专利名称：一种中国人群耐力指标评估试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型提供了一种中国人群耐力指标评估试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
长久以来，优秀运动员的运动表现一直被认为与其遗传外显有着显著相关性。近年来，随着生物学技术高速的发展，运用生物学技术从分子遗传学角度来选拔运动员，提高运动员成材率已成为可能。在启蒙训练前，通过基因检测就可以确定或淘汰那些不适合从事竞技体育的青少年。与此同时，还能比较精准地预测受试者是否具有运动天赋，并适合从事哪个运动项目。目前科学技术水平已经可以进行基因多态性(基因型)与运动表现(表型)之间的研究。国际上已经进行的一些相关研究项目结果显示，个体的遗传特性和后天环境因素对运动员的运动水平和训练效果起到重要作用。已经确定了至少36个遗传标记(位于20个常染色体基因和线粒体DNA)与运动水平相关,39个遗传标记(位于19个常染色体基因和线粒体DNA)与训练效果相关。国内目前的相关报道多集中于ACTN3和ACE基因与运动表现的研究(ACE基因多态性及与有氧运动能力的关联研究，汉族人群ACTN3多态性及与有氧耐力的关联性分析)，近年来也出现了一些其他基因如ADRA2A、CFTR等的相关研究(ACTN3、ADRA2A、睫状神经营养因子基因多态性与士兵速度、耐力、力量素质的相关性)。然而这些利用候选基因法进行的研究并不能较全面的解释中国人群遗传多态性与运动表现的关系。上海中优医药高科技有限公司与上海体育科学研究所选材研究中心完成了一批小样本预实验，对103例国际/国家健将运动员和50例性别、年龄等条件匹配的对照样本进行20个候选基因位点的检测结果进行ROC曲线验证。结果显示利用9个耐力相关位点(VDR BsmI, VDR ApaI, ACTN3 Arg577Ter, KDR His472Gln, CNTFR C-1703T，ABCC8Serl369Ala, ADRA2A DraI, CKMM NcoI, PPARGCIA Gly482Ser)进行耐力优秀运动员筛选，AUC达到0.711，最佳切割点敏感度可达93.10%，特异性可达44.00% (p=0.0003)。研究结果提示:该成果在青少年运动员选材时的推广使用，将大大有助于提高优秀体育后备苗子选拔与培养的有效性。本实用新型基于荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。
发明内容本实用新型提供了一种中国人群耐力指标评估试剂盒，包括包装盒体1、口腔拭子
2、样本保存管3、含有荧光定量PCR反应液的一个试管4、含阳性对照品的一个试管5、含阴性对照品的一个试管6，能够快速评估个体毒物激活能力的体征指标。为实现以上目的，本实用新型提供了一种中国人群耐力指标评估试剂盒，其特征在于将样本采集、评估个体毒物激活能力的SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方 便快捷，且成本更低。
图1为本实用新型的结构示意图；图2为VDR BsmI rsl544410被检测样本的示意图；图3为VDR ApaI rs7975232被检测样本的示意图；图4为ACTN3 Arg577Ter rsl815739被检测样本的示意图；图5为KDR His472Gln rsl870377被检测样本的示意图；图6为CNTFR C-1703T rs3808871被检测样本的示意图；图7为ABCC8 Serl369Ala rs5210被检测样本的示意图；图8为ADRA2A DraI rs553668被检测样本的示意图；图9为CKMM NcoI rs8111989被检测样本的示意图；图10 为 PPARGC1A Gly482Ser rs8192678 被检测样本的示意具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1步骤1.采集检测样品:打开包装盒体1，取出口腔拭子2在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管3中。步骤2.采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。步骤3:荧光定量PCR反应荧光定量PCR反应液4的成分分别包含:10XPCR反应缓冲液、dNTPs、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶。9个不同SNP位点的正反向引物、荧光探针订购于美国应用生物系统公司。对照品分为阳性对照品5和阴性对照品6，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为口腔粘膜上皮细胞DNA样品。检测在ABI9700型PCR扩增仪上进行，分为27个反应孔，每个检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)各2ul，分别放入9个反应孔，各加入PCR反应液、引物及探针共8ul，同时检测3个SNP位点，反应孔总体积IOul。反应条件为:50°C、2分钟，95 V、10分钟，然后再进行60个循环的95°C >30秒，60°C、1分钟。