专利名称：一种影响骨骼矿化作用药物的筛选系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种影响骨骼矿化作用药物的筛选系统，特别涉及一种钙黄绿素为染剂的骨骼矿化作用药物的筛选系统，属于药物筛选技术领域。
背景技术：
由于科技文明的进步，男女平均年龄不断提高，老化的人口增加，使得骨质疏松症的患者逐渐增多。骨质疏松症为一种因骨质减少及骨密度降低使骨骼结构松散的疾病，患者骨骼脆弱易骨折。此类疾病常见于55岁以上的老年人及停经后的妇女，其原因为骨骼老化与停经后的妇女动情激素分泌停止，使得骨质大量流失。为了补充流失的骨质，多数人会摄取大量的钙质及维他命D，停经后的妇女会补充女性荷尔蒙(动情素和黄体素)，或是服用抑钙素抑制钙质流失。现今医学上常用的抗骨质疏松药物多为双磷酸盐类药物(如Alendronate, Ibandronate),其功用大多数是抑制骨质流失(蚀骨细胞)的速率，但促进其再吸收的药物则相当稀少。因此，如何以快速有效的活体平台及方法来筛选治疗的药剂，就成为此研究上一重要的指标。目前筛选抗骨质疏松药物的研究上，主要是利用⑴活体外细胞株(hMSCs)培养进行药物筛选分析，产生大量初步的结果。再利用(2)活体内啮齿类动物验证大量初步结果，但过程相当缓慢且耗费金钱，加上活体外细胞株验证并不能系统性地解释药物活性及毒性，啮齿类动物模型又无法快速地验证其结果，造成药物大量筛选一个很大的断层。有鉴于以上研究平台及方法的不足，我们发展一个可大量快速筛选抗骨质疏松药物的模型，一来拥有活体外细胞株可快速筛选之优势，二来也具有整体性动物实验结果的可靠性特点。斑马鱼(Daniorerio)是一种小型热带淡水鱼,属于鲤科,为一种完善的脊椎动物模型，胚胎可在体外发育生长，便于观察与操作。半透明的组织与相对较快的胚胎发展，使斑马鱼在研究型态及细胞生物学成为一个良好的生物模型。斑马鱼与哺乳类一样，骨骼系统由软骨及硬骨所组成。在胚胎发育的过程中，硬骨的形成主要经由两种过程软骨内骨化(intramembranous ossification)及膜内骨化(endochondralossification) (Olsen BR, Reginato AM, Wang W(2000)Bone development.Annu Rev Cell DevBiol 16:191-220)。软骨内骨化的过程为间质干细胞起始在软骨内骨骼上形成软骨，硬骨在软骨上形成，最后取代软骨；这类的骨头包括人类的四肢骨及鱼类的下颚骨及鳍条骨。膜内骨化形成于头骨大部分的扁平骨，其骨化过程中不经过形成软骨形成的阶段，直接分化为成骨细胞，分泌细胞外基质进行矿物化，最后形成硬骨。(AkiyamaH, Kim JE,Nakashima K,BalmesG, Iwai N, et al. (2005)Osteo-chondroprogenitorcells are derived from Sox9 expressingprecursors. Proc Natl Acad Sci USA102:14665-14670)斑马鱼与哺乳类的脊椎骨发育不同，在胚胎早期发育的过程中，哺乳类是经由软骨内骨化所形成，而斑马鱼是经由膜内骨化的方式形成，无须经由形成软骨骨架的过程，在受精后第七天便可发现脊索(notochord)上部分的骨头已经开始进行矿化作用，之后直接形成脊椎骨，所以可直接经由斑马鱼半透明之胚胎进行矿化作用的观察。在 Angeleen Fleming et al. (2005) Journal of Biomolecular Screening 中，Angeleen Fleming等人发表一种以斑马鱼作为动物模型来筛选以及评估已知药物的方法，该方法为(I)首先，将所收集到的胚胎置于胚胎培养液中以标准方法养育，待受精后三天将胚胎分别置于含有200ul胚胎培养液的96孔培养板中(96-well plate)中，每个孔洞中有三只胚胎。由于测试之药物为100倍之浓度，加入配于100% DMSO的药物中以2μ I的药物加入稀释，以28. 5°C培育至受精后九天；(2)胚胎麻醉并以4%多聚甲醛固定胚胎，接着以染剂茜素红之标准方法进行染色；(3)以SZX12立体显微镜及ColorView照相机进行影像撷取，将实验组及控制组利用头部影像染剂之有无或深浅以AnalySis software分别进行定量，在T-test测定其组间是否有显着差异。文献中，已经利用斑马鱼成功的验证一些临床上已知药物可促进骨头的矿物化程度，例如维他命D3 (cholecalciferol)、|丐三醇(calcitriol),副甲状腺激素特立帕肽(Teriparatide)等等药物,可作为阳性药物的控制组。虽然Angeleen Fleming等人发表以斑马鱼作为动物模型的分析方法确实可以用来筛选影响矿化作用之药物，但是以染剂之深浅作为数值化定量的结果并不能完全定义出其改变的程度。为了克服以上的不足，本发明利用钙黄绿素为染剂作为骨骼矿化作用的药物筛选系统，直接以脊索上的染色面积做为定量上的标准，以评估未知药物对于骨骼矿物化之影响
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种钙黄绿素为染剂的骨骼矿化作用药物的筛选系统。本发明的目的之一是提供钙黄绿素作为染剂应用于斑马鱼鱼体的矿化程度评估中；由于现有技术中的染剂施用于斑马鱼后，是以染色后颜色深浅作为数值化定量的结果，不能完全定义出其改变的程度，发明人意外地发现斑马鱼鱼体骨骼的矿化程度变化可以由活体染剂钙黄绿素染色后的影像面积数值来评价，藉此所得到的数据可供用于大量筛选促进矿化作用药物之效用；具体技术方案为钙黄绿素作为染剂在制备用于筛选矿化程度药物筛选系统中的应用。根据本发明优选的，上述应用，步骤如下A、斑马鱼样本前处理在标准规格的细胞培养板中，加入I 30条发育至3天大的健康斑马鱼幼鱼，加入药物溶液，然后用胚胎培养液补至每培养孔中液体体积不小于lml，加盖封闭，28°C培养箱中培养72h 96h，得施药斑马鱼；B、染色取施药斑马鱼，加入钙黄绿素溶液中，钙黄绿素溶液质量浓度为
