专利名称：一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法
技术领域：
一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
目前常用的重金属检测方法，都是基于物理或化学的方法，如电感藕合等离子发射光谱、流动注射原子吸收分光光度计、电感藕合等离子体质谱、极谱法和伏安电极、原子荧光光谱分析、原子炉吸收光谱。上述主要的仪器检测法的最大的优点就是准确，但这些传统方法均需要复杂的前处理，分析时间长，劳动强度大且成本昂贵，只能在实验室内由专业人员进行具体操作，需要专业的技术人员进行大量的样品预处理等缺陷，难以应用于现场检测。由于这些明显的缺点，所以检测的样品数一般达不到要求的最佳抽检量，这也会给随后的重金属污染程度和风险评估等带来较大的不确定性。
纳米颗粒(nanoparticles,Nas) —般是指尺寸至少有一维在I一IOOnm间的粒子。纳米尺度是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，处于这个区域的材料具有一些独特性质，如小尺寸效应、表面、界面效应和量子尺寸效应等。空气中纳米颗粒虽然浓度很低，但具有很高的颗粒物数目。将宏观物体细分成纳米颗粒后，它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学性质和大体积固体相比将会显著不同。纳米材料的小尺寸、化学成分、表面结构、溶解性、外形和聚集情况决定着它们特殊的物理化学性质，这些性质使得纳米材料在将来有着广泛的用途。随着纳米科技的发展，纳米粒子组装体系的研究变得日益活跃。纳米粒子的二维和三维有序组装结构也因其重要的物理和化学性质近年来受到人们的广泛重视，它们在许多领域如传感器、催化剂、磁化材料、表面增强拉曼和光学材料等有着潜在的应用。金纳米材料二元组装体，可通过表面等离子共振介导及手性分子诱导等机理产生圆二色谱(CD)信号。但通过这种组装系统结合核酸错配识别原理用于构建重金属银离子检测传感器尚属空白。
发明内容
本发明目的是提供一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法，通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度布来测定银离子含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，达到国际领先水平。本发明的技术方案一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法，用合成的不同粒径的金纳米粒子分别与两种特定富含胞嘧啶(C)的核酸序列偶联得AuNPsicinm-DNAl和AuNPs25nm-DNA2,银离子的加入，使 AuNPSltlnm-DNAI 和 AuNPs25nm-DNA2 产生 C-Ag+-C 识别，利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下AuNPsitol-DNAl和AuNPs25nm-DNA2及银离子反应形成二元组装体，二元组装体的形成可以导致等离子手性的产生，金纳米粒子在可见光区产生⑶信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定银离子含量；包括核酸序列和纳米金的偶联，核酸长度的选择，标准曲线的测定。
工艺步骤为
(1)IOnm金纳米粒子合成
IOnm金纳米粒子用单宁酸和朽1檬酸三钠还原氯金酸合成；
(2)25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成；
(3)IOnm金纳米粒子和DNAl偶联
对步骤(I)合成出的IOnm金纳米粒子和巯基修饰的DNAl进行偶联形成金纳米粒子-DNAl复合体；
(4)25nm金纳米粒子和DNA2偶联· 对步骤(2)合成出的25nm金纳米粒子和巯基修饰的DNA2进行偶联形成金纳米粒子-DNA2复合体；
(5)金纳粒子组装
采用步骤(3)制备出来的金纳米粒子-DNAl复合体和步骤(4)制备出来的金纳米粒子-DNA2复合体进行杂交形成金纳米粒子二元组装体；
(6)对步骤(3)使用的DNAl和步骤(4)使用的DNA2浓度进行选择；
(7)二元组装体结构的形成及表征
对步骤(5)制备出来的金纳米粒子二元组装体进行结构表征。(8)圆二光谱检测，绘制⑶信号强度 银离子浓度标准曲线。对照组设置A12+，Zn2+，Mn2+，Hg+，Fe2+，Cu2+，Cr2+，Co2+ 和 Cd2+ 代替 Ag+，其它操作同上。具体为
(I)IOnm金纳米粒子合成
