一种人体血清Aβ的定量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种人体血清Aβ的定量检测方法，依次包括如下步骤：a)采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；b)所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，得反应结合物；c）所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。本发明方法提高了Aβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群,以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究。
【专利说明】一种人体血清Aβ的定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种人体血清A β的定量检测方法。
【背景技术】
[0002]Αβ (Amyloid peptide简称Αβ )是淀粉样前体蛋白经蛋白酶水解而产生的代谢产物。在正常脑细胞内有较少量的本底水平。但在病理条件下包括遗传淀粉样前体蛋白和水解酶基因突变以及环境污染或化学致癌物的作用可引起Αβ产物增加而导致Αβ的增高。Αβ增高和聚集在脑内形成老年斑，最终破坏脑记忆功能导致失智或老年性痴呆。因此Αβ作为老年学痴呆病的生物标记物是目前致力于开发的唯一检测方法。
[0003]由于Αβ是目前老年性痴呆病的关键致病因子和能反映病理发展过程的重要标志，国内外多年来一直致力于研究有效的Αβ检测方法和开发检测试剂盒，国内市场目前基本上是引进国际市场现有的Αβ检测试剂盒进行检测，近年来美国出售的Αβ检测试剂盒灵敏度较低，检测灵敏度的标准范围不适应亚洲人群，而且不能满足Αβ水平在疾病早期小幅升高的要求；目前日本市场出售的检测试剂盒灵敏度较高，但其价格不仅十分昂贵而且要求复杂的样本处理和特殊的检测技能；此外欧洲市场出售的Αβ检测试剂盒介于美国和日本，但存在着特异性不足，不够稳定和检测误差较大的弊病。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种人体血清Αβ的定量检测方法，能够结合亚洲人群的生物特性，提高A β检测灵敏度，简化样本处理及操作程序。
[0005]本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种人体血清Αβ的定量检测方法，依次包括如下步骤:a)采用试剂盒预先配置铺有抗A β肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Αβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；b)所述反应复合物与抗Αβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原一抗体反应，得反应结合物；c)所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
[0006]进一步地，所述步骤a)中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，所述十个试剂瓶和免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。
[0007]进一步地，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
[0008]进一步地，所述十个试剂瓶中分别装有:试剂1:人体Αβ淀粉样肽；试剂II =NaH2PO4H20.Na2HPO4 缓冲溶液；试剂 III =NaN3.Block Ace.PBS 溶液；试剂 IV:NaH2PO4H2O ^Na2HPO4溶液；试剂V:BSA和Block Ace粉末；试剂V1:兔抗人的Αβ检测抗体；试剂VI1:清洗免疫反应的平衡液；试剂珊:鼠抗兔的第二抗体；试剂IX =TMB显色反应溶液；试剂 X:peroxidase 溶液。[0009]进一步地，所述装有试剂V、试剂IX和试剂X的试剂瓶为棕色，其他试剂瓶为白色。
[0010]进一步地，所述试剂II 中 NaH2PO4H20.Na2HPO4 浓度为 20mM，EDTA 浓度为 2mM，NaCl浓度为 400mM，BSA、CHAPS、Block Ace 和 NaN3 浓度依次为 0.2%、0.05%,0.4% 和 0.05%，溶液pH值为7.0 ;所述试剂III中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液PH值为7.4 ;试剂IV中NaH2PO4H20.Na2HPO4浓度为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM、BSA浓度为1%，溶液pH值为7.0 ;所述试剂VII为NaCl、KC1、Na2HPO4.7H20和KH2PO4的混合液，pH值为7.4。
[0011]进一步地，所述试剂V中BSA和Block Ace两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace粉末使用用前分别溶解在试剂II和III的溶液中，所述BSA粉末使用前分别溶解在试剂II和IV的溶液中；所述试剂VI使用前溶于试剂IV的溶液中，并稀释至样本检测浓度；所述试剂VII的容量为250ml，使用前用双蒸水稀释I倍；所述试剂珊在使用用前在试剂IV的溶液中稀释至样本检测浓度。
[0012]进一步地，在采用所述试剂盒进行Αβ的定量检测之前先配置如下溶液:1)配制工作浓度的样本和标准品稀释液:取出冷藏的试剂II，将10倍的25ml试剂II稀释至250ml ;取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5g BSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀释后的试剂II中；2)配制工作浓度的缓冲基液:取出IOOml的IOxPBS加双蒸水至1L，检查pH值；3)配制封闭溶液:从试剂V中取出另一小管Ig的Block Ace粉末溶入试剂II溶到900ml的IxPBS再加IOOml的NaN3配制成IX的Block Ace封闭溶液；4)配制工作浓度的抗体稀释溶液:取出10X的25ml的试剂IV，加入2475ml双蒸水配成IX的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
