专利名称：用于非侵入性三维探测的灵活的非线性激光扫描显微镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于灵活的非侵入性三维探测的非线性激光扫描显微镜，尤其是在生命物质中(在活体中)，优选在动物的皮肤中、在植物中和在细胞培养中，以及在无生命的物质中，例如矿物质、纺织物和艺术品。下面应该始终将非线性激光扫描显微镜或者说具有多光子(MP)激发的显微镜理解为具有双光子激发或多光子激发的显微镜。
背景技术：
公知双光子显微镜和多光子断层照相机(MPT)，在使用它们时，荧光信号和SHG信号(Second Harmonic Generation, 二次谐波生成)在活体的生物分子中由近红外区域的脉冲激光辐射激发并且由合适的高灵敏性的和快速的接收器探测(例如US 5034613A、DE20117294U1 ；DE 20306122U1)。此外，非荧光的和非SHG活性的组成部分如水和脂质能够借助 CARS显微镜和 CARS 断层照相机(CARS Coherent Ant1-Stokes Raman Scattering,相干反斯托克斯-拉曼散射)示出(参见例如未在先公开的DE 102010047578A1)。利用这些非线性的光学显微镜和断层照相机在三维上达到几百微米的亚微米范围和扫描区域(对象区域)内的水平分辨率。这样的非线性显微镜和断层照相机以使用固定的构建和抑制震动的光学的工作台设施为基础。它们能够作为直立的或倒转的光学显微镜设施运行。但是没有公知如下用于非线性显微镜检查或断层照相检查的高分辨率成像系统(具有I微米或小于I微米的横向分辨率)，所述成像系统在所需要的亚微米范围内的横向和轴向分辨率的情况中允许测量头的自由定位。为此所必需的光束传输能够通过光纤维系统或者作为自由光束传输系统来实现。自由光束激光传输系统的精确度，如其例如以镜活节臂的形式公知的那样，由在这些臂的机械式笼状结构内部的机械偏差、机械应力和温度漂移影响。对镜活节臂的机械轴的影响(例如通过温度漂移)在活节臂的不同的形态中导致激光光束在活节臂的输出端的位置相对于目标位置的或者说机械轴的偏差，从而借助高分辨率的聚焦光学装置在不同的测量头校准的情况下仅限制地使测量对象的可靠扫描成为可能。激光光束在光学活节臂的输出端上的位置的波动能够用概念“传输系统的精确度”来概括。此外，激光光束传输的精确度受活节臂的光学的光束路线的给出长度和激光的光束指向稳定性(英语pointing stability)影响。在此，应该将激光辐射在激光的直接输出端上的方向稳定性的变化称为指向稳定性，这种变化由激光的谐振器配置的热造成的影响得出。激光辐射耦入到镜活节臂中是特别关键的。当激光辐射的光轴与活节臂的机械轴(进入轴)一致时(共线性)，得到最优的耦入。在此出现的偏差附加于上面提到的活节臂本身由机械和热造成的偏差地影响精确度。在应用纤维传输光学装置时，在光束引导中待补偿的偏差虽然减小到仅在光束耦入和光束耦出时出现，但是在目标地点上所不希望的激光光束偏差的基本问题仍然存在。尤其还存在所不希望的耦入到纤维护套(“包层”)中的危险。由US 5，463，215A公知用于以耦入到光纤维中为目的的光束的校准的设备，在该设备中，激光光束的未耦入到纤维直径中的部分经由两个布置为后向反射器的环形的锥状的镜以及在环上成45°旋转的镜耦出到探测器装置上。然后，通过探测器与环绕的镜的位置的同步来识别激光轴和纤维轴的共线性的偏差以及散焦。此外，覆盖纤维输入端的照明(也就是说光束直径大于纤维直径)是必需的并且因此强度损失从一开始就已经是不能够避免的。因此，由现有技术得出以下缺点-通常的双光子显微镜和多光子断层照相机(MPT)基于它们的固定的构建示出受限制的应用范围并且例如不适合用于在人体上的多用途的研究；-针对灵活的构建的转变，引导光束的系统的机械的公差过大，以致于不能确保用于扫描区的允许亚微米分辨率的能重现地照明的测量光斑照射的足够的稳定性；以及-在多光子显微镜检查中，将成像限制在对内生材料的自发荧光的探测和对确定分子的非线性的倍频经常是有缺点的，其中，与CARS系统的所希望的结合因为高共线性要求至今只能够在固定的系统中实现。
发明内容
因此，本发明的任务如下，S卩，实现用于针对尤其是皮肤、在泌尿生殖区域内的组织、在人体的口腔中和在眼睛区域内的组织、而且还有植物的组织、动物的组织、在细胞培养中的组织和在无生命材料中的组织的多用途的高分辨率的非线性研究的非侵入性三维探测的移动的、能自由使用的非线性激光扫描显微镜，该激光扫描显微镜在测量头的无限制灵活性的情况下允许聚焦光学装置的能重现的照射。作为扩展的任务，应该能够在共同的灵活的测量头中以结合不同的测量方法、优选MP断层照相检查和CARS断层照相检查为目的实现两条光束路线的能重现地一致的同时的应用。