专利名称：口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及检测口蹄疫病毒(FMDV)多种非结构蛋白抗体的斑点印迹(Dot-blot)检测试剂盒及方法(FMD NSP B-ELISA)，属于生物技术领域。
背景技术：
口蹄疫作为OIE及我国认定的必需通报的烈性传染病，已经对世界各国造成了巨大的经济损失。在口蹄疫诊断中，区分自然感染动物和免疫动物是一项十分重要的内容，鉴别免疫动物和自然感染动物也是OIE判定一个国家有无FMD流行的依据。非结构蛋白(NSP)抗体ELISA是近几年来研究较多的不依赖于血清型的感染状况检测评估方法，已有的研究数据表明，动物在感染后5 10天即可产生NSP抗体，非免疫感染动物较免疫感染动物检测到的NSP抗体阳性率更高。目前，已经有多种检测NSP抗体的方法被广泛应用，多数方法是基于检测3ABC抗体的ELISA方法。研究发现检测FMDV NSP2C蛋白的抗体同样也是指证动物感染的有效指标，且2C抗体的产生时间较早，位于2C蛋白N-端和C-端的B细胞抗原表位肽段，可以用于鉴别疫苗免疫动物与自然感染动物；同样检测3A、3B、3D NSPs抗体也可以进一步佐证动物是否感染口蹄疫病毒，通过检测多种NSP抗体，可以进一步提高感染与免疫动物鉴别诊断的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体的斑点印迹(Dot-blot)试剂盒及方法。本发明技术方案如下一种口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测试剂盒，包括五种NSP印迹膜条、血清稀释液、25 X浓缩PBST洗涤液、膜显色底物溶液、100 X浓缩酶标检测抗体、阳性对照血清和阴性对照血清以及20孔血清稀释板。所述五种NSP印迹膜条，为真空转印包被了五种非结构蛋白的聚偏氟乙烯膜，这五种非结构蛋白包括3A、3B、2C表位区、3ABC与3D蛋白；所述血清稀释液含10%马血清，O. 25%酪蛋白，I %海藻糖，O. 01%硫柳汞的O. OlM磷酸盐(PBS)溶液；所述25X 浓缩 PBST 洗涤液500mL超纯水中加 NaCl 200g、KCl 5g、Na2HPO4 · 12H2072. 5g、KH2PO4 5g和12. 5mL吐温20，补超纯水定容至IOOOmL, pH为7. 4，高压灭菌，室温存
放备用；所述膜显色底物溶液为单组份膜显色3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)底物；所述100X浓缩酶标检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛、羊、猪免 疫球蛋白G(IgG)的抗体，通过将HRP酶标抗体稀释于抗体保存液中制备；所述阳性对照血清采自口蹄疫病毒感染后I 3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；所述阴性对照血清采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测方法(Dot-blot方法)，包括以下步骤Al、将血清I : 100稀释于20孔血清稀释板，Iml血清稀释液中加血清20 μ 1，放入相应印迹膜片，37°C摇振作用Ih ；A2将膜用I X PBST洗涤液洗膜3次，每次浸泡约Imin ；A3用血清稀释液稀释酶标抗体于直径60mm平皿内，放入反应膜条，37°C摇振作 用lh，同前洗涤；A4换新的平皿，加入适量膜显色底物，避光摇振显色约5 IOmin ；A5用去离子水冲洗终止反应，眼观判定结果；A6试验成立的条件阳性对照5点显色，阴性对照没有显色；A7结果判定有4或5点显色的血清为非结构蛋白抗体阳性，没有斑点显色或有I 3点显色判为非结构蛋白抗体阴性。利用大肠杆菌表达并纯化获得的高纯度口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B、2C、3ABC和3D，将5种蛋白抽真空印迹于PVDF膜，制成有五个圆形斑点的印迹膜条，以此膜条为材料建立了一种检测口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体的斑点印迹检测方法。