急性肺损伤的诊断方法

急性肺损伤的诊断方法
【专利摘要】本发明提供能够明确地鉴别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎，从而进行诊断的、有用的检查方法以及诊断试剂。具体地，本发明提供包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量的、用于判定受试者是否患有急性肺损伤的方法。
【专利说明】急性肺损伤的诊断方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于诊断急性肺损伤的检查方法、急性肺损伤诊断试剂等。
【背景技术】
[0002]急性肺损伤(Acute Lung Injury,也称ALI)是由直接或间接对肺造成伤害的败血症、肺炎等疾病、外伤等伤害、和/或误吸(aspiration)等引起的肺的炎症性疾病。其显示非特异性症状，但气短是主症状，时而伴随咳或胸痛。急性肺损伤患者典型地在从最初的伤害或疾病起24?48小时以内显现出上述症状，重度的情况下会致死。死亡率为极高的30?40%,可因老龄或并存疾病而进一步提闻。
[0003]急性肺损伤的诊断基本上通过临床诊断来进行。急性肺损伤的临床所见也与急性心力衰竭以及肺感染的临床所见类似，为了确定诊断或者确定原因，患者还应该进一步接受ABG检查(Arterial Blood Gas Test ;动脉血气检查,测定血中的氧分压、CO2分压、pH等)以及胸部X射线检查。但是，急性肺损伤是一种进展迅速、尚未确立有效治疗方法、预后极其不良的疾病。有些情况下还会发生气胸、重症肺部细菌感染症等并发症。因此，早期诊断特别必要。
[0004]最近为了更简便、迅速地诊断急性肺损伤，作为血清标记物利用了 KL_6(唾液酸化糖链抗原)、SP-D (Surfactant protein-D) > SP-A (Surfactant protein-A)。但是，它们也是隐原性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia ;C0P)、特发性普通型间质性肺炎(idiopathic usual interstitial pneumonia ；idiopathic UIP)、特发性非特异性间质性月市炎(idiopathic nonspecific interstitial pneumonia ；idiopathic NSIP)、胶原病相关的普通型间质性肺炎(collagen vascular disease (CVD)-associated UIP)、胶原病相关的非特异性间质性肺炎(collagen vascular disease (CVD)-associated NSIP)等已知的慢性进行性的间质性肺炎的标记物，而用于将急性肺损伤与这些疾病明确区分开并进行诊断的特异性高的标记物尚属未知。
[0005]已知热休克蛋白47(HSP47)是一种对胶原具有特异性的分子伴侣，其是存在于内质网的热休克诱导性的应激蛋白质。HSP47的表达与作为基质的胶原的表达协同，因此，HSP47被认为在各种纤维化疾病中具有重要的关系(专利文献I?3、非专利文献6以及8)。此外，已经报告了急性肺损伤的纤维化期中HSP47的作用等(非专利文献I?3)。目前为止已经报告了肺纤维化疾病的肺组织局部的HSP47表达亢进(非专利文献5以及6)，但HSP47局限于内质网内，不会漏出至细胞外，因此，并不认为伴有纤维化的间质性肺炎中HSP47在细胞外(例如血中等)上升。实际上，由过去的报告可知，特发性肺纤维症患者血清中的HSP47与健康正常人的水平相同，未见上升(非专利文献7)。目前为止，既不知晓也不能预见HSP47在急性肺损伤中可见显著上升、或HSP47可以成为能够明确区分急性肺损伤与慢性进行性的间质性肺炎的有用的生物标记物。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献[0008]专利文献1:日本特开2008-122276号公报
[0009]专利文献2:日本特开2003-159087号公报
[0010]专利文献3:日本特表2002-522462号公报
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献I:ICU i CCU, Vol.33, N0.5, Page.351-359(2009)