根据本发明，这个任务在用于非侵入性三维探测的灵活的非线性激光扫描显微镜中，该激光扫描显微镜包含至少一个辐射源，该辐射源产生用于触发由原子和分子射出的二次辐射的激发光束；用于将辐射传输到具有聚焦光学装置的测量头的灵活的传输光学装置，利用该聚焦光学装置使辐射聚焦到测量对象中并且射出的二次辐射返回和对准至少一个探测器系统；通过如下方式解决，即，测量头以能在空间中自由摆动和转动并且能灵活定位的方式与至少一个辐射源连接，从而能实施直立的、倒转的以及成任意空间角度的显微镜检查，布置有至少一个用于使至少一个辐射源的脉冲激光辐射的至少一个激发光束偏转和校准的能调节的倾斜镜，以便通过传输光学装置以如下的方式将至少一个激发光束对准到测量头中，即，使得激发光束在测量头的每个任意的位置上与测量头的孔径受限的光学元件同中心地布置，在测量头中在聚焦光学装置之前布置有用于由激发光束耦出测试光束的光束分束器，在测试光束的与目标位置共轭的位置上布置有用于得出激发光束在目标位置上限定的光束位置的、分辨地点的(ortsauflosend.)光电探测器，其中，测试光束在光电探测器上的中心校准相应于激发光束在目标位置上的正常校准，并且存在用于依赖于测试光束与它在光电探测器上的中心校准间得出的偏差来操控能控制的倾斜镜的控制单元，从而不依赖于传输光学装置由位置造成的妨碍程度而达到激光光束的方向稳定。
有利地，能控制的倾斜镜借助能控制的镜保持器、以选自如下的组，即电容性的、电感性的或压电的调节器、步进电动机或直流电动机中的驱动原理为基础来驱动。在此，能控制的倾斜镜可以根据目的借助双轴的镜保持器或借助两个单轴的镜保持器来实现。有利地选择聚焦光学装置的入射光瞳或其它孔径受限的光学元件的入射光瞳作为用于至少一个激发光束的稳定校准的目标位置。根据目的，用于产生测试光束的光束分束器依赖于至少一个激发光束在测量头中的光束引导来构造为反射光束分束器或者透射光束分束器。用于耦出测试光束的光束分束器可以有利地同时构造为用于共线地耦入两个不同的激发光束的二向色镜。用于探测作为在目标位置上的激发光束的等价物的测试光束的对位置灵敏的光电探测器优选是圆形的光电二极管。但是备选地，也能够使用矩形的或其它的探测器形状以及分辨地点的(分区的)接收器，如象限光电二极管、正交布置的横向效应二极管、交叉布置的探测器行((XD或CMOS)，CXD矩阵阵列或CMOS矩阵阵列。除了在传输光学装置中的光束稳定的调整之外，利用对位置灵敏的光电探测器能够有利地确定和修正激光的指向稳定性。用于由测量对象射出的二次辐射的探测器系统优选构造为具有用于MPT成像或SHG成像的探测器，从而存在用于荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由低机械精确度的灵活的光学活节臂允许测量头在空间中任意自由定位并且确保能重现的MPT成像。用于二次辐射的探测器系统可以特别有利地构造为具有多个用于MPT成像、SHG成像和CARS成像的探测器，从而存在用于生命物质中的荧光和非荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由共同的灵活的光学活节臂允许共同使用的测量头在空间中任意自由定位并且由MPT信号、SHG信号和CARS信号产生同时和同地的成像。在此，用于荧光物体和非荧光物体的如此结合的诊断系统根据目的还能够经由灵活的光学活节臂和单独的光纤维允许共同使用的测量头在空间中任意自由定位。此外，如下是可能的，即，在灵活的合并的诊断系统中经由两条单独的光纤维实现用于同时和同地成像的共同的测量头的任意自由定位。此外，用于二次辐射的探测器系统在紧凑的变体中具有用于MPT成像和用于CARS成像的共同的测量探测器，其中，设置有用于暂时中断CARS激发的机构，该机构允许MPT成像相对于合并的信号显示的分离。用于时间相关的单光子计数器的探测器系统优选具有用于MPT成像的TCSPC探测器。在此，探测器系统根据目的装配有额外的触发二极管，该触发二极管充分利用为了测量信号耦出而设置在测量头中的光束分束器的背面反射。在灵活的激光扫描显微镜的有利的实施方案中，测量头机械式地通过灵活的、能在任意姿态上锁止的支撑臂支撑在移动的基础仪器上，该支撑臂强制性地一起引导传输光学装置，其中，在基础仪器中至少存在用于产生脉冲激发辐射的辐射源、用于同步脉冲激光辐射和校准至少一个到测量头的传输光学装置的光学单元以及用于测量头中的激发辐射的方向稳定的控制单元和用于处理由测量头的探测系统传输的用于利用显示单元来成像显示的信号的评估单元。
