专利名称：禽白血病病毒elisa抗原检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种检测动物病毒的快速检测工具，具体是禽白血病病毒的检测试剂盒。
背景技术：
禽白血病(AvianLeukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV^PI禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus, ASV)群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。该病对鸡能引起许多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。自1868年Roloff报道鸡淋巴肉瘤以来，禽白血病已分布于世界各地，我国也有自然病例发生。该病可引起鸡只增重缓慢、性成熟延迟、蛋小、蛋壳薄、产蛋量下降、受精率和孵化率低、胴体废弃率增加、死亡率增高等,造成直接经济损失。同时还可弓I起机体非特异性抵抗力下降和免疫抑制，造成间接经济损失。由于该病能垂直传播，因此对养禽业危害很大，是危害养鸡业的主要疾病之一。目前，对于该病尚无有效的防治措施，也无可用的疫苗，各国主要通过定期对种鸡群进行检疫，淘汰阳性鸡，通过不断地净化从而选育出无禽白血病的鸡群。在众多检测方法中，ELISA检测方法以其敏感、特异、操作方便而被广泛应用于临床检测。该法适合于基层兽医部门和鸡场对该病的诊断和血清学检测。
发明内容本发明的目的在于提供一种成本低、快速、操作简便、灵敏度高的禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒。本发明的技术方案是:包括一个试剂盒盒体，盒体内装有五张盖板膜、一个自封袋、一份说明书，禽白血病病毒单克隆抗体包被的96孔酶标板、固定泡沫模具形成的放置试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，其特征在于:酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了抗禽白血病病毒单克隆抗体，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空；所述试剂瓶包括2 mL阴性对照、2 mL阳性对照、50mL酶标抗体、25 mL底物A液、25 mL底物B液、50 mL 25 X浓缩洗涤液、50 mL终止液固定在具有下凹瓶位的泡沫塑料模具中，盖板膜、自封袋和说明书一同装在一个自封袋中置于酶标板的上方。试剂盒可以一次连续测定多份样品，也可将板孔拆开多次检测。本试剂盒检测的原理是:本试剂盒是采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验原理检测禽白血病的P27抗原。检测时，在相应的反应孔中加入阴阳对照和待测样品，若样品中含有P27抗原，则与吸附板孔表面的单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，反之则不能结合。洗涤后，加入酶标抗体 ，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中P27抗原的含量成正相关。本试剂盒具有很高的灵敏度和很高的特异性，可检测的样本包括蛋清、泄殖腔拭子、疫苗、胎粪。本试剂盒对ALV P27蛋白溶液的检测下限为5.7ng/ml，对NDV、IBDV、REV、IBV、AEV、EDSV、MDV、FPV、CIAV、ILTV等禽类常见病毒、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、阴性拭子、SPF鸡蛋蛋清和SPF鸡血浆都不产生特异性反应。本试剂盒检测简便，所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机等简单的实验室仪器，所需检测成本低。可满足禽养殖生产企业的自我质量控制、也可作为禽白血病病毒的流行病学监测和疾病的早期诊断。
图1是本使用新型的示意图图2是本实用新型泡沫模具的示意图
具体实施方案参见附图1，展现了本实施例所述的禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒，所述盒体I中装有所述的96孔酶标板2，所述盖板膜、自封袋、说明书共同装在一个自封袋中放置于所述酶标板2上面；所述试剂盒下层内具有固定泡沫模具3形成的下凹瓶位，共有7个下凹瓶位:2 mL阴性对照4、2 mL阳性对照5、50mL酶标抗体6、25 mL底物A液7、25 mL底物B液8、50 mL 25X浓缩洗涤液9、50 mL终止液10。所述下凹瓶位用于放置装有相应溶液的试剂瓶(7瓶)。本实用新型的实施例一、工作液的准备洗涤工作液:用去离子水按1:25 (I份浓缩液+24份去离子水)稀释。PBS溶液:3.58 g十二水磷酸氢二钠，0.24 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠，0.2 g氯化钾，加去离子水定容至1L。