[0013]非专利文献2:侵襲 i 免疫，Vol.17，N0.2，Page.62-64(2008)
[0014]非专利文献3:日本臨床麻酔学会誌，Vol.23，N0.8，Page.S163(2003)
[0015]非专利文献4:週間医学乃h吵?，增刊(3月)Page.134-136(2003)
[0016]非专利文献5:Hum Pathol31:1498-1505 (2000)
[0017]非专利文献6:Respir Res6:57 (2005)
[0018]非专利文献7:bIOCHEM bIOPHYS rES c0MMUN303:413-418 (2003)
[0019]非专利文献8:日本呼吸器学会雑誌，VOL.40增刊号，PAGE.188(2002)

【发明内容】

[0020]发明所要解决的问题
[0021]本发明的目的在于提供能够与慢性进行性的间质性肺炎明确鉴别开来诊断急性肺损伤的有用的检查方法、以及诊断试剂。
[0022]解决问题的方法
[0023]本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现:生物体试样中HSP47蛋白量(浓度)的测定对急性肺损伤的诊断是有用的，与慢性进行性的间质性肺炎相比较，可见生物体试样中的HSP47蛋白在急性肺损伤时特异性上升，这对它们的鉴别是有用的。由此完成了本发明。
[0024]即，本发明如下。
[0025][I] 一种用于判定受试者是否患有急性肺损伤的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
[0026][2] [I]所述的方法，其是辨别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎的方法。
[0027][3] [I]所述的方法，其是辨别急性肺损伤与主动脉夹层、急性心力衰竭、慢性心力衰竭急性加重、弥漫性肺泡出血、癌性淋巴管炎、复张性肺水肿、过量输液引起的肺水肿、神经源性肺水肿、肺结核或粟粒性结核的方法。
[0028][4] [I]?[3]中任一项所述的方法，其中，生物体试样是血液、血清或血浆。
[0029][5] 一种急性肺损伤的诊断试剂，其包含:特异性识别热休克蛋白47的抗体；和/或胶原或胶原的与热休克蛋白47具有特异性结合性的部分片段。
[0030][6] 一种用于判定受试者是否发生急性肺损伤的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
[0031][7] 一种用于对受试者的急性肺损伤的治疗效果进行判定或预测受试者的急性肺损伤的预后的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
[0032]发明的效果
[0033]根据本发明的检查方法，能够以高灵敏度辨别受试者是否患有急性肺损伤。该方法能够成为可明确地鉴别慢性进行性的间质性肺炎与急性肺损伤的有力的诊断工具。而且，使用本发明的诊断试剂，利用上述本发明的检查方法，能够简便地诊断是否患有急性肺损伤。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中HSP47蛋白浓度的坐标图。
[0035]图2为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中KL-6浓度的坐标图。
[0036]图3为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中SP-A浓度的坐标图。
[0037]图4为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中SP-D浓度的坐标图。
[0038]图5为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中LDH(乳酸脱氢酶)浓度的坐标图。
[0039]图6为对于HSP47蛋白、KL-6、SP-D, SP-A以及LDH，用接收者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic (ROC) curve)不出了灵敏度与特异性的关系的坐标图。
[0040]图7为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中HSP47蛋白浓度的坐标图。