本发明以如下考虑为基础，S卩，一般有两种可能性来达到在镜活节臂中的灵活的光束传输的精确度，即通过应用大多为大体积的、笨重的和成本高昂的光学机械式笼状系统或通过应用激光辐射的高要求的方向稳定方案。本发明利用用于激光辐射(或也能够是非相干辐射)的技术上简单的、有成本效率的和小体积的方向稳定方案来解决这些不可兼顾的要求，该方向稳定方案为了偏差最小化而具有探测器、控制单元和激发器。依赖于在无限制灵活的测量头内部的共轭目标平面中探测到的偏差，在激光光束耦入到测量头的照明和采集系统(聚焦光学装置)中之前，借助控制单元(简单的逻辑电路)进行该激光光束的光束方向的校正。当应用多个激发光束时，通过这种光束稳定也同时保证了测量辐射的共线性。由此，在光束引导所需要的精确度方面，减少了对镜活节臂的机械式笼状结构的要求，并且产生的体积节省和重量节省带来了显微镜测量系统的(例如断层照相机的)灵活性和移动性。尤其是在纤维传输系统中的纤维耦合的情况下能够看到方向稳定的优点，例如紧凑的和小体积的构造形式和成本效率。此外，根据本发明的解决方案的特征如下，S卩，待由具有灵活的测量头的显微镜成像系统研究的对象部位能够通过不同的测量方法同时地研究，例如借助高分辨率的多光子荧光显微镜检查、多光子SHG显微镜检查和/或CARS显微镜检查。在此，一个或多个短脉冲激光的不同的激发光束能够经由同一只灵活的光学活节臂或者经由一只灵活的光学活节臂和额外的光纤维或者经由两条光纤维传输并且能够利用用于光束稳定的同一装置来控制和调整。利用本发明实现用于针对以亚微米分辨率成像的研究的非侵入性三维探测的紧凑的灵活的非线性激光扫描显微镜是可能的，该激光扫描显微镜在测量头的无限制的灵活性的情况下允许能重现地照射测量对象。此外，不同测量方法的，优选多光子荧光显微镜检查的、多光子SHG显微镜检查的和/或CARS显微镜检查的光束路线能够在共同的灵活的测量头中合并并且在此实现同一能重现的照射和精确到点的(精确到细胞的)扫描。
下面借助实施例对本发明进行详细阐释。为此附图示出图1 :在应用镜活节臂作为引导光束的系统的情况下，用于将激光光束校准到测量头中的目标点上的本发明的原理图；图2:在应用圆形的光电二极管的情况下，用于在共轭的目标平面中的光束偏差的探测原理图；图3 :作为具有针对在人的皮肤上的断层照相检查的能在空间中自由定位的测量头的移动的、能多用途地使用的激光扫描显微镜的本发明的实施的三维图；图4 :在具有两个应用共同使用的镜活节臂作为到测量头的引导光束的系统的探测系统的灵活的激光扫描显微镜中的实施本发明的示意图，该测量头为了研究而在垂直的测量对象上(90°姿态)例如在油画的无生命的物质上校准；图5 :在具有两个应用镜活节臂和光纤作为到共同的测量头的引导光束的系统的探测系统的灵活的激光扫描显微镜中的实施本发明的示意图，该测量头用于研究动物例如老鼠的有生命的组织而在正常姿态(0° )上校准；
图6 :在具有两个应用两条光纤维作为到共同的测量头的引导光束的系统的探测系统的断层照相机中的实施本发明的示意图，该测量头用于任意物质的研究例如在培养皿中的溶液而作为倒转的显微镜(180°姿态)被校准。
具体实施例方式图1不出系统的原理上的构建。激光器1，优选具有圆形的光束横截面(或者也可具有偏离的光束横截面，例如椭圆形的或多模激光光束)的单模激光器(横向模式)，发射激光光束11到能调节的倾斜镜2上，利用该倾斜镜激光光束11耦入到传输光学装置3中并且传导到在测量头4内部的目标位置41上。借助在测量头4中布置的光束分束器42，激光光束11中的一小部分(例如< 10%)作为测试光束43耦出到分辨地点的光电探测器5上。相对于目标位置41共轭地布置分辨地点的光电探测器5，从而使得光电探测器5对于激光光束11的(或者说从其中耦出的测试光束43的)光束横截面13 (仅在图2中示出)与正常位置或者说中心位置的位置偏差是敏感的。这意味着，测试光束43相对激光光束11具有偏离的光轴(例如呈90°的角度)。控制单元6 (这个控制单元能实现为简单的逻辑单元)评估光电探测器5的输出信号并且依赖于测试光束43 (光束横截面13的中心或者说功率重心，如图2中所示)与光电探测器5的中心位置的偏差来控制可调节的倾斜镜2的角度校准而使光电探测器信号最大化。图2中，在画上阴影线的正方形的内部，分辨地点的光电探测器5画为单个的大面积的圆形的光电二极管51。但是也有大量用于探测激光光束11的光束横截面13的位置偏差的其它可能性。这能够由以分辨地点的方式进行测量的探测器，如象限光电二极管，通过两个正交布置的横向效应二极管(英文position sensitive device - PSD,对位置敏感的器件)、交叉布置的探测器行(CCD -英文charge coupled device,电荷稱合器件,或CMOS -英文complementary metal oxid semiconductor,互补金属氧化物半导体)、CCD矩阵或CMOS矩阵来实现，其中，二维传感器阵列实施为具有圆形地联通(面元划分)的面元件，或者与光导纤维共同作用地整体地采集。此外，可以使用相当少见的具有移动的狭缝的探测系统(英文scanning slit detector,扫描狭缝探测器)。在改变能调节的倾斜镜2的角度位置的情况下(根据图1 )，激光光束11的(在这里假定为圆形的)光束横截面13在画上阴影线的正方形内部偏移。在光束横截面13的面和光电探测器5(该光电探测器应有利地相应于圆形的光束横截面13构造为圆形的光电二极管51)的面部分重合的情况下，产生输出信号，该输出信号以光电探测器5的由入射的激光光束产生的光电流为基础。根据图1的设施的目标是光束横截面13在光电探测器5的中心上的永久的定中心。光束横截面13的位置在这里通过笛卡尔坐标系统内部的坐标X和Y限定，该笛卡尔坐标系统配属给在测量头4的目标位置41上的激光光束11的理想位置。