二、样品前处理蛋清:取全蛋，破碎后用微量移液器吸取蛋清直接进行检测；泄殖腔拭子:取棉签于待检鸡只泄殖腔取样后，放入Iml PBS溶液(0.01 mol/L,pH值7.4)中，在_20°C以下冻融一次，恢复室温后用于检测；疫苗:用PBS溶液(0.01 11101/1，？!1值7.4)溶解后用于测定;胎粪:无需稀释，可以直接用于检测。若样品中含有沉淀或杂质，需进行低速离心后再用于检测。三、操作步骤将处理好的样品加入包被板，100 μ I/孔，同时选4孔做阴、阳性对照(各2孔)；将酶联反应板加盖或封膜，在室温下(25±2°C)下孵育60分钟；甩去孔内液体，用洗涤工作液洗涤酶联反应板，260 μ I/孔，洗涤3次，拍干；加入酶标抗体，100 μ I/孔；放上盖板膜，在室温下孵育60分钟；甩去孔内液体，用洗涤工作液洗涤酶联反应板，260 μ I/孔，洗涤3次，拍干；将底物A液与底物B液按1:1混合，加入孔中，100 μ I/孔；放上盖板膜，在室温下孵育15分钟；加终止液，100 μ I/孔，并轻轻振荡混匀；在酶标仪上读取0D650值(应在加终止液后15分钟内完成读数)。四、判定NC值< 0.200且0.500 < PC值≤2.000，试验结果才有效。否则，应进行重复试验；如果S/P < 0.17，说明样品中无禽白血病病毒P27蛋白；如果S/P≥0.17，说明样品中有禽白血病病毒P27蛋白。S/P= (SC-NC)/ (PC-NC)，其中:NC为阴性对照孔OD值平均数；PC为阳性对照孔OD值平均数；SC为被检样品孔OD值平均数。五、测定注意事项1.请勿使用过期产品，不同批号产品的试剂不得混用。2.勿使用过期的试剂盒，已开封的组分应在有效期内使用。3.在每次使用时，均应分别设立2孔阳性对照和2孔阴性对照。4.必须使用符合药典规定的水(如蒸馏水、去离子水或纯水)稀释洗涤液。5.试剂盒各组分在使用前应预先平衡至室温。6.未使用的酶联反应板应放回铝箔袋并封口，2 8°C保存。7.应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。8.浓缩洗涤液在低温(2 8°C)储存时可能出现结晶，须在室温下完全溶解并混匀后再行使用。9.勿将底物溶液暴露于强光下。10.本品终止液为硫酸，避免同眼、皮肤接触。11.移液系统应保证准确清洁，应在提供准确溶液体积的同时不造成交叉污染。12.样本的运输须按国家的有关规定进行。
权利要求1.禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于:包括一个试剂盒盒体，盒体内装有五张盖板膜、一个自封袋、一份说明书，禽白血病病毒单克隆抗体包被的96孔酶标板、固定泡沫模具形成的放置试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，所述试剂瓶包括2 mL阴性对照、2 mL阳性对照、50mL酶标抗体、25 mL底物A液、25 mL底物B液、50 mL 25 X浓缩洗涤液、50 mL终止液。
2.根据权利要求1所述的禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒，其所述的酶标板特征在于:酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了抗禽白血病病毒单克隆抗体，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空。
专利摘要本实用新型涉及一种禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒。该试剂盒包括一个试剂盒盒体，盒体内装有五张盖板膜、一个自封袋、一份说明书，禽白血病病毒单克隆抗体包被的96孔酶标板、固定泡沫模具形成的放置试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的7个试剂瓶，1瓶阴性对照、1瓶阳性对照、1瓶酶标抗体、1瓶底物A液、1瓶底物B液、1瓶25×浓缩洗涤液、1瓶终止液。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验原理检测禽白血病的P27抗原，检测时若样品中含有P27抗原，则与吸附板孔表面的单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，洗涤后加入酶标抗体，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中P27抗原的含量成正相关。本试剂盒具有检测简便，快速，灵敏度高，特异性强，检测费用低廉等优点，可满足禽养殖生产企业的自我质量控制、也可作为禽白血病病毒的流行病学监测和疾病的早期诊断。
文档编号G01N33/543GK203011927SQ201220730978
公开日2013年6月19日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者何丹婷, 徐飞, 吴小平, 苏丽芳, 杨铮 申请人:北京维德维康生物技术有限公司