IOnm金纳米粒子的合成方案为洁净的三口烧瓶中加入60mL超纯水，ImL质量浓度1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，O. ImL质量浓度1%单宁酸溶液，O. ImL 50mM碳酸钾溶液和16mL超纯水作为B液；A、B液均加热到600C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60°C下继续搅拌30min形成深红色溶液,然后将溶液加热回流IOmin形成亮红色溶液,最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的IOnm金纳米粒子。(2) 25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子的合成方案为洁净的三口烧瓶中加入47. 5mL超纯水，加入O. 8mLO. 4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入ImL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min ；
(3)IOnm金纳米粒子和DNAl偶联
取5mL步骤(I)制备的IOnm金纳米粒子加入50 μ L 2mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，13000r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的IOnm金纳米粒子；取10 μ L浓度为I μ M的DNAl (5’ -CTC TCTTCT CTT CTC TCT TCT CT TCA-(CH2) 6-SH-3’)加入至Ij 100 μ L 上述保护剂包裹的 IOnm 金纳米溶液中，向体系中加入10 μ L 5Xtris-硼酸缓冲液25°C静置反应IOh ;13000r/min离心IOmin,去除上清液，沉淀加水稀释至原体积2倍液，得AuNPSltol-DNAI复合体，放入4°C的冰箱中备用。
(4) 25nm金纳米粒子和DNA2偶联
取5mL步骤(2)制备的25nm金纳米粒子加入50 μ L lmg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，7200r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的25nm金纳米粒子；取I μ L浓度为I μ M的DNA2(5’_TCA ACACAA CAC ACA ACA CAA CAC AC-(CH2) 6-SH_3’)加入到 100 μ L 上述保护剂包裹的 25nm 金纳米溶液中，向体系中加入10 μ L 5Χ tris-硼酸缓冲液，25°C静置反应IOh ；7200r/min离心lOmin，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积2倍液，得AuNPs25nm - DNA2复合体，放入4°C的冰箱中备用。(5)偶联DNA浓度的选择
为了提高该法的灵敏度，故需要对金偶联的DNA浓度需要进行选择。最适宜的DNA浓度是在二者混合加标准溶液反应以后，圆二光谱测定后CD信号强度最大。具体的步骤是
①分别向离心管中加入100μ L金纳米粒子，再加入O. I μ M、O. 2 μ M、O. 5 μ M、I μ M、2μΜ、5μΜ、10μΜ的DNAl后，向体系中加入IOyL 5Xtris-硼酸缓冲液，混匀，室温反应30min ；
②反应结束，用圆二光谱测定该反应液的CD信号强度，重复两次。DNA2的浓度选择按相同步骤进行。(6) 二元组装体结构的形成及表征
10 μ L 的 AuNPsltlmi-DNAl 复合体和 100 μ L 的 AuNPs25nm - DNA2 复合体，加入 10 μ L 的100ng/mL银纳米粒子标准液和10 μ L 5X tris-硼酸缓冲液,反应30min后,进行杂交形成金纳米粒子二元组装体。二元金纳米粒子组装体进行结构表征，将组装产品进行电镜和动态光散射表征。(7)圆二光谱检测，绘制⑶信号强度 银离子浓度标准曲线
10 μ L 步骤(3)制备的 AuNPsltlmi-DNAl 复合体和 100 μ L 步骤(4)制备的 AuNPs25nm - DNA2复合体中加入 0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL的银离子标准品，向体系中加入10 μ L 5Xtris-硼酸缓冲液，反应30min后，加入到微量比色皿中，测CD信号，以CD信号增值绘制CD信号强度与银离子浓度标准曲线；
对照组设置Al2+，Zn2+，Mn2+，Hg+，Fe2+，Cu 2+，Cr2+，Co2+ 和 Cd2+代替，其它操作同上。本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。本发明的有益效果与传统的仪器方法相比，本发明利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下AuNPsicinm-DNAl和AuNPs25nm_DNA2及银离子反应形成二元组装体,二元组装体的形成可以导致等离子手性的产生，金纳米粒子在可见光区产生⑶信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度布来测定银离子含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