同一坐标系统配属给共轭的位置，在该共轭的位置上布置有光电探测器5，并且示出识别光束偏差的基础。图1中的目标位置41的笛卡尔坐标系统的原点与圆形的光电二极管51的中心相关，因为这个圆形的光电二极管布置在相对于目标位置41共轭的平面中。光电探测器5的输出信号通过圆形的光电二极管51的灵敏度分布与光束横截面13的强度函数的依赖于位置的重合或者卷积而产生，如其在图2中例如在画上阴影线的正方形内部(假定的坐标系统)表现为针对在X坐标中的信号分量52的近似的高斯分布和表现为在Y坐标中的性质上相同类型的信号分量53。由于输出信号分成X分量和Y分量，光束横截面13的位置可以借助能调节的倾斜镜2的角度偏移可改变地和分步地(例如首先针对X坐标并且然后针对Y坐标地使光电二极管信号最大化)调整。光束横截面13在笛卡尔坐标系统的X方向上的偏移产生具有全局最大值521的依赖于位置的信号分量52。信号分量52的振幅依赖于(圆形的)光束横截面13和圆形的光电二极管51的重合，或更确切的说，依赖于激光光束11的强度函数与光电二极管51的灵敏度函数的卷积。激光光束11的从属于最大值521的偏移角度代表在X方向上所寻找的坐标。由此得出并且校准倾斜镜2的在X轴上所寻找的校正位置。由这个X坐标出发，在正交的(坐标系统的Y轴的)方向上的偏移导致圆形的光电二极管51的第二信号分量53的最大值531与在Y方向上所寻找的坐标相关。以这种方式得出倾斜镜2的在Y轴上所寻找的校正位置并且能够相应地校准倾斜镜2。由于最初的补偿移动，信号分量53的振幅通过光束横截面13和光电二极管51的面的增加的重合部分相对于信号分量52而增加或者说最大化。对于理想圆形的高斯型光束横截面13和理想圆形的光电二极管51可以一次性地得出坐标。在此，在移向X方向上的和Y方向上的坐标之后，目标位置41的笛卡尔坐标系统的原点与光束横截面13的中心或者说重心相关。对于非理想的(偏离于圆形高斯型)光束横截面13或者说非圆形的光电探测器51，X方向上的和Y方向上的坐标寻找的过程必须多次重复。然后，第一次校准的结果能够重新在测试光束43中检测并且必要时再次调整倾斜镜2。因此，通过定中心过程的多次应用，除了圆形的(单模)光束横截面之外所谓的多模的或者说非对称的光束横截面13也能够定中心到目标位置41上(迭代的近似)。在此，不是理想的圆形的光束横截面13的中心而是光束横截面13的强度重心被校准。利用在坐标X和坐标Y中的圆形光电二极管51的两个信号分量52和53的信息的帮助，借助控制单元6如此地校准能调整的倾斜镜2，使得光电二极管51的信号变大并且因此光束横截面13 (或者说它的强度重心)移动到目标平面41的中心上。为了这个调控原理的最大的准确度，信号分量52和53必须具有无平顶区的最大值521或者531。这能够通过将圆形的光电二极管51的直径调整到光束横截面13的直径上来进行，其中，光电二极管51的直径应该是在l/e2的激光光束I的强度时光束半径的两倍。尽可能准确地得出信号分量52或者说53的最大值521或者说531的其它的可能性是接下来的信号处理(例如高斯型匹配或低通滤波)。这也允许利用长相干的激光辐射源来运行系统，在该激光辐射源中由于在光束分束器上的多次反射而具有干扰。信号分量52和53的动态范围能够通过应用对数放大器(没有画出)来提高，这在具有可变输出功率的激光器中还保证了方向稳定的功能。为了产生测试光束43，根据激光光束11在测量头4中应该在哪个方向上继续被引导而能够使用激光光束11在光束分束器42上的反射(如图1中所示)或者透射(如图4中所示)。在应用纤维传输光学装置的情况下(如图5中出现的那样)，激光光束11的耦入和因此系统的透射由于在光学单元72内部的热漂移和机械应力而受影响。如果应用单模纤维，该单模纤维的芯直径非常小，那么透射仅在不过几分钟内就会衰减百分之几十。在此，除了在测量头4中的不充足的激光功率之外，在纤维内部发生了由热交换作用造成的纤维传输系统的损坏，无论如何必须避免这种热交换作用。激光光束11的校正的作用原理或者说其到纤维传输光学装置的芯中的定中心与图1的描述类似地进行，其中，在图2中所描述的圆形的光电二极管51的功能能够由构造为纤维的传输光学装置3的圆形的芯直径和在这之后连接的、对所有传输的光积分的光电探测器5来表现。在此，光导纤维32与在之后安置的任意形式的光电探测器5 —起等效地模仿针对利用圆形的光电二极管51进行调整的、根据图1和图2所描述的功能。实施例1如图3中所示，作为移动的、灵活的非线性扫描显微镜的测量系统由用于能自由选择放置的在轮子上的移动基础仪器组成。在这台基础仪器上经由支撑臂8附着有在空间中能自由移动的测量头4。额外地，针对用于成像的激光扫描所需要的激光辐射的光学的光束引导，在基础仪器7与测量头4之间安装有两个不同的光学的传输光学装置3、镜活节臂31和光纤维32。这些均针对传输用于不同探测方法(例如无一般性限制地用于多光子断层照相检查和CARS断层照相检查)的激发辐射而设置，其中，不同的激发光束在测量头4中共线地重合。