使用该方法检测了背景清楚的牛、羊与猪血清，最终确定，检测的牛、羊与猪血清在印迹膜上没有斑点显色或有1-3个斑点显色时为非结构蛋白抗体阴性，有4或5个斑点显色时为非结构蛋白抗体阳性。根据此标准对牛血清检测的特异性在98%以上，敏感性在96%以上；与3ABC-ELISA方法的总符合率达98. 5%，与PrioCHECK FMDV-NS ELISA方法的总符合率达99. 5%。采用本法检测，最终显色结果通过肉眼就可以判定，不需要用仪器进行测定。通过检测5种非结构蛋白抗体，提高口蹄疫病毒感染动物与免疫动物鉴别诊断的准确性，可以作为3ABC-ELISA检测可疑与阳性血清样本的确认检测方法，与之配套使用，形成了完整的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测方法体系。
图I为SDS-PAGE (A)与Western blot (B)分析纯化的五种非结构蛋白的纯度与活性。I 5泳道分别显示纯化的3A、3B、2C表位区、3ABC与3D蛋白的结果；M泳道显示标准分子质量标准对照。图2为对7头牛与I头猪感染后连续采集血清样本的对比检测结果.其中图A为7头牛血清3ABC-ELISA检测结果，图B为7头牛血清PrioCHECK NS ELISA检测结果，图C为7头牛血清Dot-blot检测结果，图D为来自I头感染猪的16份样本用三种方法的检测结果。图3为Dot-blot检测12份参考血清(A)与部分感染动物与正常动物血清结果(B). P、WP与N分别显示阳性对照、弱阳性对照与阴性对照血清的检测结果，S457 S468为12份来自世界口蹄疫参考实验室的牛血清的检测结果，I 4号为4头牛感染后10天采集血清的检测结果，5 7显示3头未免疫健康牛的结果，8 10为3头免疫健康牛血清的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。I材料与方法I. I 材料碳酸盐缓冲液(Na2C03/NaHC03)及明胶购自Sigma公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司。标准对照血清和其他相关试剂均由国家口蹄疫参考实验室购买。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司，膜显色底物溶液购自美国SurModics公司，HRP标记免抗牛、羊和猪IgG酶标抗体购自Sigma公司。PrioCHECK FMDV-NS ELISA试剂盒为Prionics公司产品(Schlieren-Zurich, Switzerland),是一种国外研制的阻断ELISA试剂盒，3ABC-ELISA试剂盒为本实验室研制的产品，已经获得新兽药证书并上市销售。I. 2血清样本阴性与阳性对照血清样本阴性对照血清采自临床健康的非口蹄疫免疫动物，包括牛、羊与猪阴性对照血清，经检测口蹄疫O、A、Asial型病毒液相阻断ELISA抗体效价小于I : 4，3ABC间接ELISA抗体为阴性。阳性对照血清采自O型或Asial型口蹄疫病毒感染康复后1-3个月的动物，包括牛、羊与猪阳性对照血清，经检测O型或Asial型抗体效价大于I 360 ;经检测3ABC抗体为强阳性。感染动物血清包括51份牛血清采自Asial型FMDV攻毒感染后10天，70份牛血清来自7头牛于A型FMDV感染后O 229天采血；38份猪血清采自O型或Asial型FMDV攻毒感染后11天，16份猪血清采自I头猪于O型FMDV感染后O 192天采血。健康动物血清30份猪血清来自非免疫健康猪,经检测液相阻断ELISA检测O型与Asial型抗体为阴性；34份猪血清来自免疫2次的健康猪。30份牛血清来自非免疫健康牛，经检测O型与Asial型抗体为阴性；12份血清来自O型与Asial型双价苗免疫牛。参考血清样本12份牛血清来自世界口蹄疫参考实验室(WFMDRL)，血清背景与检测结果见后表。