[0041]图8为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中KL-6浓度的坐标图。
[0042]图9为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中SP-A浓度的坐标图。
[0043]图10为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中SP-D浓度的坐标图。N.S.表不无显者差异。
[0044]图11为示出了健康正常者以及横轴所示各疾病的患者的血清中LDH(乳酸脱氢酶)浓度的坐标图。
[0045]图12为对于HSP47蛋白、KL_6、SP_D、SP-A以及LDH，用接收者操作特征曲线示出了灵敏度与特异性的关系的坐标图。
[0046]发明的【具体实施方式】
[0047]以下对本发明进行具体说明。
[0048](I)热休克蛋白47作为急性肺损伤的诊断用生物标记物的应用
[0049]本发明提供一种用于判定受试者是否患有急性肺损伤的方法(方法(I))，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
[0050]在本说明书中，“急性肺损伤(也称ALI) ”是指:直接或间接地伤害肺的败血症、肺炎、外伤和/或误吸等引起的肺的炎症性疾病。本说明书中的“急性肺损伤”还包括已知为同一临床障碍的急性呼吸窘迫综合征(也称ARDS)。而且，满足急性肺损伤的临床定义的急性进行性间质性肺炎也包括在急性肺损伤中。
[0051]急性肺损伤的临床定义如下(用于ALI/ARDS诊疗的指南；社团法人日本呼吸器学会ARDS指南制定委员会):
[0052](I)急性发病。
[0053](II)低氧血症(Pa02/Fi02 为 300mmHg 以下)。
[0054](FiO2=吸气O2浓度分数。PaO2的单位是mmHg、Fi02是小数(例如0.5)。Pa02/Fi02为200mmHg以下病例为急性呼吸窘迫综合征。)
[0055](III)胸部X射线照片能够确认双侧性的肺浸润影像。
[0056](IV)肺动脉嵌入压为ISmmHg以下或病理学上无左房压上升的临床所见。
[0057]上述标准全部满足则定义为急性肺损伤。
[0058]在本发明的方法⑴中，“受试者”可以是“怀疑患有急性肺损伤的受试者”。在本说明书中，“怀疑患有急性肺损伤的受试者”是指:通过临床诊断具有急性肺损伤、主动脉夹层、急性心力衰竭、慢性心力衰竭急性加重、弥漫性肺泡出血、癌性淋巴管炎、复张性肺水肿、过量输液引起的肺水肿、神经源性肺水肿或肺感染(肺结核、粟粒性结核等)共同的临床所见(例如咳嗽、喀痰、发热、气短、呼吸衰竭、低氧血症、胸部疼痛等)的患者(急性肺损伤以外的这些其它疾病以下也统称为“认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病”)。
[0059]在本发明的方法⑴中，“受试者”或“怀疑患有急性肺损伤的受试者”可以是“怀疑患有急性肺损伤或慢性进行性间质性肺炎中的任一种的受试者”。在本说明书中，“怀疑患有急性肺损伤或慢性进行性间质性肺炎中的任一种的受试者”是指:通过胸部X射线照片、利用KL-6、SP-D或SP-A等血清标记物进行的诊断，得到了怀疑患有急性肺损伤或慢性进行性间质性肺炎中的任一种这样的意见的患者。
[0060]在本说明书中，“间质性肺炎”是指:具有肺泡隔壁肥厚、成纤维细胞增殖、胶原沉着等特征的且主要导致肺的间质组织产生炎症的疾病。作为间质性肺炎，可以列举出以放射线、病原体感染、胶原病为原因的间质性肺炎，还可以列举出中毒、药物性的或未见明确原因的特发性间质性肺炎。作为特发性间质性肺炎，可以列举出例如，隐原性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia ;C0P)、特发性普通型间质性肺炎(idiopathic usual interstitial pneumonia ；idiopathic UIP)、特发性非特异性间质性月市炎(idiopathic nonspecific interstitial pneumonia ；idiopathic NSIP)等,但不限于此。在本说明书中，“间质性肺炎”的概念中还包括发展为炎症组织纤维化的肺纤维症。