此外，在测量头4中使用图1中从原理上示出的具有对位置敏感的光电探测器5、控制单元6和能控制的倾斜镜2的光束稳定系统。由此，图3中所示出的测量头4自由地对准到作为测量对象9 (人)的人皮肤91在空间中任意坐落的区段上是可能的，不会由于测量头4的多样化的摆转可能性而出现激发条件的某些变化(恶化)。根据本发明的扫描显微镜的其它不同的技术上的设计方案包括若干多样化的应用可能性在以下实例中详细阐释。实施例2图4的根据本发明的显微镜，如图3在上面所描述的那样，由用于能自由选择地放置的、在轮子上的移动的基础仪器组成。针对多光子成像，在基础仪器7中具有短脉冲激光系统71 (5fs - 500ps ;带有高斯型的光束横截面，例如钛蓝宝石激光)以及光学单元72，在该光学单元中，作为双轴倾斜镜21的能控制的倾斜镜2使由短脉冲激光系统71出来的激光光束11耦入到以镜活节臂31的形式存在的灵活的传输光学装置3中。激光光束11在这个第一示例中经由灵活的镜活节臂31传导到光学测量头4。能移动的和能在每个姿态上锁止的多节支撑臂8使光学测量头4的自由定位成为可能，从而相应地强制性地一起引导镜活节臂31。因此，测量头4能够以其聚焦光学装置44以任意的方式对准测量对象9来定位，该聚焦光学装置在此情况下处在与带有竖直表面的测量对象9呈90°的姿态上，该测量对象在这个示例中是挂起来的油画92，该油画的组成(材料或涂层构建)能够被研究。在此，基于对激光光束11的轴方向的不断的控制和追踪，目标平面41保持一样地被照射，从而避免由波动的激发辐射而造成的测量误差。用于CARS成像所必需的具有与短脉冲激光71偏离的波长的第二辐射源由短脉冲激光器71生成,通过如下方式，即，经由光束分束器725 f禹出激光光束11的大约一半的福射份额并且作为激光光束11’输入给移频器73。从中射出的具有偏离的波长的激光光束12同样耦入到光学单元72中，其中，激光光束12经由第二可双轴控制的倾斜镜22(具有如双轴倾斜镜21那样的相同功能)额外地通过具有可变的透镜间距的望远镜式系统722和可变的光学延迟区段723来引导并且在穿过能调节的镜设施724和二向色镜726之后与短脉冲激光器71的激光光束共线地(两个光束份额沿着同一轴线在空间上重合)校准。两个激光光束11和12在二向色镜726之后共线地耦入到镜活节臂31中并且向着测量头4传输。然后，在测量头4中永久地监控这两个激光光束11和12的轴是否一致，通过如下方式，即，对位置敏感的光电二极管51的中心的照射在由经由光束分束器42从到聚焦光学装置44的光束路径中耦出的测试光束43中检测并且借助控制单元6对所确定的偏差经由光学单元72的能双轴控制的倾斜镜21和22针对每个激光光束11和12进行校正。由此，在镜活节臂31的每个任意的校准中确保均匀地照射聚焦光学装置44的入射光瞳(目标平面41)。代替聚焦光学装置44的入射光瞳，也能够使用其它的在测量头4中使用的光学元件的孔径限制。两个激光光束11和12的单个激光脉冲的时间上的重合通过对可变的光学延迟区段723的手动的或机动的调整来实现。具有不同波长的激光光束11和12在聚焦光学装置44之后由于色散而相互分开的聚焦位置能够通过望远镜系统722在测量对象9 (在本示例中是油画92)的内部重合。在测量头4的内部，两个激光光束11和12的激光辐射的主要份额经由光束分束器42引导到为了二维扫描而设置的扫描单元46中。在扫描单元46之后，激光辐射经由望远镜式系统47引导到聚焦光学装置44的入射光瞳中并且利用聚焦光学装置44在待研究的油画92中聚焦。扫描单元46允许激光光束11和12在聚焦光学装置44的焦点平面内部的二维偏移，从而能够对油画进行光栅式的二维扫描或者说激发。通过经由Z轴定位器48对聚焦光学装置44进行系统的调整使得测量对象9的断层照相的三维显示(作为在油画92的不同涂层上的堆栈式采集)成为可能。在油画92中的聚焦光学装置44的焦点平面上分别由不同的激发光束(具有不同的波长和脉冲序列的激光光束11和12)生成的信号通过测量头4的聚焦光学装置44整体地采集并且借助两个用于耦出测量信号、例如自发荧光信号和SHG信号的二向色光束分束器451和452与反射的激发辐射分开并且转向到两个测量探测器，MP探测器54和CARS探测器55上。MP信号和CARS信号的评估在基础仪器71的评估单元61中进行并且能够作为多维的灰度值分布在显示单元62上以图像的方式显示。为了以时间相关的单个光子计数器(英语Time Correlated Single PhotonCounting - TCSPC)为基础的图像采集，其具有如下目标，即，通过测量原子振动和分子振动的衰减时间来分列原子和分子以及它们的周围环境，测量探测器54和55能够由高时间分辨率的探测器取代并且它们的信号能够在评估单元61中处理。为了在TCSPC测量中所必需的触发而设置有触发二极管56，该触发二极管充分利用光束分束器451和452的寄生式的背面反射。在这个示例中使用了光束分束器451的背面反射。