O.Γ0. 3%，染色I 2. 5小时，制得染色斑马鱼；C、清洗将染色斑马鱼用胚胎培养液清洗，然后用胚胎培养液培养2 4h，再用胚胎培养液清洗鱼体至胚胎培养液为无色；
D、荧光定量在荧光条件下对显示黄绿色荧光部分进行面积统计分析。根据本发明优选的，所述的标准规格的细胞培养板，是指6孔、12孔、24孔、48孔、96孔细胞培养板。本发明用胚胎培养液补每培养孔中液体体积，根据不同规格的细胞培养板中培养孔体积不同，培养孔容纳液体体积也不相同，6孔板孔容纳最大体积为16. 5ml, 12孔板孔容纳最大体积为6. 5ml, 24孔板孔容纳最大体积为2. 9ml, 48孔板孔容纳最大体积为1. 7ml。本发明的另一个目的是提供一种利用钙黄绿素为染剂评价带筛选药物骨骼矿化作用大小的药物筛选系统。具体技术方案为一种钙黄绿素为染剂的骨骼矿化作用的药物筛选系统，包括受试组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，然后加入待筛选药物溶液，继续培养72h 96h，获得受试药物组；阳性控制组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，然后加入阳性对照药物溶液，继续培养72h 96h，获得阳性控制组；阴性控制组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养，时间与阳性控制组和受试组相同，获得阴性控制组；钙黄绿素染剂质量浓度为O. Γ0. 3%的钙黄绿素溶液；用于对已矿化之骨头进行活体荧光染色；影像采集系统用于对受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体脊椎骨的位置进行影像采集，分别得到受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体影像；影像分析及统计软件用于对受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体脊椎骨影像进行分析，分别得到受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值、阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值以及阴性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值。根据本发明优选的，所述阳性控制组的斑马鱼胚胎中阳性对照药物为促进骨骼矿化作用的阳性对照药物或者用于抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物，促进骨骼矿化作用的阳性对照药物为阿仑唑奈(Alendronate),维生素D3 (cholecalciferol), I丐三醇(calcitriol)或副甲状腺激素特立帕肽(Teriparatide)中的一种；抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物为6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧P定(Dorsomorphin)0一种利用钙黄绿素为染剂筛选骨骼矿化作用药物的方法，步骤如下( 1)分组将健康斑马鱼受精卵收集在培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，幼鱼从卵中孵出，挑选健康幼鱼，随即分组，同一组置于一个细胞培养板的孔中，每组f 30条；将加入待筛选药物的孔设为受试组；加入阳性对照药物的孔设为阳性控制组；加入不含药物的培养液的孔设为阴性控制组；
(2)药物处理向上述各组孔中加入溶剂，然后加入培养液至每孔相同体积，加盖封闭，在28°C、光照14h/黑暗10h的控光环境下培养72h 96h ；(3)染色吸去孔中药液，加入质量浓度为0.1-0. 3%的钙黄绿素溶液，染色1- 2. 5小时，染色结束后将染色剂吸出，用胚胎培养液清洗后，继续静置2 4h，再用胚胎培养液清洗鱼体至胚胎培养液为无色；(4)图像采集利用图像采集工具对经荧光照射的受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体黄绿部位进行影像采集，之后利用图像处理软件进行面积定量；(5)数据统计分析分析统计受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值、阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值以及阴性控制组的斑马鱼胚胎的黄绿色部位影像平均面积数值，其中若阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值高于受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值，并且受试组的斑马鱼胚胎与阳性控制组的斑马鱼胚胎的平均面积数值之间的差异具有p〈0. 