[0061]供给本发明的方法(I)的受试者可以患有或未患有肺纤维症。目前为止，已经报告了 HSP47在肺纤维化疾病的肺组织局部的表达亢进(非专利文献5以及6)，但因HSP47局限于内质网内，被认为无法漏出至细胞外，因而，就伴有纤维化的间质性肺炎而言，认为HSP47在细胞外(例如血中等)不会上升。实际上，在过去的报告中已经明确，特发性肺纤维症患者血清中的HSP47和抗HSP47抗体与健康正常人处于同一水平、未见上升(非专利文献7)。细胞外(例如血中等)中的HSP47，在慢性进行性间质性肺炎时未见上升，而在急性肺损伤(包括急性进行性间质性肺炎)时可见特异性上升。
[0062]另一方面，在本发明的方法(I)中，“受试者”或“怀疑患有急性肺损伤的受试者”可以是“怀疑患有急性肺损伤或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病中的任一种的受试者”。在本说明书中，“怀疑患有急性肺损伤或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病中的任一种的受试者”是指:根据临床诊断，具有与急性肺损伤和上述疾病共同的临床所见(例如气短、呼吸衰竭、低氧血症、胸部疼痛等)的患者。
[0063]在本说明书中，“主动脉夹层”是指:由于遗传因素、主动脉内膜的变质和脆弱化、加之主动脉的扩张、高血压等，主动脉血管的内膜的一部分开裂，血液从其内膜裂孔流入内膜内，发生血管壁的解离，因此发病的伴有剧烈的胸痛、腹痛的疾病。
[0064]在本说明书中，“急性心力衰竭”是指:心室无法向周围器官供给充分的血流的循环器官疾病的病状，由于循环动态急剧恶化而导致了该病状。作为急性心力衰竭的症状，可以列举出基于肺淤血的显著的气短或者基于低心搏的心原性休克、泡沫痰喀出、乏尿或无尿、四肢冷感、血压下降、冷汗或心跳加快(时而心跳放缓)等。
[0065]在本说明书中，“慢性心力衰竭急性加重”是指慢性心力衰竭急剧恶化。在本说明书中，“慢性心力衰竭”是指下述病状:像陈旧性心肌梗塞、扩张型心肌病等可见的那样缓慢进行，处于以心脏肥大为代表的各种代偿机制运转的平衡状态，且呈现出气短、易感觉疲劳、运动耐受力降低、肝脾肿大、浮肿或外周静脉曲张等症状。
[0066]在本说明书中，“肺结核”是指结核菌引起的肺感染。
[0067]在本说明书中，“粟粒性结核”是指:结核菌大量进入血液循环中，播种于多脏器，形成大量结核结节的病状。
[0068]在本说明书中，“弥漫性肺泡出血”是指向肺泡腔内的出血。作为能够确认向肺泡腔内的出血，肺泡腔内出现含铁血黄素吞噬细胞(载铁细胞)，含铁血黄素在肺泡壁上沉着，且胸部X射线照片中全肺区域显示出弥漫性散布性阴影的疾病群，已知有肺泡出血综合征。多数不仅是肺泡腔，还可见肺间质出血。作为原因，可以列举出，肺的损伤、胸廓压迫，肺?支气管病灶的血管破损，血管神经性出血，一部分出血性肺炎，血液疾病中可见的漏出性出血,毛细血管障碍来源的出血,免疫现象相关的出血等。
[0069]在本说明书中，“癌性淋巴管炎”是指:由于癌细胞向灌流侧的淋巴结转移、淋巴管的塞栓等，淋巴流瘀滞，因而逆行性增殖的癌细胞扩散充满组织的淋巴管内的状态。扩张的淋巴管周围伴随着浮肿、纤维组织的增殖，呈现出宛如淋巴管炎的假炎症性状态。有时可在乳癌、胃癌、含转移性的肺癌等中确认，呈现不良的预后。
[0070]在本说明书中，“肺水肿”是指在肺血管外存在异常的水分贮留的病理状态。
[0071]在本说明书中，“复张性肺水肿”是指:在对胸水、气胸、血胸等进行胸腔排液等治疗时，虚脱的肺一下子发生再扩张，发生肺血流的再灌流和血管透过性亢进，结果引起肺水肿。
[0072]在本说明书中，“输液”是指:将水分、电解质等通过点滴静注而给药的治疗方法，术语“过量输液引起的肺水肿”是指:由于过量的输液，肺的毛细血管压增加、引起肺水肿的状态。
[0073]在本说明书中，“神经源性肺水肿”是指:伴随头部的外伤，癫痫发作，脑血管障碍等头颅内压上升而发生的急性的肺水肿。
[0074]供给本发明的方法(I)的受试者是指哺乳动物。作为该哺乳动物，没有特殊限制，是具有罹患急性肺损伤的可能性的哺乳动物即可，其中，优选小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，兔等实验动物，猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等家畜、犬、猫等宠物，人、猴、食蟹猕猴、罗猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类，特别优选人。