选择性地也能够针对对位置敏感的光电二极管51充分利用光束分束器451或452的寄生的背面反射，利用该光电二极管的输出信号，控制单元6经由双轴倾斜镜21和22控制激光光束11和12关于在测量头4中限定的目标平面41的稳定的方位。此外，图4中这个对于光电二极管51备选的位置用虚线画出并且用光电二极管51’表示，其中，充分利用了光束分束器452的寄生的背面反射。这个可选的光电二极管51’，因为它更靠近目标平面41 (聚焦光学装置44的入射光瞳)，所以能够被优选并且省去布置在测试光束43中的光电二极管51。光束分束器42能够在这种情况中由全反射镜(未画出)取代。利用对待测量油画92的激光光束稳定的激发，使方向稳定性以10 - 20的因子来改善。这种类型的改善保证了在测量头4的所有位置上的对图像区的均匀的照射并且因此保证了能重现的、能对比的测量结果。实施例3图5示出在使用镜活节臂31和光纤维32作为两个分开的引导光束的光学传输系统3的情况下的测量系统。短脉冲激光71以相同的方式，如在第二示例中那样，利用光学单元72经由双轴倾斜镜21耦入到灵活的镜活节臂31中并且传导到光学的测量头44。为了产生额外的CARS成像而使用的移频器73借助由光束分束器725耦出的经由换向镜721的带有由短脉冲激光71产生的输出波长的激光光束11’提供并且发射出具有偏离于短脉冲激光71的波长的激光光束12。有异于之前的示例，激光光束12在它首先穿过望远镜系统722之后，在光学延迟区段723之前借助第一单轴倾斜镜23和与其正交布置的第二单轴倾斜镜24在两个坐标方向上分开地校准。此外，激光光束12，如图4所描述的那样，穿过延迟区段723和镜设施724。同样有异于图4中的构建，此后激光光束12不经过用于与激光光束11 一起引导的二向色光束分束器726，而是该激光光束单独地耦入到光导纤维32中并且经由这条光导纤维引导到测量头4。在测量头4中，激光光束12经由合适的二向色分束器421与由镜活节臂31导入的激光光束11共线地重合并且聚焦到老鼠93的组织(作为具体的测量对象9)中，其中，该分束器421同时承担用于激光光束11的偏转功能以及用于将测试光束43耦出到光电二极管51上的分束功能。由老鼠93的组织返回来的信号的识别和处理在这个示例中经由光束分束器451耦出地借助用于所产生的MP信号和CARS信号的共同的探测器57进行，其中，通过阻断激光光束11或12中的一个或者备选地通过借助延迟组件723来改变这两个激光光束11和12的彼此的相位(时间上的参考)，能够将CARS信号与MP信号区别开，由此探测器57只接收MP信号。此外，通过这两个激光光束11和12的同相激发，能够一同(重合地)探测老鼠3的组织的CARS信号和MP信号。实施例4激光扫描显微镜的其它有利的设计方案在图6中示出，其中，两条光纤维32和33作为引导光束的光学传输系统3使用。具有不同波长的两个激光光束11和12如第三个示例中那样在光学单元72中引导、校准并且相互协调，使得相互不重合。但是与之前的示例有区别的是激光光束12在第二激光源74中产生并且于在延迟组件723和紧接着的镜设施724中的较耗费的相位同步之后耦入到光导纤维32中(如根据图5的第三示例那样)。激光光束11在这种情况中耦入到第二纤维、优选单模纤维33中。然后，这两条纤维32和33在测量头4中，以如第三示例中类似的形式，借助二向色分束器421共线地重合。激光光束11和12的稳定的共线的校准以及因此激发的信号的识别以同样的方式如第二实施例中描述的那样进行。作为测量对象9的用液态的或固态的物质填充的培养皿94能够静止地固定在测量头4上(在最简单的情况中例如利用双面的胶带)或者与定位工作台(例如双轴的或三轴的十字工作台，未示出)能移动地联接。这使得在非常少的技术消耗的情况下的显微镜式成像成为可能。代替培养皿94，也能够以相同的方式研究在微量滴定盘上的物体。因此，图6中相应示出的倒转的显微镜设施允许任意样本的研究，例如放入营养液中的样本、固态的研磨成粉的或制成颗粒的材料甚或固体(靠近表面的区域)。所描述的带有CARS探测器的MPT系统的相对于通常的和不灵活的系统的优点在于具有小重量的通过光学活节臂31和/或光导纤维32、33在空间中能自由定位的测量头4和移动的基础仪器7。这种系统允许操作人员能够在短时间内能重现地执行高分辨率的综合测量(节省时间和节省成本)并且在此提供如下显微镜式的测量设施以供使用，该测量设施针对任意取向的对象表面能够完全等效地(兼容地)并且在无需测量对象移动(例如患者重置)或由测量对象9取走样本的情况下执行大量对测量对象9的不同部分的测量。此外，测量头4的灵活的定位使所谓的倒转成像成为可能，如它在常用的显微镜检查中广泛地使用。区别于常用的仅能够用作直立的显微镜(0° )或能够用作倒转的显微镜(180° )的显微镜系统，带有能够不受限制地移动的本发明还允许在90°姿态上的布置和任意偏离该姿态的布置。由此，对直立的对象的测量同样是可能的，例如对在壁上的霉菌培养的研究、对在种植园内部的植物机体结构的研究、材料分析(参见图4)、动物研究(参见图5)和对人的皮肤的研究(图3)以及不同类型的犯罪侦查的研究，还有如作为用于研究任意的液态的或固态的物质的激光扫描显微镜的使用(图6)。