图I典型的二元金纳米粒子组装体电镜图。
图2 二元金纳米粒子组装体动态光散射表征图。图3圆二光谱检测标准曲线图。
具体实施例方式实施例I
(I)IOnm金纳米粒子合成
IOnm金纳米粒子的合成方案为洁净的三口烧瓶中加入60mL超纯水，ImL 1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠溶液，O. ImL 1%单宁酸溶液，O. ImL 50mM碳酸钾溶液和16mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60°C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60°C下继续搅拌30min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流IOmin形成亮红色溶液,最后冷却到室温形成朽1檬酸稳定的IOnm金纳米粒子。
(2) 25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子的合成方案为洁净的三口烧瓶中加入47. 5mL超纯水，加入O. 8mLO. 4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入ImL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min ；
(3)IOnm金纳米粒子和DNAl偶联
取5mL步骤(I)制备的IOnm金纳米粒子加入50 μ L 2mg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，13000r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的IOnm金纳米粒子；取10 μ L浓度为I μ M的DNA1(5’_CTC TCTTCT CTT CTC TCT TCT CT TCA-(CH2) 6-SH-3’)加入至Ij 100 μ L 上述保护剂包裹的 IOnm 金纳米溶液中，向体系中加入IOyL 5Xtris-硼酸缓冲液，25°C静置反应IOh ;13000r/min离心lOmin，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积2倍液，得AuNPSltol-DNAI复合体，放入4°C的冰箱中备用。(4) 25nm金纳米粒子和DNA2偶联
取5mL步骤(2)制备的25nm金纳米粒子加入50 μ L lmg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，7200r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的25nm金纳米粒子；取I μ L浓度为I μ M的DNA2 (5’_TCA ACACAA CAC ACA ACA CAA CAC AC-(CH2) 6-SH_3’)加入到 100 μ L 上述保护剂包裹的 25nm 金纳米溶液中，向体系中加入IOyL 5Xtris-硼酸缓冲液，25°C静置反应IOh ;7200r/min离心lOmin，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积2倍液，得AuNPs25nm - DNA2复合体，放入4°C的冰箱中备用。(5)偶联DNA浓度的选择
为了提高该法的灵敏度，故需要对金偶联的DNA浓度需要进行选择。最适宜的DNA浓度是在二者混合加标准溶液反应以后，圆二光谱测定后CD信号强度最大。具体的步骤是
①分别向离心管中加入100μ L金纳米粒子，再加入O. 1μΜ、0. 2μΜ、0. 5μΜ、1μΜ、2μΜ、5μΜ、10μΜ的DNAl后，向体系中加入IOyL 5Xtris-硼酸缓冲液，混匀，室温反应30min ；
②反应结束，用圆二光谱测定该反应液的CD信号强度，重复两次。DNA2的浓度选择按相同步骤进行。
(6) 二元组装体结构的形成及表征
10 μ L 的 AuNPsicinm-DNAl 复合体和 100 μ L 的 AuNPs25nm - DNA2 复合体，加入 10 μ L100ng/mL银纳米粒子标准液和10 μ L 5X tris-硼酸缓冲液,反应30min后,进行杂交形成金纳米粒子二元组装体进行结构表征。得二元金纳米粒子组装体，将组装产品进行电镜和动态光散射表征。(7)圆二色谱检测，绘制⑶信号强度 银离子浓度标准曲线
10 μ L 步骤(3)制备的 AuNPsltlmi-DNAl 复合体和 100 μ L 步骤(4)制备的 AuNPs25nm - DNA2复合体中加入 0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL的银离子标准品，向体系中加入10 μ L 5 X tris-硼酸缓冲液,反应30 min后，加入到微量比色皿中，测CD信号，以CD信号增值绘制CD信号强度与银离子浓度标准曲线.
