专利名称：一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒的制作方法
一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种诊断疾病的试剂盒，具体地，涉及一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒。
背景技术：
自身免疫是机体免疫系统对自身抗原发生反应，产生自身抗体和自身应答T细胞。在正常生理状态下，自身免疫可以及时清除衰老死亡的自身细胞，维持内环境的稳定。 在某些病理的状态下，可能会产生直接和间接的破坏自身组织的自身应答性T细胞和自身抗体，并引起相应器官组织的病变和功能障碍，称为自身免疫性疾病(Autoimmune disease ，AID)。常见的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、多发性皮炎/肌炎、混合性结缔组织病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病、慢性肝病等。
AID的临床表现复杂多变，在临床上常造成漏诊和误诊；疾病常慢性迁延，进行性加剧，最后造成不可逆的器质性或功能损害，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。而 AID的早期诊断和治疗将显著的控制病情发展，使病人的生活质量显著提高，可像正常人一样生活。
自身抗体检测对与自身免疫疾病的诊断和治疗监测都有重要意义，很多自身抗体已经被写入了 AID诊断的国际标准,其中最重要的是抗核抗体(antinuclear antibodies, AM)。ANA是抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称，本专利包含了常见抗核抗体的靶成分共 17 种:dsDNA、核小体、SmD I、核糖体 PO 蛋白、组蛋白、UI snRNP、Ro/SS-A (52KD)、Ro/SS-A (60 KD)、La/SS-B、Sc I-70、CENP-B, Jo_l、ΑΜΑ-Μ2、PM-Sc I, PCNA, Mi-2 和 Ku。这些自身抗体均是常见的有明确临床意义的。目前国内外还没有同时检测17种抗核抗体的诊断试剂。
对于自身免疫疾病诊断方法多采用间接免疫荧光分析法(IFA)、酶联免疫吸附法 (ELISA)和免疫印迹，但各有其不足。间接免疫荧光分析法是检测自身抗体的常用技术。其实验基质为Hep-2细胞或不同灵长类肝脏组织冰冻切片，含有完整的抗原谱，适合筛查试验。但是有如下缺点不能作为确诊依据；结果的判断需要有丰富的经验；滴度的意义大于核型，但滴度的判定主观性强；灵敏度较低，特异性也不高。
酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高，可作为筛选实验，也可作为确诊依据，还可定量测定，检测病情和治疗效果。但一次试验只能检测单一指标，通量低，检测成本较高， 在自身免疫疾病的诊断应用推广方面存在着极大的局限性。Western blot(WB)是在凝胶电泳和免疫分析技术基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性的优点，比较适合发现未知的抗体。而对于检测已知的抗体，由于使用了天然的混合抗原，实验过程中经常出现找不到目标条带和条带偏移的问题， 给结果的判读造成了不少困难，极易误判和漏判。同时WB使用时间长，也不适合在临床检验中推广。有人将WB改进，直接将纯化抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后进行免疫反应检测抗体，形成了改良的免疫印迹方法。目前已有同时检测15个自身抗体的膜条，通过将纯化抗原平行包被到硝酸纤维膜，封闭非特异性反应区。在第一次温育时，已稀释的血清与检测膜条反应，不同的样本或质控在不同的孵育槽间进行。如果样本阳性，特异性的IgG (也包括IgA和IgM)与相应抗原结合。为检测已结合的抗体，加入酶标抗人IgG (酶结合物)进行第二次温育，然后加入酶底物，孵育显色，加入终止液，结果判读。优点是可实现高通量的检测，由于使用了纯化抗原，特异性和灵敏度比传统的Western blot高了不少。
对于现有的试剂盒，存在下述缺点I、所检测的抗体仅有15个，并且某些抗原为早期研究的成果，目前已有新的更有意义的靶抗原。
2、所使用的纯化抗原多为从天然组织中提取，纯度的不足O 90%)依然影响了检测的灵敏度和特异性。
3、膜条背景深，有时比阳性条带还要深，影响了结果的可靠性。
4、不同的抗原条带宽度不一，条带间隔不一，影响了结果的准确判读。
5、同类产品如CN200810132304. 8公开的试剂盒，没有临界质控带，结果的判读需要另做一个对照膜条，增加了实验的成本，同时由于槽与槽之间反应环境存在一定的差异， 可能造成假阳性或假阴性。目前有的相关产品也有临界质控带，但一条质控带只能对一个检测条带或项目的结果进行判读，目前尚没有用一个临界质控带同时对两个乃至更多的条带进行判读的应用。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，该试剂盒的质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带起到判读的作用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由dsDNA、核小体、SmDl、核糖体 PO 蛋白、组蛋白、Ul snRNP、Ro/SS-A(52KD)、Ro/SS-A(60 KD)、La/SS-B, Scl-70、CENP-B, Jo-l、AMA-M2、PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。
该方法中，功能质控线属于现有技术，其目的是用于判断该膜条的一次反应是否有效，步骤I)的阴性和步骤4)的阳性是相对抗原条带中的抗原而言的，具有这些抗原所能检测的抗体为阳性，不具有这些抗原所能检测的抗体为阴性。本方案的抗原条带中都每个抗原都彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成一个独立的抗原检测线，这些所有的抗原检测线统称为抗原条带，步骤I中的“取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值”，这里的灰度值为每一个抗原检测线检测样品后扫描得到的灰度值。本方案的发明点在于临界质控带同时为抗原条带中的至少两个抗原的对照条带；通过设置了一个可以同时对两个乃至更多的检测条带(抗原条带)起到判读的临界质控带，随着检测条带的增多，每增加一条被检测条带，都要对重新进行完整的临界质控值确定实验，同时实验难度显著加大。通常，确定一个临界质控值需要许多次实验，才能最终确定。
所述临界质控带的成分为20ng 20y g/mL的人IgG。现有技术中有选用抗羊IgG作为对照线的记载，如CN200810132304. 8中，但是该专利中的每一个抗原条带上都需要划一个抗羊IgG的对照线，这样制作工艺比较比较繁琐，而且成本较高，在CN200810132304. 8 中，没有关于同一对照线可以用于2个或者2个以上的抗原条带判读的记载。本发明通过创造性实验发现，选择一定浓度范围的人IgG作为临界质控带，可以清楚、准确的对2个或者2个以上的抗原条带进行判读。