05的统计学显着性，该药物被认为是促进矿化作用的药物；阴性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值低于受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值，并且受试组的斑马鱼胚胎与阴性控制组的斑马鱼胚胎平均面积数值之间的差异具有p〈0. 05的统计学显着性，该药物被认为是抑制矿化作用的药物。根据本发明优选的，所述步骤(1)中阳性对照药物为促进骨骼矿化作用的阳性对照药物或者用于抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物，促进骨骼矿化作用的阳性对照药物为阿仑唑奈(Alendronate),维生素 D3 (cholecalciferol)， 丐三酉享(calcitriol)或副甲状腺激素特立帕肽(Teriparatide)中的一种；抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物为6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧啶(Dorsomorphin).根据本发明优选的，所述步骤(1)中的斑马鱼为野生型斑马鱼或AB系斑马鱼。转基因斑马鱼是在特定组织或者蛋白上标记荧光蛋白，方便观察，并不会影响本发明所述的染色剂对斑马鱼骨骼染色的效果。根据本发明优选的，所述步骤(2)中所述的溶剂为二甲基亚砜、甲醇或水。根据本发明优选的，所述步骤(4)中的图像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。本发明所述试剂如无特殊说明，均为本领域常规市售产品。有益效果1、本发明通过观察斑马鱼脊索上骨矿化的根数及面积可以反映待筛选物质影响骨矿化作用的程度，这与先前的检测方法都不同，为众多的化合物提供了新方法。2、本发明与传统用茜素红染色方法相比，用染色的有无代替染色深浅评价骨骼形成的变化，解决了传统染色通过深浅程度判断易受染色条件、染色时间、操作等外界因素影响，克服了无法准确反映骨骼矿化程度的缺陷。
3、本发明利用活体染剂来染色已矿化的骨头，在荧光显微镜下可明显观察到矿化骨骼发出黄绿色荧光，荧光区域界线明显，对荧光区域面积定量，比传统方法采用染色深浅程度定量相比，准确性明显提高。4、本发明中的模型动物斑马鱼，与体外细胞株及啮齿类动物相比，具有细胞株可置于多孔板大量筛选之效率，也有啮齿类动物活体内验证之优点。利用斑马鱼胚胎进行大量化合物的筛选，有助于提高筛选效率和降低实验成本。
图1 :Alendronate对斑马鱼矿化促进作用的I丐黄绿素染色照片；其中，左侧为白光下显微镜图，中部为荧光显微镜图，右侧为荧光显微镜下背部骨骼局部放大图；图2 :Alendronate增加斑马鱼骨骼矿化面积的柱状图；图3 :Alendronate 结构式图；图4 :Dorsomorphin抑制斑马鱼骨骼矿化作用的I丐黄绿素的染色照片；其中，左侧为白光下显微镜图，中部为荧光显微镜图，右侧为荧光显微镜下背部骨骼局部放大图；图5 :Dorsomorphin抑制斑马鱼骨骼矿化面积的柱状图；图6 Dorsomorphin 结构式；图7 :Pentamidine (CY⑶-1140)促进斑马鱼骨骼矿化作用的钙黄绿素的染色照片;其中，左侧为白光下显微镜图，中部为荧光显微镜图，右侧为荧光显微镜下背部骨骼局部放大图；图8 :Pentamidine (CYCU-1140)促进斑马鱼骨骼矿化面积的柱状图；图9 Pentamidine (CYCU-1140)化学结构式；图10 :菌素红染色图；图11 :钙黄绿素染色图。
具体实施例方式下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实验材料胚胎培养液(EmbryoMedium)胚胎培养液配方如表I所示表1.胚胎培养液的配方
权利要求
1.钙黄绿素作为染剂在制备用于筛选矿化程度药物筛选系统中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下 A、斑马鱼样本前处理在标准规格的细胞培养板中，加入I 30条发育至3天大的健康斑马鱼幼鱼，加入药物溶液，然后用胚胎培养液补至每培养孔中液体体积不小于1ml，加盖封闭，28°C培养箱中培养72h 96h，得施药斑马鱼； B、染色取施药斑马鱼，加入钙黄绿素溶液，钙黄绿素溶液质量浓度为O.Γ0. 3%，染色I 2. 5小时，制得染色斑马鱼； C、清洗将染色斑马鱼用胚胎培养液清洗，然后用胚胎培养液培养2 4h，再用胚胎培养液清洗鱼体至胚胎培养液为无色； D、荧光定量在荧光条件下对显示黄绿色荧光部分进行面积统计分析。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的标准规格的细胞培养板，是指6孔、12孔、24孔、48孔、96孔细胞培养板。
4.一种钙黄绿素为染剂的骨骼矿化作用的药物筛选系统，其特征在于，包括 受试组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，然后加入待筛选药物溶液，继续培养72h 96h，获得受试药物组； 阳性控制组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，然后加入阳性对照药物溶液，继续培养72h 96h，获得阳性控制组； 阴性控制组的斑马鱼胚胎实验前将健康成年斑马鱼放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养，时间与阳性控制组和受试组相同，获得阴性控制组； 钙黄绿素染剂质量浓度为O. Γ0. 