[0075]热休克蛋白47 (HSP47)是公知的热休克蛋白质，其氨基酸序列等也是公知的。本发明中使用的HSP47通常是哺乳动物来源的。“哺乳动物来源”是指:HSP47的氨基酸序列是哺乳动物的序列。作为哺乳动物，可以列举出与能够作为受试者使用的哺乳动物相同的那些。作为定量对象的HSP47所来源的哺乳动物的种类通常与受试者哺乳动物的种类相同。例如，受试者若是人，则定量人热休克蛋白47。
[0076]作为人HSP47的典型氨基酸序列，可以列举出SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列(GeneBank登录号:NP_001226)。在本说明书中，蛋白质以及肽按照肽标记的惯例记为左端是N末端(氨基末端)、右端是C末端(羧基末端)。
[0077]作为可在本发明的方法(I)中使用的生物体试样，可以列举出，血液、支气管洗出液、肺泡洗出液、喀痰、肺组织、脑脊髓液、腹水等，只要能够检测伴随急性肺损伤的HSP47水平的上升即可，没有特殊限制。肺组织优选在合适的缓冲液中破碎，以抽提液的状态用于本发明的方法(I)。作为“血液”，可以假定任何组织来源的血液，但从采集容易方面考虑，通常使用末梢血。作为血液的采集方法，适用本身公知的方法。此外，采集的血液可以直接用于本步骤，优选以利用本身公知的方法、例如离心分离、过滤等分离掉细胞成分(红血球、白血球、血小板等)而得到的液体成分(血浆)的形式用于本步骤。此外，还优选以分离掉使血液凝固的血小板、凝血因子而得到的液体成分(血清)的形式用于本步骤。能够用于本发明的方法(I)的生物体试样优选为血液、血清或血浆。
[0078]生物体试样中的HSP47的定量可以采用免疫学方法、质量分析法等本身公知的方法来进行。
[0079]基于免疫学方法的HSP47的定量例如包含以下步骤:
[0080](I)使受试者来源的生物体试样与特异性识别HSP47的抗体相接触，形成生物体试样中的HSP47与特异性识别HSP47的抗体的复合体的步骤；
[0081](2)检测上述步骤(I)中形成的复合体的步骤；以及
[0082](3)由上述步骤(2)中检测的复合体的量计算出生物体试样中的HSP47的量的步骤。
[0083]步骤(I)是使受试者来源的生物体试样与特异性识别HSP47的抗体接触，形成生物体试样中的HSP47与特异性识别HSP47的抗体的复合体的步骤。
[0084]在本说明书中，作为“特异性识别HSP47的抗体”，具有特异性结合HSP47的能力即可，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。作为该抗体，还包括嵌合抗体、单链抗体或抗体分子的F(ab’)2、Fab’、或Fab级分等结合性片段。作为这些抗体，可以使用HSP47作为免疫原按照本身公知的方法制备的抗体，也可以使用市售的抗体。
[0085]“特异性”是指对作为抗体的抗原的HSP47的亲合性高于对其他抗原的亲合性。
[0086]在使用重组HSP47作为抗原的情况下，重组HSP47例如可以采用以下的方法来制作。将编码HSP47氨基酸序列的多核苷酸(例如，对于人HSP47，为包含SEQ ID NO:1所表不的核苷酸序列(GeneBank登录号:NN_001235)的多核苷酸)组入合适的表达载体，将其插入合适的宿主并进行转化，可以从该转化细胞的破碎物获得作为目标的重组HSP47。对于上述宿主细胞没有特殊限制，可以使用传统上在基因工程方法中使用的各种宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物或动物细胞等。
[0087]HSP47除了可以是从上述转化体产生的重组蛋白质之外，还可以是从产生其的天然细胞通过本身公知的蛋白质分离纯化技术分离或纯化得到的蛋白质。此外，还可以是化学合成或者利用无细胞翻译体系生物化学合成的蛋白质。
[0088]使用上述HSP47，可以按照常规方法制造所述“特异性识别HSP47的抗体”。具体地，在该抗体是多克隆抗体的情况下，采用常规方法用HSP47免疫家兔等非人动物，可以从该免疫动物的血清中获得(Current Protocols in Molecular Biology, edit.AusubelFM et al.(2011)Publish.John Wiley and Sons.ChapterlI, Section III, UnitlL 12 ?
