专利名称：硝基咪唑类药物elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测硝基咪唑类药物残留量的试剂盒，特别是检测蜂蜜中硝基咪唑类药物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (Enzyme LinkedImmunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称,它是继免疫突光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。背景技术：
硝基咪唑类药物是畜禽蜂蜜中常用的抗原虫感染及抗菌药，主要用于防治家禽组织滴虫和寄生虫、牛的滴虫，猪的出血性肠炎、鱼的寄生虫感染、蜂的微孢子虫病等，并具有促生长作用，但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，因此硝基咪唑类药物的不合理使用造成可食性动物组织中药物残留问题危害到人类的食品安全，我国已经禁止甲硝唑、地美硝唑、洛硝唑在肉食食品中使用，替硝唑禁止在兽药中使用，因此，需要一种既灵敏又精确的方法测定硝基咪唑类药物。目前检测硝基咪唑类药物的方法主要有高效液相色谱-紫外色谱、高效液相色谱二极管陈列检测器法，气相色谱氮磷检测器法、高效液相色谱-电喷雾质谱法，气相色谱 法等，仪器检测方法操作繁琐且费用较高，推广应用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的硝基咪唑类药物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中硝基咪唑类药物残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种硝基咪唑类药物残留量检测的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的15个下凹瓶位，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被硝基咪唑类药物偶联抗原制成检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml标准品溶液、Iml酶标二抗工作液、7ml硝基咪唑类药物抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的硝基咪唑类药物将和酶标板微孔条上预包被的硝基咪唑类药物偶联抗原竞争抗硝基咪唑类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含硝基咪唑类药物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中硝基咪唑类药物残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度检测灵敏度为为0. 05 U g/kg ;相对于其他硝基咪唑类药物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、振荡机、涡旋仪和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。[0007]本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于硝基咪唑类药物残留量的检测。
图I为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面·[0013]图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。
具体实施方式
参见附图酶标反应微孔条(2)预包被硝基咪唑类药物偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶(5 )用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6 )的白色PE塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶(8 )用于封装7ml酶标二抗工作液，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装7ml硝基咪唑类药物抗体工作液，黑色帽的半透明PE塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml硝基咪唑类药物抗体工作液瓶位(16)，7ml酶标二抗工作液瓶位(15)，7瓶Iml/瓶各种浓度的标准品溶液，盒体为(19)是硬纸盒。(一)使用试剂盒检测硝基咪唑类药物的操作步骤(I)取出需要数量的微孔板。(2)编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。(3)加标准品/样本和抗体工作液加标准品/样本50 U I到对应的微孔中，加入抗体工作液50 u I/孔(注抗体工作液置于4°C冰箱保存，点样时取出立即点样)，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置0-4°C避光环境中反应60min。(4)洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 Ul/孔，充分洗涤4 一 5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。(5)加酶标二抗加入酶标二抗IOOiU/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25 °C避光环境中反应30min。(6)显色加入底物液A液50 ii I/孔，再加底物液B液50 ii I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境反应30min。[0023](7)测定加入终止液50 U I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。(二)结果判定(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即 B
百分吸光度值(％) =- X100%
Bo·B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0-Ol^g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以甲硝唑标准品浓度(呢/L)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中硝基咪唑类药物实际残留量。
权利要求1.一种硝基咪唑类药物ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被硝基咪唑类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗工作液、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒，96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内，盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶标二抗工作液用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被硝基咪唑类药物偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗工作液I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种硝基咪唑类药物残留量检测的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗工作液、硝基咪唑类药物抗体工作液、硝基咪唑类药物7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的硝基咪唑类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗硝基咪唑类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中硝基咪唑类药物的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在硝基咪唑类药物的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK202794173SQ20122052067
公开日2013年3月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者万宇平, 吴鹏, 罗晓琴, 孙震, 冯静, 余厚美, 赵正苗, 段盈盈, 何丽霞, 李晓芳 申请人:北京勤邦生物技术有限公司