[0013]进一步地，在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清A β进行定量检测，包括如下步骤:1)取出冷藏铺有Αβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温；2)准备定量检测Aβ的标准品:将试剂I的标准品Αβ溶于含有BSA和Block Ace的样本和标准品稀释液中；并将溶解液依次稀释至标准曲线的梯度浓度；3)准备待测样本:将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量；4)用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一稀释至一致浓度所需量；5)揭开免疫检测板的封闭膜，将工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板上的96孔反应小槽内；将々3不同稀释浓度的标准品依次加入相应的小孔后，再将一致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内；6)封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；7)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；8)加封闭溶液在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；9)取出冷藏的试剂VI，自然升至室温；工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至IOml ;10)加稀释的Αβ检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；11)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次；
12)取出冷藏的试剂珊的鼠抗兔的第二抗体，自然升至室温；用工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释；13)加稀释的A β检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育0.5-1.5小时；14)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；15)取出冷藏的的试剂IX和X，加温至37度；取试剂IX和试剂X均匀混合；加混合液至每个反应小槽内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂IX，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和Αβ的标准曲线确定样本中Αβ的含量。
[0014]进一步地,所述步骤I)中定量测定标准曲线的梯度浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml>15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/mlo
[0015]本发明对比现有技术有如下的有益效果:本发明提供的人体血清Αβ的定量检测方法，通过采用试剂盒预先配置铺有抗A β肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与血浆样本中Αβ进行捕获性免疫反应，然后与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Αβ抗体进行二次抗原一抗体反应，经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定；该方法结合亚洲人群的生物特性，提高了 Αβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序或提供外包服务来弥补国外现存试剂盒进行检测的缺点和不足，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群，以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究，操作者只要按照试剂盒说明书在使用时完成最后步骤的试剂配置，按设计的操作步骤实施将能检测包括血液，脑脊液，细胞培养液和脑组织提取液。简化了多种实验检测中的繁琐步骤，因此缩短了实验检测周期，节约财力物力和试验操作的时间，满足检测流程的简单化和检测结果的准确性。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供的人体血清Αβ的定量检测方法，依次包括如下步骤:
[0017]步骤S1:采用试剂盒预先配置铺有抗A β肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；
[0018]步骤S2:所述反应复合物与抗A β特定氨基酸序列的兔抗人的A β抗体进行二次抗原一抗体反应，得反应结合物；
[0019]步骤S3:所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
[0020]步骤SI中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，其中十个试剂瓶和96孔免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。较佳地，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
[0021]十个试剂瓶具体构成如下:
[0022]试剂瓶1:白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确称量的人Αβ淀粉样肽(Αβ40和42)标准品，其净重为Iug/管；用于标准曲线的绘制。此为试剂I。
[0023]试剂瓶2:白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaH2PO4H20.Na2HPO4缓冲溶液，用于样本和标准品的溶解和稀释，其中NaH2PO4H20.Na2HPO4为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl 浓度为 400mM，BSA、CHAPS、Block Ace 和 NaN3 浓度依次为 0.2%、0.05%,0.4% 和 0.05%,溶液pH值为7.0,容量为25ml (10X);此为试剂II。
[0024]试剂瓶3:白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaN3.Block Ace.PBS溶液，其中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值为
7.4，用于降低非特异性A β检测信号；此为试剂III。[0025]试剂瓶4:白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaH2PO4H2O -Na2HPO4的溶液。其中 NaH2PO4H20.Na2HPO4 为 20mM，EDTA 浓度为 2mM，NaCl 浓度为 400mM、BSA 浓度为 1%，溶液pH为7.0，25ml (IOX)，用于A β检测抗体浓度的配置；此为试剂IV。
[0026]试剂瓶5:棕色塑料瓶，瓶内封闭包装着准确重量的BSA和Block Ace粉末，两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace每管净重为lg，临用前分别溶解在试剂II和III的溶液中，BSA每管净重为0.5g，用于提高检测信号分辨率，使用前分别溶解在试剂II和IV的溶液中，此为试剂V。
[0027]试剂瓶6:白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确含量的兔抗人Αβ淀粉样肽抗体25ul，用于样本的二次抗原一抗体反应以增加检测的灵敏度，使用前溶于试剂IV的溶液中，稀释至合适的样本检测浓度；此为试剂VI。
[0028]试剂瓶7:白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比清洗免疫反应的平衡液(IOxPBS)即 NaCl, KC1、Na2HPO4.7H20、KH2PO4, pH 值为 7.4，250ml，使用前将用双蒸水稀释至IX (I倍)，此为试剂IX。