作为优选,所述临界质控带的成分为200ng 2y g/mL的人IgG。
所述临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤1)选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有η个抗原，取膜条对每一个样本进行检测， 扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到η组数值，分别计算这η组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp= (MP+2XSDP)，m、η、ρ均为自然数且m彡120， n^2,n^p^l ;2)将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值M、标准差SD、变异系数CV ;3)如CV ( 10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中C0=(M+2XSD); 如CV > 10%，调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)重新测定，直至CV ( 10% ；4)选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证；如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)、步骤3)重新确定膜条的临界质控值CO。在确定临界质控值的方法中，样本数量和抗原个数可以根据实验要求进行选择。
根据已经确定的膜条的临界质控值，来调节临界质控带包被人IgG的浓度。具体确定方法为将一定浓度的人IgG溶于Tris或H印es缓冲液中，然后划线于硝酸纤维素膜上制备成成品膜条，且膜条上仅包被临界质控带；随机选取30个膜条用本试剂盒进行检测，并扫描灰度，计算30次测定的均值Ms、标准差SDs和变异系数CVS，其中CVs=Ms/SDs。临界质控带合格的标准为1)0. 97XC0 ^ Ms ^ I. 03XCO ；2)CVs < 5%;如果不符合其中的任意一个，则需重新调整浓度进行本步骤所述的所有实验，直至得到合格的临界质控带，此时的人IgG包被浓度即为临界质控带的包被浓度。最终确定临界质控带的包被浓度和包被工艺。根据确定的膜条的临界质控值，技术人员通过本领域的常规技术手段，可以换算出合适的人IgG的浓度，采用现有的包被工艺，即可制备临界质控带。
所述酶标液为辣根过氧化物酶标记的羊/鼠/兔抗人IgG抗体。
所述底物为质量百分比浓度为O. 02%-2%的鲁米诺或质量百分比浓度为O.002%-0. 2%的过氧化氢构成的单一试剂。
所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间间隔等宽。
所述抗原条带宽度为O.相邻抗原条带之间间隔为2mm-20mm。
所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、干燥综合症、系统性硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎、重叠综合征。
所述核糖体PO 蛋白、Ul snRNP、Ro/SS-A(52KD)、La/SS-B、Scl-70、CENP-B、Jo-1、 PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku由昆虫细胞sf9表达并纯化制得；dsDNA、核小体、组蛋白、Ro/SS-A(60 KD)和AMA-M2是从天然组织中提取制得；SmDl是人工合成的多肽。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是I、本发明具有独创性的临界质控带，一个临界质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带(抗原条带)起到判读的作用，将显色条带与临界质控带的颜色的深浅比较即可判断结果阳性颜色比临界质控带相同或深；阴性颜色比临界质控带浅。
2、本发明还改良了单试剂底物，加入底物后不需终止。
3、每个抗原条带宽度均一，条带间隔等宽，膜条背景干净，使结果判定更加简单可O
图I是现有膜条的结构示意图；图2是本发明膜条的结构示意图；图3是临界质控值确定流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅限于下述实施例。
实施例I :参见图I至图3所示，图2中的CO质控线即为临界质控带；本实施例的检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，其中酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液的选择和范围都属于现有技术，对于酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液而言，选用现有技术的产品也可以实现本发明的技术方案。
膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由 dsDNA、核小体、SmDI、核糖体 PO 蛋白、组蛋白、Ul snRNP、Ro/SS-A (52KD)、Ro/SS-A (60 KD)、La/SS-B、Scl-70、CENP-B、Jo-l、AMA-M2、PM-Scl、PCNA、Mi-2 和 Ku 中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成，本实施例的临界质控带的成分为20ng 20y g/ mL的人IgG0
本试剂盒创造性的加入了能同时最多对17个被检抗体(抗原条带)进行阴阳性判定的临界质控带。具体的流程见图3的流程图所示。临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤1)选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有η个抗原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到η组数值，分别计算这η组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、 η、P均为自然数且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ;2)将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值Μ、标准差SD、变异系数CV ；3)如CV( 10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)重新测定，直至CV ^ 10% ；4)选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证； 如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)、步骤3) 重新确定膜条的临界质控值CO。