11.13)。另一方面，在单克隆抗体的情况下，按照常规方法用HSP47或具有其部分氨基酸序列的寡肽等免疫小鼠等非人动物，可以从将所得脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞融合而制备的杂交瘤细胞中获得(Current protocols in Molecular Biology, edit.Ausubel FM etal.(2011)Publish.John Wiley and Sons.Chapter11, Section II, UnitlL 4 ?11.11)。
[0089]优选本发明中使用的特异性识别HSP47的抗体经过分离或纯化。“分离或纯化”是指:实施从天然状态除去目的成分以外的成分的操作。经分离或纯化的特异性识别HSP47的抗体的纯度(相对于总蛋白质重量的特异性识别HSP47的抗体的重量比例)通常为50%以上、优选70%以上、更优选90%以上、最优选95%以上(例如基本上为100%)。
[0090]所述抗体可以直接地或间接地用标记物质标记。作为标记物质，可以列举出，荧光物质(例如FITC、罗丹明)、放射性物质(例如14C、3H、125I)、酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶)、着色粒子(例如金属胶体粒子、着色胶乳)、生物素等。
[0091]如果是这样的抗体，可以在本步骤中仅使用I种抗体，也可以使用2种以上。
[0092]上述“特异性识别HSP47的抗体”也可以以水溶液的状态使用，但优选结合于固相。作为该“固相”，可以列举出，平板(例如微孔板)、管、珠(例如塑料珠、磁珠)、色谱用承载体(例如S^harose (商标))、膜(例如硝酸纤维素膜、PVDF膜)、凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)、金属膜(例如金膜)等。其中，优选使用平板、珠、膜以及金属膜，从操作的简便性来看，最优选平板。作为上述结合，可以列举出，共价键、离子键、物理吸附等，没有特殊限制，共价键和/或物理吸附能够获得充分的结合强度，因而优选。此外，对固相的结合，可以是直接结合于固相，也可以利用本身公知的物质间接地结合于固相。而且，为了抑制非特异性吸附、非特异性反应，一般使牛血清白蛋白(BSA)、牛乳蛋白等的磷酸缓冲溶液与固相接触，将未被抗体包覆的固相表面部分用所述BSA、牛乳蛋白等进行封闭。
[0093]本步骤中，“特异性识别HSP47的抗体”与受试者来源的生物体试样中中所含的“HSP47”的接触，只要是能够在反应容器中通过将该生物体试样与特异性识别HSP47的抗体混合而使它们相互作用的方法即可，对于形态、顺序、具体方法等没有特殊限制。接触可以通过例如在固相化有“特异性识别HSP47的抗体”的平板上添加该生物体试样(的抽提液)来进行。
[0094]而且，对于保持该接触的时间没有特殊限制，只要是对于所述特异性识别HSP47的抗体与受试者来源的生物体试样中所含的HSP47结合、形成复合体而言的充足时间即可，通常为数秒?十几小时，从快速判定是否为急性肺损伤的观点来看，优选I分钟?2小时，最优选2分钟?30分钟。此外，作为进行接触的温度条件，通常为4°C?50°C，优选4°C?37°C，最优选15°C?30°C左右的室温。而且，`进行反应的pH条件优选为5.0?9.0，特别优选为6.0?8.0的中性区域。
[0095]步骤(2)是通过对上述步骤(I)中形成的复合体进行检测，判定上述生物体试样中是否存在HSP47的步骤。[0096]上述检测可以通过检测复合体中所含的“HSP47”或“特异性识别HSP47的抗体”来进行。该检测可以利用酶免疫测定法(EIA法)、免疫色谱法、胶乳凝集法、放射免疫测定法(RIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)、冷光免疫测定法、表面等离子体共振测定法(SPR法)等。其中，EIA法、免疫色谱法、FIA法以及SPR法从操作的容易性以及迅速性的观点来看是合适的。
[0097]在作为步骤(2)的检测方法选择EIA法的情况下，EIA法优选是使用2种“特异性识别HSP47的抗体”的夹心酶结合免疫固相测定法(夹心ELISA法)。这样的夹心ELISA法使用2种抗体，因而对抗原的特异性好。