I. 3非结构蛋白3ABC、3D、3A、3B与2C表位区融合蛋白的表达、纯化及复性；参考以下文献曹轶梅，刘在新，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达·畜牧兽医学报，2004，35 (I) :115-118。曹轶梅，卢曾军，刘在新，等.大肠埃希氏菌表达FMDV 3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测.中国兽医科技，2003，33 (8) :22-25。付元芳，卢曾军，田美娜，等.口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因主要表位区的表达及活性检测·畜牧兽医学报，2008，39 (9)。付元芳，卢曾军，曹轶梅，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测.微生物学报，2008，48 ￠) :790 795。I. 4五种非结构蛋白的绝对定量
用Bradford蛋白质定量试剂盒(碧云天公司)测定纯化非结构蛋白3A、3B、2C、3ABC与3D的浓度，具体方法按试剂盒说明书进行操作。纯化蛋白的浓度定量至I. 6mg/mL,加50%无菌甘油保存于-70°C。1.5五种非结构蛋白最适膜印迹工作浓度的确定将纯化的五种非结构蛋白系列稀释包被96孔酶标板，采用间接ELISA方法对比检测I 100稀释(体积比例稀释，下同)的牛、羊与猪的阴、阳性对照血清；以阳性对照血清0D450值减去阴性对照血清0D450值约为2. O时的抗原包被浓度为单位抗原印迹浓度。分别将五种贮存抗原以单位抗原印迹浓度、2、3和4倍单位抗原印迹浓度稀释于碳酸盐缓冲液，按下节所述方法制备印迹膜，分别检测阴性与阳性对照血清以及质控血清，阳性血清与弱阳性血清有4条或者5条带显色，而阴性对照血清不显色的抗原包被浓度为最适膜印迹工作浓度。1.6五种非结构蛋白(NSP)印迹膜条的制备将PVDF(MiIIipore产品)膜裁剪为6X9cm规格，浸泡于O. 01mol/L, PBS缓冲液(pH 7.4)中3-5min，用超纯化水漂洗5min，取出后甩干水分，置于37°C温箱中干燥 IOmin0将处理过的PVDF膜正面向上置于96孔真空转印仪(Biometra)，将纯化好的3A、3B、2C、3ABC与3D蛋白用O. 05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9. 6)稀释至最适膜包被工作浓度，各取100 μ I分别加入五个孔；以150mbar压力抽真空约30min,使孔内液体抽干,取下膜，用PBST洗液漂洗3次，然后浸入含5% (作为浓度的百分比例为重量百分比，下同)脱脂奶粉的PBST液中37°C封闭60min。然后用PBST洗液漂洗3次，将膜控干后，放入蛋白稳定剂(美国SurModics)中作用5min,抽干或自然干燥；将膜切为宽O. 6cm、长4. 5cm的膜条，正面右上角切角标记，加干燥剂用铝箔袋密封包装，4°C保存备用。I. 7最佳血清稀释度的确定用最适抗原印迹浓度的五种非结构蛋白制备印迹膜条，将阳性和阴性对照血清分别按I 50,1 100,1 200倍稀释，酶标抗体采用推荐在Dot-blot工作浓度(I 8000)，进行Dot-blot检测，选择阳性对照斑点显色清晰可见，而阴性对照血清不显色的血清稀释度为最佳血清稀释度。I. 8最佳酶标抗体工作浓度的确定参考推荐在Dot-blot工作浓度(I 8000)，用血清稀释液系列稀释酶标抗体(I 4000、I 8000、I 12000)，同时用3么、38、2(、348(与30五种蛋白的最适印迹浓度制备印迹膜条，采用Dot-blot方法检测阴、阳性对照血清，确定最佳酶标抗体工作浓度。以能使阳性对照五个蛋白印迹点均清晰显色的最高酶标抗体稀释度为最佳酶标抗体工作浓度。1.9最佳反应温度与作用时间最佳反应温度选择37°C，待测血清与抗原包被膜、以及酶标抗体的作用时间均选择60min，以保证反应的敏感性。膜显色底物作用时间按底物推荐的作用时间与温度进行。