专利名称：一种从鸡蛋中同时提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法
技术领域：
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)及代谢物氟苯尼考胺(FFA)同时提取、净化的方法。
背景技术：
在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检测，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。氯霉素类药物主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等，以其广谱、高效等特点，被广泛应用于人医与兽医。然而由于其不同的毒性作用在世界范围内被广泛监测。目前国内外关于氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有许多报道，提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。然而国内外对鸡蛋中该四种药物同时提取的方法未见报道。本试验采用乙酸乙酯乙腈氨水(49 49 2，V/V)作为提取剂，饱和正己烷去脂和净化，提取效率较高。
发明内容
为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的问题，本发明提供了一种同时提取、净化这几种药物的方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。本发明所采用的技术方案是一种同时从鸡蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法，该方法具体是将鸡蛋制成匀浆后，加入氘代氯霉素d5-CAP内标溶液，然后加入浓度为30%的乙腈溶液混勻，再用体积比49 49 2的乙酸乙酯乙腈氨水提取，再经饱和正己烷脱脂，提取液重复提取一次，最后用氮吹仪吹干。上机前残渣用l.OmL 10%乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；12100Xg离心15分钟，上清液经0. 22 ii m滤膜过滤，滤液供高效液相串联质谱仪(HPLC-MS/MS)测定。采用本发明方法能将鸡蛋中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，且经净化、浓缩步骤得到的浓缩液可以供HPLC-MS/MS检测用。本发明比较了不同提取剂、提取剂不同体积比对回收率的影响，最终选择碱性乙酸乙酯作为提取剂，且碱性乙酸乙酯(乙酸乙酯乙腈氨水)体积比为49 : 49 : 2。因为FFA是弱碱性药物，在pH较高的环境下有较高的溶解性。碱性乙酸乙酯可有效提取四种药物，回收率也较高，且不影响其它三种药物的提取。乙腈可有效去除部分蛋白质，减少内源性杂质，有利于样品净化，在此体积比下，CAP,TAP,FF和FFA的平均回收率能达90. 84%以上。本发明采用正己烷(用纯乙腈饱和)去脂，净化效果良好。最终筛选出了鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺残留的最佳前处理方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在90. 84%以上，日内和日间相对标准偏差(RSD)均分别低于5. 10%和11. 30%，达到或超出欧盟残留测定要求。具体实施例方式本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。I、实验鸡的饲养、给药和样品采集随机选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡25只，体重I. 78±0. 22kg，作为空白对照组，单笼饲养。试验前预饲I周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料(自制于江苏京海禽业集团有限公司饲料厂)，自由饮水。连续5d饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料,于每天17:30 18:00收集鸡蛋，鸡蛋样品保存在低温蛋库中。2、本发明提取、萃取、及净化步骤 (I)用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；(2)准确称取5. Og鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中，加入d5_CAP内标溶液IOOu L ；(3)加入lmL30%乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；(4)加入IOmL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49 : 49 : 2，V/V)，漩涡振荡混匀lmin,再用超声波振荡萃取15min ；(5)8000Xg离心IOmin,上清液转移至20mL玻璃管中；(6)重复步骤4-5提取I次，合并上清液；(7)在50°C氮吹仪上吹至I 2mL ;(8)加入I. OmL纯乙腈溶解,润旋振荡混勻Imin ；(9)加IOmL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，下层提取液重复去脂I次；(10)在50°C氮吹仪吹干；冷冻保存；上机前用I. OmL 10%乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；12100 X g离心15分钟，上清液经0. 22 ii m滤膜过滤，滤液供HPLC-MS/MS测定。3、回收率的测定准确称取5. Og匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液各IOOmL,对应的在空白鸡蛋样品中添加浓度分别为CAP :0. 1,0. 3,0. 6、