[0029]试剂瓶8:白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确含量的鼠抗兔的第二抗体25ul，用于放大检测的A β信号，使用前在试剂IV的溶液中稀释至合适的样本检测浓度；此为试剂珊。
[0030]试剂瓶9:棕色塑料瓶，瓶内封闭包装氧化还原反应的TMB溶液，可使第二抗体发生酶联反应，TMB溶液为25ml ;此为试剂IX。
[0031]试剂瓶10:棕色塑料瓶,瓶内封闭包装氧化还原反应的peroxidase (氧化酶)溶液，与TMB溶液反应可根据反应物呈现的显色程度量化样本抗原含量的测定，此为试剂X。
[0032]在采用试剂盒进行人体血清A β的定量检测之前先配置如下工作浓度溶液:
[0033]1.配制工作浓度的样本和标准品稀释液:取出冷藏的试剂II，将10倍的25ml试剂II稀释至250ml (IX);取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5g BSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀释后的试剂II中。
[0034]2.配制工作浓度的缓冲基液；取出IOOml的IOxPBS加双蒸水至1L，检查pH值。
[0035]3.配制封闭溶液:从试剂V中取出另一小管Ig的Block Ace粉末溶入试剂II溶到900ml的IxPBS再加IOOml的NaN3配制成IX的Block Ace封闭溶液。
[0036]4.配制工作浓度的抗体稀释溶液:取出10X的25ml的试剂IV，加入2475ml双蒸水配成IX的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
[0037]在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清A β进行定量检测，具体包括如下步骤:
[0038]1.取出冷藏铺有Αβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温。
[0039]2.准备定量检测Αβ的标准品:定量测定标准曲线的梯度浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/ml。将试剂 I的标准品A β溶于200ul含有BSA和Block Ace的样本和标准品稀释液中，将溶解液加入1.8ml配成1000pg/ml母液,取出Iml母液加Iml稀释液至500pg/ml,然后将250ul的500pg/ml加等量的稀释液依次稀释至标准曲线的梯度浓度。
[0040]3.准备待测样本:将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量;
[0041]4.用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一调整(稀释)至一致浓度所需量；
[0042]5.揭开免疫检测板的封闭膜，将25ul工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板的96孔反应槽内。将Αβ不同稀释浓度的标准品IOOul依次加入相应的反应槽后，再将IOOul —致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内；
[0043]6.封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
[0044]7.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
[0045]8.加IOOul封闭溶液在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
[0046]9.取出冷藏的试剂Α/ΚΑβ检测抗体)，自然升至室温。工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至IOml ；
[0047]10.加IOOul稀释的A β检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
[0048]11.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次；
[0049]12.取出冷藏的VDI抗体(鼠抗兔的第二抗体)，自然升至室温，工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至IOml ；
[0050]13.加IOOul稀释的Αβ检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育I小时；
[0051]14.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
[0052]15.取出冷藏的的试剂IX和X，水浴加温至37度，取5.5ml试剂IX和5.5ml试剂X均匀混合，加IOOul至每个反应小孔内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂IX，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和A β的标准曲线定量样本中的Αβ的水平。
[0053]综上，本发明提供的人体血清Αβ的定量检测方法，通过采用试剂盒预先配置铺有抗Αβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与血浆样本中Αβ进行捕获性免疫反应，然后与抗A β特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原一抗体反应，经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定；该方法结合亚洲人群的生物特性，提高了 Αβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序或提供外包服务来弥补国外现存试剂盒进行检测的缺点和不足，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群，以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究，操作者只要按照试剂盒说明书在使用时完成最后步骤的试剂配置，按设计的操作步骤实施将能检测包括血液，脑脊液，细胞培养液和脑组织提取液。简化了多种实验检测中的繁琐步骤，因此缩短了实验检测周期，节约财力物力和试验操作的时间，满足检测流程的简单化和检测结果的准确性。
[0054]虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种人体血清Αβ的定量检测方法，其特征在于，依次包括如下步骤: a)采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中A β进行捕获性免疫反应，得反应复合物； b)所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的A β抗体进行二次抗原一抗体反应，得反应结合物； c)所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