对照组设置Al2+，Zn2+，Mn2+，Hg+，Fe2+，Cu 2+，Cr2+，Co2+ 和 Cd2+代替，其它操作同 上。
权利要求
1.一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法，其特征在于用合成的不同粒径的金纳米粒子分别与两种特定富含胞嘧啶(C)的核酸序列偶联得AuNPsitlnm-DNAl和AuNPs25nm-DNA2,银离子的加入使 AuNPs1(lnm-DNAl 和 AuNPs25mi-DNA2 产生 C-Ag+-C 识别，利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下AuNPsicinm-DNAl和AuNPs25nm-DNA2及银离子反应形成二元组装体，二元组装体的形成导致等离子手性的产生，金纳米粒子在可见光区产生圆二光谱CD信号；工艺步骤为 (1)10nm金纳米粒子合成 10nm金纳米粒子用单宁酸和柠檬酸三钠还原氯金酸合成洁净的三口烧瓶中加入60mL超纯水，ImL质量浓度1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，O. ImL质量浓度1%单宁酸溶液，O. ImL 50mM碳酸钾溶液和16mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60°C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，反应液在60°C下继续搅拌30min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流IOmin形成亮红色溶液，冷却到室温形成朽1檬酸稳定的IOnm金纳米粒子； (2)25nm金纳米粒子的合成 25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成洁净的三口烧瓶中加入47. 5mL超纯水，力口入O. 8mL O. 4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入ImL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min ； (3)IOnm金纳米粒子和DNAl偶联 对步骤(I)合成出的IOnm金纳米粒子和巯基修饰的DNAl进行偶联形成金纳米粒子-DNAl复合体取5mL步骤(I)制备的IOnm金纳米粒子加入50 μ L 2mg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，13000r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的IOnm金纳米粒子；取10 μ L浓度为I μΜ的DNAl加入到100 μ L上述保护剂包裹的IOnm金纳米溶液中，向体系中加入IOyL5Xtris-硼酸缓冲液,25 静置反应IOh ; 13000r/min离心IOmin,去除上清液,沉淀加超纯水稀释至原体积2倍液，得AuNPsltlmi-DNAl复合体，放入4°C的冰箱中备用；DNAl :5，-CTC TCT TCT CTT CTC TCT TCT CT TCA-(CH2) 6-SH_3，； 对该步骤使用的DNAl浓度允许进行选择； (4)25nm金纳米粒子和DNA2偶联 对步骤(2)合成出的25nm金纳米粒子和巯基修饰的DNA2进行偶联形成金纳米粒子-DNA2复合体取5mL步骤(2)制备的25nm金纳米粒子加入50 μ L lmg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡12h，7200r/min离心IOmin后去除上清液，加超纯水恢复到原体积，得保护剂包裹的25nm金纳米粒子；取I μ L浓度为I μ M的DNA2加入到100 μ L上述保护剂包裹的25nm金纳米溶液中，向体系中加入10 μ L 5 Xtris-硼酸缓冲液，25°C静置反应IOh ；7200r/min离心lOmin，去除上清液，沉淀加超纯水稀释至原体积2倍液，得AuNPs25mi - DNA2复合体，放入4°C的冰箱中备用；DNA2 :5’ -TCA ACA CAA CAC ACA ACA CAA CAC AC-(CH2) 6-SH_3’ ； 对该步骤使用的DNA2浓度允许进行选择； (5)金纳米粒子组装 采用步骤(3)制备出来的AuNPsitol-DNAl复合体和步骤(4)制备出来的AuNPs25nm-DNA2复合体进行杂交形成金纳米粒子二元组装体10 μ L AuNPs10nill-DNAl复合体和IOOyLAuNPs25nm - DNA2复合体,加入IOyL 100ng/mL银纳米粒子标准液和IOyL 5 X tris-硼酸缓冲液，反应30min后,进行杂交形成金纳米粒子二元组装体；将二元金纳米粒子组装产品进行电镜和动态光散射表征； (6)圆二光谱检测，绘制CD信号强度 银离子浓度标准曲线.10 μ L 步骤(3)制备的 AuNPsltlmi-DNAl 复合体和 100 μ L 步骤(4)制备的 AuNPs25nm - DNA2复合体中加入 0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、Ing/mL、 .5ng/mL、10ng/mL的银离子标准品，向体系中加入10 μ L 5Xtris_硼酸缓冲液,反应30min后，加入到微量比色皿中，测CD信号，以CD信号增值绘制CD信号强度与银离子浓度标准曲线.对照组设置=Al2+, Zn2+，Mn2+，Hg+，Fe2+，Cu 2+，Cr2+，Co2+，Cd2+ 代替，其它操作同上。
全文摘要
一种运用圆二光谱高灵敏检测银离子的方法，属于分析化学技术领域。本发明合成的两种不同粒径的金纳米粒子分别与两种特定富含胞嘧啶(C)序列的核酸偶联得AuNPs10nm-DNA1和AuNPs25nm-DNA2，银离子的加入，使AuNPs10nm-DNA1和AuNPs25nm-DNA2产生C-Ag+-C错配识别，利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下AuNPs10nm-DNA1和AuNPs25nm-DNA2及银离子反应形成二元组装体，二元组装体的形成可以导致等离子手性的产生，金纳米粒子在可见光区产生圆二光谱CD信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定银离子含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，达到国际领先水平。
文档编号G01N21/19GK102890061SQ20121038576
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者胥传来, 许宙, 王利兵, 匡华, 徐丽广, 马伟, 刘丽强 申请人:江南大学