此外，利用在测量头4上相应匹配的附属件(未画出)使得应用测量头4上的定位工作台(十字工作台)成为可能，以便提供常用的显微镜性能，该显微镜性能基于扫描显微镜(基础仪器7)的移动性可以于每个任意地点允许在宏观样本区域上方的高分辨率的研究。多光子荧光显微镜检查、多光子SHG显微镜检查和/或CARS显微镜检查的成像的诊断系统相对于各独立的诊断系统的联接上的优点在于如下，即，在一个具有灵活的测量头4的紧凑的移动的基础仪器7中将多光子激发和成像、多光子SHG激发和成像和CARS激发和成像的方法结合起来。具有灵活的活节臂31或者光纤维32、33的所提出的布置方案允许测量头4的自由的定位，该定位没有分辨率限制并且没有由于对激发辐射的有误差的调准而产生的信号失真，通过如下方式，即，以简单的和稳定的方式可靠地接收和修正激发辐射并且以此确保最小误差的成像和评估。附图标号列表I激光器11激光光束(激发光束)12激光光束(第二激发光束)13光束横截面2(能控制的)倾斜镜21、22 双轴倾斜镜
23、24单轴倾斜镜3传输光学装置31镜活节光学装置32光导纤维33单模纤维4测量头41目标位置42光束分束器421二向色分束器43测试光束44聚焦光学装置45信号I禹出分束器451二向色光束分束器452二向色光束分束器46扫描单元47望远镜系统48Z轴定位器5(对位置敏感的)光电探测器51(圆形的)光电二极管52,53信号分量(在X-方向上、在Y-方向上)521,531 最大值54(MP)探测器55(CARS)探测器56触发二极管57共同的探测器6控制单元61评估单元62显示单元7(移动的)基础仪器
71短脉冲激光器72光学单元721换向镜722望远镜式系统723延迟组件724镜设施725光束分束器726二向色镜73移频器74第二激光源
8支撑臂9测量对象91人的皮肤92油画93老鼠的组织 94培养皿(具有液态的物质)
权利要求
1.用于非侵入性三维探测的灵活的非线性的激光扫描显微镜，其包含至少一个辐射源，该辐射源产生用于触发由原子和分子射出的二次辐射的激发光束；用于将辐射传输到具有聚焦光学装置的测量头的灵活的传输光学装置，利用该聚焦光学装置使辐射聚焦到测量对象中并且射出的二次辐射返回并对准至少一个探测器系统；其特征在于， -所述测量头(4)以能在空间中自由摆动和转动并且能灵活定位的方式与所述至少一个辐射源(1、71、74)连接，从而能实施直立的、倒转的以及成任意空间角度的显微镜检查； -至少一个用于使所述至少一个辐射源的脉冲激光辐射的至少一个激发光束(11、12)偏转和校准的能控制的倾斜镜(2)如下地布置，S卩，以便通过所述传输光学装置(3)以如下的方式将所述至少一个激发光束(11、12 )对准到所述测量头(4 )中，S卩，使得所述激发光束(11、12)在所述测量头(4)的每个任意的位置上与所述测量头的孔径受限的光学元件(44)同中心地布置； -在所述测量头(4)中在所述聚焦光学装置(44)之前布置有用于由所述激发光束(11、12)耦出测试光束(43)的光束分束器(42)； -在所述测试光束(43)的与目标位置(41)共轭的位置上布置有用于得出所述激发光束(11、12)在所述目标位置(41)上限定的光束位置的、分辨地点的光电探测器(5)，其中，所述测试光束(43 )在所述光电探测器(5 )上的中心校准相应于所述激发光束(11、12 )的正常校准； -存在用于依赖于所述测试光束(43)与它在所述光电探测器(5)上的中心校准间得出的偏差来操控所述能控制的倾斜镜(2)的控制单元(6)，从而不依赖于所述传输光学装置(3)由位置造成的妨碍程度而达到激光光束的方向稳定。
2.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，所述能控制的倾斜镜(2)借助能控制的镜保持器、以选自如下的组，即电容性的、电感性的或压电的调节器、步进电动机或直流电动机中的驱动原理为基础来驱动。
3.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，所述能控制的倾斜镜(2)借助双轴的镜保持器(21、22)或两个单轴的镜保持器(23、24)来实现。
4.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，选择所述聚焦光学装置(44)的入射光瞳或其它的孔径受限的光学元件的入射光瞳作为所述至少一个激发光束(11、12)的目标位置(41)。
5.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于产生所述测试光束(43)的所述光束分束器(42 )依赖于所述至少一个激发光束(11、12 )在所述测量头(4 )中的光束弓I导来构造为反射光束分束器或者透射光束分束器。