I. 11 Dot-blot 的操作流程(I)与待检血清作用用油性圆珠笔在检测线上方将膜编号，用血清稀释液将待检血清及阴、阳性对照血清I : 100稀释于20孔血清稀释板中，将单个膜浸入对应的孔中，37°C作用60min。然后用I XPBST洗涤液洗膜3次，每次浸泡约lmin。(2)与酶标抗体作用用血清稀释液配制IX酶标抗体溶液于平皿中，加入膜条，37 °C摇振作用60min，同前洗涤3次。(3)加底物显色更换新的平皿，加入适量膜显色底物溶液，将印迹膜浸入底物溶液中，37°C避光显色5 lOmin，待阳性对照血清出现明显斑点后，用去离子水或蒸馏水漂洗2次终止反应，取出膜自然干燥，观察并记录结果，膜条还可避光保存。(4)试验成立的条件凡在包被抗原点出现明显规则棕色斑点者判为斑点显色阳性(+)，不出现明显可见斑点者判为斑点显色阴性(_)。阳性对照应出现4 5个斑点，阴性对照无斑点；若阳性对照出现4个以下斑点或不出现斑点者，判为无效。I. 12 Dot-blot判定标准的确定通过检测已知背景的牛和猪的阴、阳性血清，根据能阴、阳性血表所显斑点数的情况，确定FMDV非结构蛋白抗体的阳性判定标准。I. 13本方法的特异性和敏感性检测根据确定的判定标准，共对195份来自免疫或非免疫健康动物的阴性血清样本与 感染动物血清样本的检测结果进行分析，确定本方法对阴性样本检测的特异性和对感染动物血清样本检测的敏感性。I. 14同类试剂盒的符合率对比试验分别用PrioCHECK FMDV-NS ELISA试剂盒、3ABC-ELISA试剂盒及本方法检测以下血清样品牛血清样品30份健康非免疫牛血清，采自无口蹄疫区；12份健康免疫牛血清，51份FMDV试验感染牛血清(攻毒后IOd) ;12份牛血清来自世界口蹄疫参考实验室。猪血清样品34份健康非免疫猪血清，30份健康免疫猪血清，38份FMDV试验感染猪血清(攻毒后15天)。2试验结果2. I纯化蛋白定量结果用Bradford蛋白质定量试剂盒进行纯化蛋白浓度的测定。按BSA标准液的OD值绘制BSA浓度标准曲线，根据标准曲线计算出五种非结构蛋白的浓度分别为，3A I. 6mg/mL、3B 2. 4mg/mL、2C 2. 3mg/mL、3D 2. lmg/mL 和 3ABC 2. 4mg/mL。2. 2 Dot-blot最适抗原印迹包被量结果显示，3A、3B、2C、3ABC与3D分别以2、3、3、4和3倍的单位抗原印迹浓度转印时效果最佳，阳性血清可显示清晰的斑点，而阴性对照血清不显色。3A、3B、2C、3ABC与3D五种蛋白的最适印迹浓度分别为0. 4,0. 6,0. 6,0. 8,0. 6 μ g/ml ο五种纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图与Western blot检测结果见图I。2. 3 Dot-blot血清最佳稀释度的确定结果表明，血清进行I : 100稀释时阳性斑点清晰，而阴性对照未显色，从而确定血清抗体的最适工作浓度为I : 100。2. 4 Dot-blot结果判定标准的确定根据12份参考血清、86份感染动物血清(70份血清来自7头感染牛，16份血清来自I头感染猪)的检测结果来确定五种非结构蛋白抗体Dot-blot的判定标准，同时与PrioCHECK FMDV-NS ELISA与3ABC-ELISA检测结果对比，结果如图2A-D所示。从图2A-C可以看出，7头牛感染前与感染后4天采集的14份血清中，只有PrioCHECK NS ELISA检出I份阳性，其他两种方法均没有阳性反应；感染后第8天，3ABC-ELISA与PrioCHECK NSELISA均检测出3份阳性，而Dot-blot也有3份血清样本出现5个阳性反应点，其他4份血样出现O 3个阳性反应点；到感染后22 229天采集的血清样本，所有样本均出现5个阳性反应点；而到感染的后期3ABC-ELISA与PrioCHECK NS ELISA均检出阴性结果如图2A与2B。对来自I头感染猪的16份血清的检测结果，Dot-blot与PrioCHECK NS ELISA结果一致，而3ABC-ELISA以临界值O. 2判定时出现4份阴性结果(图2D)。同时参考对12份参考血清的检测结果(表I与图3)，确定了 Dot-blot方法的判定标准为出现四种或四种以上蛋白印迹斑点显色者，判为非结构蛋白抗体阳性；有两种或两种以上的蛋白斑点没有显色者判为阴性。表I. 12份来自世界口蹄疫参考实验室牛血清样本的对比检测结果