3.0 u g kg 1 ；TAP :1. O、25. O、50. O、75. 0 u g kg 1 ；FF :0. 3、50. 0、100. 0、150. 0 u g kg 1 ；FFA 1. 5,50. 0、100. 0,150. Ou g kg'加入 d5-CAP 内标溶液(250 u g L-1) IOOy L，每个浓度水平设置6个平行，漩涡振荡混匀，经上述样品提取与净化后，取IOy L进样进行检测。质谱条件如下，离子源电喷雾离子源(ESI);扫描方式正离子扫描(FFA)和负离子扫描(CAP、TAP、FF和d5-CAP):检测方式多反应监测(MRM);电喷雾毛细管电压4000V(正离子扫描)、3500V(负离子扫描);干燥气温度30(TC ;干燥气流速10L mirT1 ；雾化器气体压力15psi ;鞘气温度250°C;鞘气流速JL^mirT1 ;二级碰撞气氮气。根据各分析物定量离子(CAP m/z 321. 2/152. 0 ；TAP m/z 354. 1/185. 0 ；FF m/z 356. 1/185. I ；FFA m/z 248. 1/130. I)与同位素内标离子(d5_CAP m/z 326. 1/157. I)的峰面积比值计算添加回收率。在此条件下，本发明方法提取鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺的添加回收率及相对标准偏差的结果见表I。
表I鸡蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率(n = 6)
分析物添加值(胆Ig4)回收率(％) 相对标准偏差(%)
Ol95.68±5.786M
0.3a94.85±6.917.28 PAP
I0.6103.14 士4.554.41
3.0106.63士3.062.87 LO91.26 士8.379J7
25.098.84士8.909.00TAP I
50.0b103.15 士8.738.4675.0108.23士6.756.24
0399.62士 5.85187
50.092.12士3.894.22FF 100.0b 103.75士5.74 5.53
150.0107.84士5.875.44 L5 90.84士8.35 9J9
50.093.14士8.959.61FFA I
100 .Ob102.35±9.349.13
150.093.65±7.678.19注a.最低要求执行限量；b.最高残留限量4、精密度的测定日内精密度测定将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成4份，得至IJ量较多的4种药物浓度的样品。在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台HPLC-MS/MS 6次重复测定4种药物浓度的样品，求得日内(批内)精密度。日间精密度测定将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成4份，得至IJ量较多的4种药物浓度的样品。在一周内不同日以不同的标准曲线及同一台HPLC-MS/MS6次重复测定4种药物浓度的样品，求得日间(批间)精密度。结果如下表2鸡蛋中CAP、TAP、FF和FFA的精密度(n = 6)
权利要求
1.一种同时从鸡蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法，是将鸡蛋制成匀浆后，加入氘代氯霉素内标溶液，然后加入30%乙腈溶液混匀，再用体积比49 49 2的乙酸乙酯乙腈氨水提取，提取液再经饱和正己烷脱脂，提取液重复提取一次，最后用氮吹仪吹干。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤如下 ①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆； ②准确称取5.Og鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中，加入250ug* L^d5-CAP内标溶液100 u L ； ③加入lmL30%乙腈溶液置漩涡混合器上混匀； ④加入IOmL体积比为49: 49 : 2的乙酸乙酯-乙腈-氨水；漩涡振荡混匀lmin，再用超声波振荡萃取15min ； ⑤8000Xg离心lOmin，上清液转移至20mL玻璃管中； ⑥重复步骤4-5提取I次，合并上清液； ⑦在50°C氮吹仪上吹至I 2mL; ⑧加入I.OmL纯乙腈溶解,润旋振荡混勻Imin ； ⑨加IOmL纯乙腈饱和饱和正己烷脱脂，弃去上层正己烷，下层提取液重复去脂I次； ⑩在50°C氮吹仪吹干；冷冻保存。
全文摘要
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)及代谢物氟苯尼考胺(FFA)同时提取、净化的方法。该方法是将鸡蛋制成匀浆后，加入氘代氯霉素内标溶液，然后加入30％乙腈溶液混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯∶乙腈∶氨水提取，提取液再经饱和正己烷脱脂，提取液重复提取一次，最后用氮吹仪吹干。本发明方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在90.84％以上，日内和日间相对标准偏差(RSD)均分别低于5.10％和11.30％，达到或超出欧盟残留测定要求。
文档编号G01N30/06GK102645499SQ20121005562
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者孙瑛瑛, 张小杰, 张跟喜, 戴国俊, 王金玉, 谢恺舟, 谢星, 贾龙飞, 陈国宏, 陈学森 申请人:扬州大学