影响(通I次CO2气体)1N = 4 ;*P < O. 05 ；NS P > O. 0权利要求
1.一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液，其特征在于，磷酸缓冲液组成为94. 2g Na2HPO4,5. 2g NaH2PO4 · H2OU. 4g NH4Cl,用蒸馏水将其配制成IOOOml溶液，磷酸缓冲液pH 值为7. 82，所述磷酸缓冲液使用前需要通入3次CO2,每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次I小时，最后一次在使用如通入，以提1 新憐酸缓冲液的CO2保有量，然后使用。
全文摘要
本发明公开了一种用于体外瘤胃产气法的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液组成为94.2gNa2HPO4、5.2g NaH2PO4·H2O、1.4g NH4Cl，用蒸馏水将其配制成1000ml溶液，磷酸缓冲液pH值为7.82，所述磷酸缓冲液使用前需要通入3次CO2，每次均使溶液由粉红色变为无色为止，每次1小时，最后一次在使用前通入，以提高新磷酸缓冲液的CO2保有量，然后使用。本发明磷酸缓冲液避免了碳酸缓冲液本身产气的缺陷；通过增加通入CO2的次数用以增加其保有量，降低了饲料发酵的延迟时间，和碳酸缓冲液的延迟时间一致，新的磷酸缓冲液配方及其制备方法可用于体外产气法的研究和应用。
文档编号G01N33/00GK102590453SQ201210035989
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者徐 明 申请人:徐 明