权利要求
1.一种ロ蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测试剂盒，其特征在于，包括五种NSP印迹膜条、血清稀释液、25X浓缩PBST洗涤液、膜显色底物溶液、100X浓缩酶标检测抗体、阳性对照血清和阴性对照血清以及20孔血清稀释板； 所述五种NSP印迹膜条，为真空转印包被了五种非结构蛋白的聚偏氟こ烯膜，这五种非结构蛋白包括3A、3B、2C表位区、3ABC与3D蛋白； 所述血清稀释液含10 %马血清，O. 25 %酪蛋白，I %海藻糖，O. OI %硫柳汞的O. OIM磷酸盐溶液； 所述 25X 浓缩 PBST 洗涤液500mL 超纯水中加 NaCl 200g、KCl 5g、Na2HPO4 · 12H2072. 5g、KH2PO4 5g和12. 5mL吐温20，补超纯水定容至IOOOmL, pH为7. 4，高压灭菌，室温存 放备用； 所述膜显色底物溶液为单组份膜显色3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺底物； 所述100X浓缩酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛、羊、猪免疫球蛋白G的抗体，通过将HRP酶标抗体稀释于抗体保存液中制备； 所述阳性对照血清采自ロ蹄疫病毒感染后I 3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备； 所述阴性对照血清采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测ロ蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。
2.ロ蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤 Al、将血清I : 100稀释于20孔血清稀释板，Iml血清稀释液中加血清20 μ 1，放入相应印迹膜片，37°C摇振作用Ih ； A2将膜用I XPBST洗涤液洗膜3次，每次浸泡约Imin ； A3用血清稀释液稀释酶标抗体于直径60mm平皿内，放入反应膜条，37°C摇振作用lh，同前洗涤； A4换新的平皿，加入适量膜显色底物，避光摇振显色约5 IOmin ； A5用去离子水冲洗终止反应，眼观判定結果； A6试验成立的条件阳性对照5点显色，阴性对照没有显色； A7结果判定有4或5点显色的血清为非结构蛋白抗体阳性，没有斑点显色或有I 3点显色判为非结构蛋白抗体阴性。
全文摘要
本发明公开了口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测试剂盒及方法，包括五种NSP印迹膜条、血清稀释液、25×浓缩PBST洗涤液、膜显色底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、阳性对照血清和阴性对照血清以及20孔血清稀释板；同时检测五种NSP抗体，可以进一步提高口蹄疫感染动物与免疫动物鉴别诊断的准确性，本方法可以作为3ABC抗体检测阳性与可疑动物的确认诊断方法，具有较高的敏感性与特异性，适于检测牛、羊与猪三种易感动物血清。
文档编号G01N33/68GK102662063SQ201210122698
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者付元芳, 刘在新, 刘湘涛, 包慧芳, 卢曾军, 孙普, 曹轶梅, 李冬, 李平花, 白兴文, 谢宝霞, 陈应理 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所