6.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于耦出所述测试光束(43)的所述光束分束器(42)同时构造为用于共线地耦入两个不同的激发光束(11、12)的二向色镜。
7.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，所述光电探测器(5)是圆形的光电二极管(51)。
8.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，除了在所述传输光学装置(3)中的光束稳定性的调整之外，激光的指向稳定性也是能确定和能修正的。
9.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统构造为具有用于MPT成像或SHG成像的探测器(54)，从而存在用于荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由低机械精确度的灵活的光学活节臂(31)允许所述测量头(4)在空间中任意自由定位并且确保能重现的MPT成像。
10.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统构造为具有用于MPT成像和用于CARS成像的探测器(54、55)，从而存在用于生命物质中的荧光物体和非荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由共同的灵活的光学活节臂(31)允许共同使用的测量头(4)在空间中任意自由定位并且由MPT信号和CARS信号产生同时和同地的成像。
11.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统针对MPT成像和针对CARS成像地构造，从而存在用于生命物质中的荧光物体和非荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由灵活的光学活节臂(31)和单独的光纤维(32)允许共同使用的测量头(4)在空间中任意自由定位并且由MPT信号和CARS信号产生同时和同地的成像。
12.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统针对MPT成像和针对CARS成像地构造，从而存在用于生命物质中的荧光物体和非荧光物体的灵活的诊断系统，该诊断系统经由两个单独的光纤维(32、33)允许共同使用的测量头(4)在空间中任意自由定位并且由MPT信号和CARS信号产生同时和同地的成像。
13.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统具有用于MPT成像和用于CARS成像的共同的测量探测器(57)，其中，设置有用于暂时中断CARS激发的机构，该机构允许MPT成像相对于合并的信号显示的分离。
14.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，用于二次辐射的探测器系统具有用于MPT成像的TCSPC探测器并且额外地具有触发二极管(56)，该触发二极管充分利用为了测量信号耦出而设置的光束分束器(451)的背面反射。
15.根据权利要求1所述的激光扫描显微镜，其特征在于，所述测量头(4)机械式地通过灵活的、能在任意姿态上锁止的支撑臂(8)支撑在移动的基础仪器(7)上并且强制性地一起弓I导所述传输光学装置(3 )，其中，在所述基础仪器(7 )中至少存在用于产生脉冲激发辐射(11、12)的辐射源(71)、用于同步所述脉冲激发辐射(11、12)和校准至少一个到所述测量头(4)的传输光学装置(31、32、33)的光学单元(72)以及用于所述测量头(4)中的所述激发辐射(11、12)的方向稳定的所述控制单元(61)和用于处理由所述测量头(4)的探测系统(54、55)传输的用于利用显示单元(62)来成像显示的信号的评估单元(6)。
全文摘要
用于非侵入性三维探测的灵活的非线性激光扫描显微镜，尤其用于人和动物的组织中，但也能用于无生命物质中。其中在测量头无限制灵活性的情况下允许能重现地照射测量对象，其中，灵活地经由传输光学装置与至少一个辐射源连接的测量头能在空间中任意自由地定位，布置有至少一个用于校准激发光束的能调节的倾斜镜，以便保持激发光束穿过传输光学装置在测量头的每个位置上与测量头的孔径受限的光学元件同中心，其中，由激发光束耦出的测试光束射到用于得出光束位置的、布置在与激发光束的目标位置共轭的位置中的、分辨地点的光电探测器上，根据测试光束的中心校准来监控该激发光束，并且借助倾斜镜的控制单元依赖于得出的偏差实现激发光束的方向稳定。
文档编号G01N21/64GK103033917SQ201210378039
公开日2013年4月10日 申请日期2012年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者卡斯滕·柯尼希, 马丁·魏尼格尔 申请人:耶拿研究有限责任公司