反应结束后取出放入ABI7900型荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取，根据设定的荧光阈值判断SNP位点基因型。步骤4 =SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯Vic荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；每一个被测者的3个点落在表上哪个区域，即可知道被测者的耐力指标评估能力。(I)VDR BsmI rsl544410检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为GG基因型、坐标轴右上区域绿点为GA基因型、坐标轴右下区域红点应为AA基因型。维生素D受体编码基因，该基因的多态现象与个体肌肉生长和骨骼强健存在显著相关性。(2) VDR ApaI rs7975232检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为CC基因型、坐标轴右上区域绿点为AC基因型、坐标轴右下区域红点为AA基因型。维生素D受体编码基因，该基因的多态现象与个体肌肉生长和骨骼强健存在显著相关性。(3) ACTN3 Arg577Ter rsl815739检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为CC基因型、坐标轴右上区域绿点为CT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型。辅肌动蛋白3编码基因，该基因的多态现象与个体快缩肌纤维比例具有显著相关性。(4) KDR His472Gln rsl870377检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型。激酶插入区域受体编码基因，该基因上的多态现象与个体VOmax、慢缩肌纤维比例具有显著相关性。(5) CNTFR C-1703T rs3808871检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为CC基因型、坐标轴右上区域绿点为CT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型。睫状神经营养因子受体编码基因，该基因在神经系统中参与调节神经传递素的合成与分泌以及神经突的正常生长，在减少炎症反应造成组织伤害方面起到重要作用，因而可影响肌肉力量的发展。(6) ABCC8 Serl369Ala rs5210检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AG基因型、坐标轴右下区域红点为GG基因型。ATP结合转运蛋白C超家族成员8编码基因，该基因的多态现象与个体VOmax具有显著相关性。(7) ADRA2A DraI rs553668检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为CC基因型、坐标轴右上区域绿点为CT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型。肾上腺素能受体a 2A编码基因，该基因的多态现象与个体VOmax具有显著相关性。(8) CKMM NcoI rs8111989检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为TT基因型、坐标轴右上区域绿点为CT基因型、坐标轴右下区域红点为CC基因型。肌酸肌酶编码基因，该基因的多态现象与个体快缩肌纤维比例具有显著相关性。[0045](9) PPARGCIA Gly482Ser rs8192678检测结果图中的一个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为GG基因型、坐标轴右上区域绿点为GA基因型、坐标轴右下区域红点为AA基因型。过氧化物酶体增殖活化受体g协同激活因子编码基因，该基因是重要的能量平衡调节基因，与个体慢缩肌纤维比例具有显著相关性。
权利要求1.一种中国人群耐力指标评估试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、口腔拭子(2)、样本保存管(3)、含有荧光定量PCR反应液的一个试管(4)、含阳性对照品的一个试管(5)、含阴性对照品的一个试管(6)组成。
专利摘要本实用新型提供了一种中国人群耐力指标评估试剂盒，包括包装盒体1、口腔拭子2、样本保存管3、含有荧光定量PCR反应液的一个试管4、含阳性对照品的一个试管5、含阴性对照品的一个试管6，能够快速评估中国人群耐力的体征指标，使用更方便快捷，且成本更低。
文档编号G01N21/64GK203048917SQ201220731159
公开日2013年7月10日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者傅咏南, 朱建军, 沈勋章, 蔡广, 许汪宇, 张奕 申请人:上海中优医药高科技有限公司, 上海体育科学研究所