3%的钙黄绿素溶液；用于对已矿化之骨头进行活体荧光染色； 影像采集系统用于对受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体脊椎骨的位置进行影像采集，分别得到受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体影像； 影像分析及统计软件用于对受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体脊椎骨影像进行分析，分别得到受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值、阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值以及阴性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值。
5.如权利要求4所述的药物筛选系统，其特征在于，所述阳性控制组的斑马鱼胚胎中阳性对照药物为促进骨骼矿化作用的阳性对照药物或者用于抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物，促进骨骼矿化作用的阳性对照药物为阿仑唑奈，维生素D3，钙三醇或副甲状腺激素特立帕肽中的一种；抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物为6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧啶。
6.一种利用钙黄绿素为染剂筛选骨骼矿化作用药物的方法，其特征在于，步骤如下 (1)分组 将健康斑马鱼受精卵收集在培养液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养3天，幼鱼从卵中孵出，挑选健康幼鱼，随即分组，同一组置于一个细胞培养板的孔中，每组Γ30条；将加入待筛选药物的孔设为受试组；加入阳性对照药物的孔设为阳性控制组；力口入不含药物的培养液的孔设为阴性控制组； (2)药物处理 向上述各组孔中加入溶剂，然后加入培养液至每孔相同体积，加盖封闭，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光环境下培养72h 96h ； (3)染色 吸去孔中药液，加入质量浓度为O. Γ0. 3%的钙黄绿素溶液，染色f 2. 5小时，染色结束后将染色剂吸出，用胚胎培养液清洗后，继续静置2 4h，再用胚胎培养液清洗鱼体至胚胎培养液为无色； (4)图像采集 利用图像采集工具对经荧光照射的受试组的斑马鱼胚胎、阳性控制组的斑马鱼胚胎、阴性控制组的斑马鱼胚胎的鱼体黄绿部位进行影像采集，之后利用图像处理软件进行面积定量； (5)数据统计分析 分析统计受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值、阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值以及阴性控制组的斑马鱼胚胎的黄绿色部位影像平均面积数值，其中若阳性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值高于受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值，并且受试组的斑马鱼胚胎与阳性控制组的斑马鱼胚胎的平均面积数值之间的差异具有P〈0. 05的统计学显着性，该药物被认为是促进矿化作用的药物；阴性控制组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值低于受试组的斑马鱼胚胎的影像平均面积数值，并且受试组的斑马鱼胚胎与阴性控制组的斑马鱼胚胎平均面积数值之间的差异具有p〈0. 05的统计学显着性，该药物被认为是抑制矿化作用的药物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的阳性对照药物为促进骨骼矿化作用的阳性对照药物或者用于抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物，促进骨骼矿化作用的阳性对照药物为阿仑唑奈，维生素D3，钙三醇或副甲状腺激素特立帕肽中的一种；抑制骨骼矿化作用的阳性对照药物为6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的斑马鱼为野生型斑马鱼或AB系斑马鱼。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的溶剂为二甲基亚砜、甲醇或水。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的图像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
全文摘要
本发明涉及一种影响骨骼矿化作用药物的筛选系统，包括受试组的斑马鱼胚胎；阳性控制组的斑马鱼胚胎；阴性控制组的斑马鱼胚胎；钙黄绿素染剂；影像采集系统；影像分析及统计软件。本发明与传统用茜素红染色方法相比，用染色的有无代替染色深浅评价骨骼形成的变化，解决了传统染色通过深浅程度判断易受染色条件、染色时间、操作等外界因素影响，克服了无法准确反映骨骼矿化程度的缺陷。
文档编号G01N21/00GK103063630SQ20121055633
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者韩利文, 刘可春, 蔡志杰, 萧崇德 申请人:山东省科学院生物研究所, 力钧生物科技有限公司