总的来说，临界质控值的确定有两个关键点，第一是17个条带的灰度上限的CV不能超过10%，否则需要重新调整相应抗原的印迹浓度后再进行实验。第二是用阳性样本来验证临界质控带，如果两次实验某个样本的灰度都小于临界质控值，那么需要重新做整个实验。并且随着检测条带的增多，每增加一条被检测条带，都要对重新进行完整的临界质控值确定实验，同时实验难度显著加大。通常，确定一个临界质控值需要许多次实验，才能最终确定。
实施例2 本实施例是对由dsDNA、核小体、SmDU核糖体PO蛋白、组蛋白、Ul snRNP、Ro/ SS-A (52KD)、Ro/SS-A (60 KD)、La/SS-B, Scl-70、CENP-B、Jo-I、AMA-M2、PM-Scl、PCNA, Mi-2 和Ku这17个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成的抗原条带进行试验测定。 在实施例I的基础上，为了使结果判定更加简单可靠，将每个抗原条带宽度均一设置，条带间隔等宽，抗原条带宽度为O.相邻抗原条带之间间隔为2mm-20mm,膜条背景干净，并且采用改良的单试剂底物，加入底物后不需终止，底物为鲁米诺O. 02%-2%或过氧化氢O. 002%-0. 2%构成的单一试剂；所有的印迹抗原都是高度纯化的，且采用了国际最新的包被工艺，具体包被方法见后述。
临界质控值的确定I)确定各抗体的临界质控值随机选取临床确诊为阴性的新鲜血清、血浆标本125份，用本实施例的试剂盒检测。测定其抗原条带所检测的相应抗体的灰度值，计算125份标本中各相同抗体的灰度值均值Mp 和标准差SDp，可得到每个抗体95%的置信上限(MP+2XSDP)，即为各抗体的临界质控值，记作C0P。结果见下表,本实施例m=125, n=p=17。
权利要求
1.一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，其特征在于，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由dsDNA、核小体、SmDl、核糖体PO蛋白、组蛋白、Ul snRNP、Ro/ SS-A (52KD)、Ro/SS-A (60 KD)、La/SS-B、Sc I-70, CENP-B, Jo-I、ΑΜΑ-Μ2、PM-Scl、PCNA, Mi-2 和Ku中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。
2.根据权利要求I所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带的成分为20ng 20y g/mL的人IgG。
3.根据权利要求I所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带的成分为200ng 2y g/mL的人IgG。
4.根据权利要求I至3任一项所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤1)选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有η个抗原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到η组数值，分别计算这η组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、 η、P均为自然数且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ;2)将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值Μ、标准差SD、变异系数CV ；3)如CV( 10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)重新测定，直至CV ^ 10% ；4)选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证； 如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤I)、步骤2)、步骤3) 重新确定膜条的临界质控值CO。
5.根据权利要求4所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带确定方法为根据确定的膜条的临界质控值调节临界质控带包被人 IgG的浓度。
6.根据权利要求I至3任一项所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述底物为质量百分比浓度为O. 02%-2%的鲁米诺或质量百分比浓度为O.002%-0. 2%的过氧化氢构成的单一试剂。
7.根据权利要求I至3任一项所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间间隔等宽。
8.根据权利要求7所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒,其特征在于，所述抗原条带宽度为O.相邻抗原条带之间间隔为2mm-20mm。
9.根据权利要求I至3任一项所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、干燥综合症、 系统性硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎、重叠综合征。
10.根据权利要求I至3任一项所述的一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述核糖体 PO 蛋白、Ul snRNP、Ro/SS-A (52KD)、La/SS-B, Sc I-70、CENP-B、 Jo-I、PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku由昆虫细胞sf9表达并纯化制得；所述dsDNA、核小体、组蛋白、Ro/SS-A (60 KD)和AMA-M2是从天然组织中提取制得；所述SmDl是人工合成的多肽。
全文摘要
本发明涉及一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒。该试剂盒包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由dsDNA、核小体、SmD1、核糖体P0蛋白、组蛋白、U1snRNP、Ro/SS-A(52KD)、Ro/SS-A(60KD)、La/SS-B、Scl-70、CENP-B、Jo-1、AMA-M2、PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。本发明具有独创性的临界质控带，一个临界质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带(抗原条带)起到判读的作用，结果判定更加简单可靠。
文档编号G01N33/558GK102937648SQ201210456019
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者李想, 周帅, 何涛涛, 陈洪, 郑丽, 陈卫, 陈川 申请人:四川省新成生物科技有限责任公司