2.如权利要求1所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述步骤a)中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，所述十个试剂瓶和免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。
3.如权利要求2所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
4.如权利要求2所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述十个试剂瓶中分别装有:试剂1:人体Αβ淀粉样肽；试剂II =NaH2PO4H20.Na2HPO4缓冲溶液；试剂III:NaN3.Block Ace.PBS 溶液;试剂IV =NaH2PO4H20.Na2HPO4 溶液;试剂 V:BSA 和 Block Ace粉末；试剂V1:兔抗人的Αβ检测抗体；试剂Vn:清洗免疫反应的平衡液；试剂珊:鼠抗兔的第二抗体；试剂IX:ΤΜΒ显色反应溶液；试剂X:peroxidase溶液。
5.如权利要求4所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述装有试剂V、试剂IX和试剂X的试剂瓶为棕色，其他试剂瓶为白色。
6.如权利要求4所述的·人体血清Αβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂II中NaH2PO4H20.Na2HPO4 浓度为 20mM，EDTA 浓度为 2mM，NaCl 浓度为 400mM，BSA、CHAPS、BlockAce和NaN3浓度依次为0.2%、0.05%,0.4%和0.05%,溶液pH值为7.0 ;所述试剂III中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值为7.4 ;试剂IV中NaH2PO4H20.Na2HPO4 浓度为 20mM，EDTA 浓度为 2mM，NaCl 浓度为 400mM、BSA 浓度为 1%，溶液pH值为7.0 ;所述试剂VII为NaCl、KCl、Na2HPO4.7Η20和KH2PO4的混合液，pH值为7.4。
7.如权利要求6所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂V中BSA和Block Ace两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace粉末使用用前分别溶解在试剂II和III的溶液中，所述BSA粉末使用前分别溶解在试剂II和IV的溶液中；所述试剂VI使用前溶于试剂IV的溶液中，并稀释至样本检测浓度；所述试剂VII的容量为250ml，使用前用双蒸水稀释I倍；所述试剂珊在使用用前在试剂IV的溶液中稀释至样本检测浓度。
8.如权利要求7所述的人体血清Αβ的定量检测方法，其特征在于，在采用所述试剂盒进行Αβ的定量检测之前先配置如下溶液: 1)配制工作浓度的样本和标准品稀释液:取出冷藏的试剂II，将10倍的25ml试剂II稀释至250ml ;取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5gBSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀释后的试剂II中； 2)配制工作浓度的缓冲基液:取出100ml的IOxPBS加双蒸水至1L，检查pH值； 3)配制封闭溶液:从试剂V中取出另一小管Ig的BlockAce粉末溶入试剂II溶到900ml的IxPBS再加100ml的NaN3配制成IX的Block Ace封闭溶液；4)配制工作浓度的抗体稀释溶液:取出IOX的25ml的试剂IV，加入2475ml双蒸水配成IX的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
9.如权利要求8所述的人体血清Αβ的定量检测方法，其特征在于，在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清Αβ进行定量检测，包括如下步骤: 1)取出冷藏铺有Αβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温； 2)准备定量检测Aβ的标准品:将试剂I的标准品A β溶于含有BSA和BlockAce的样本和标准品稀释液中；并将溶解液依次稀释至标准曲线的梯度浓度； 3)准备待测样本:将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量； 4)用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一稀释至一致浓度所需量； 5)揭开免疫检测板的封闭膜，将工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板上的，96孔反应小槽内；将々3不同稀释浓度的标准品依次加入相应的小孔后，再将一致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内； 6)封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡，12-36小时； 7)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次； 8)加封闭溶液在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时； 9)取出冷藏的试剂VI， 自然升至室温；工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至IOml； 10)加稀释的Aβ检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡，12-36小时； 11)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次； 12)取出冷藏的试剂珊的鼠抗兔的第二抗体，自然升至室温；用工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释； 13)加稀释的Aβ检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育0.5-1.5小时； 14)用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次； 15)取出冷藏的的试剂IX和X，加温至37度；取试剂IX和试剂X均匀混合；加混合液至每个反应小槽内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂IX，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和A β的标准曲线确定样本中A β的含量。
10.如权利要求9所述的人体血清Αβ的定量检测方法，其特征在于，所述步骤I)中定量测定标准曲线的梯度浓度为 500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、，15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/mlo
【文档编号】G01N21/78GK103852579SQ201210516697
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】姚钧 申请人:姚钧