[0098]用于实施夹心ELISA法的2种“特异性识别HSP47的抗体”只要是表位不发生竞争的抗体之间的组合即可，可以是单克隆抗体之间的组合、多克隆抗体之间的组合、或单克隆抗体与多克隆抗体的组合。
[0099]作为夹心ELISA法的一种，可以适用利用了抗生物素蛋白-生物素反应的方法。在该方法中，将例如血浆或血清中的HSP47用固相化的任意“特异性识别HSP47的抗体”捕捉，使捕捉到的HSP47与用生物素标记的“特异性识别HSP47的抗体”之间发生抗原抗体反应。该反应所需要的时间从需要迅速测定的观点来看，优选I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。然后加入酶标记抗生物素蛋白链菌素，进行抗生物素蛋白-生物素反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为5分钟?I小时，更优选15分钟?30分。然后通过对该酶进行检测，特异性地检测HSP47。上述生物素标记“特异性识别HSP47的抗体”可以通过将生物素与“特异性识别HSP47的抗体”通过本身公知的方法结合来制造。例如，可以使用市售的生物素标记化试剂盒，使生物素与“特异性识别HSP47的抗体”结合。酶标记抗生物素蛋白链菌素可以优选使用市售的产品。
[0100]此外，还可以适用利用了酶标记抗体的夹心ELISA法。在该方法中，将例如血液中的HSP47用固相化的任意“特异性识别HSP47的抗体”进行捕捉，使捕捉到的HSP47与酶标记的“特异性识别HSP47的抗体”之间进行抗原抗体反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。然后通过对该酶进行检测，检测HSP47。酶标记抗体可以通过将酶与“特异性识别HSP47的抗体”通过本身公知的方法、例如戊二醛法、马来酰亚胺法等进行结合(标记)来制造。
[0101]而且，从通用性的观点来看，还可以适用利用了第二抗体的夹心ELISA法。在该方法中，将例如血液中的HSP47用固相化的任意“特异性识别HSP47的抗体”进行捕捉，使捕捉到的HSP47与不同于固相化的抗体的动物种来源的“特异性识别HSP47的抗体”(在该段落中记为第一抗体)之间进行抗原抗体反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。例如，如果固相化的“特异性识别HSP47的抗体”为兔来源，则作为第一抗体使用兔以外的动物种来源、例如小鼠来源的抗体进行反应。然后，使第一抗体与酶标记的“识别第一抗体的抗体”(在该段落中记为第二抗体)之间进行抗原抗体反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。最后，通过对该酶进行检测，检测HSP47。酶标记第二抗体可以优选使用市售的产品。
[0102]作为酶标记抗生物素蛋白链菌素以及酶标记抗体中的”酶”，可以示例出，过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶等。[0103]作为酶的检测中使用的底物试剂，可以根据选择的标记酶适当选择。例如，作为酶，在选择过氧化物酶的情况下，可以使用邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(TMB)等；在选择碱性磷酸酶的情况下，可以使用对硝基酚磷酸盐(PNPP)等。此外，反应终止液、底物溶解液也可以根据所选择的酶适宜使用传统公知的那些，没有特殊限制。
[0104]在不使用夹心ELISA法的情况下，通过适用通常的ELISA法，是可以检测的。例如，在步骤(I)中，将受试者来源的血液中的HSP47像上述方法那样结合于固相，然后，与标记的“特异性识别HSP47的抗体”之间进行抗原抗体反应，形成复合体。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。然后采用与标记匹配的方法，可以进行HSP47的检测。
[0105]在作为步骤(2)的检测方法选择免疫色谱法的情况下，对于线性地固相化在硝酸纤维素膜等吸水性基体材料上的“特异性识别HSP47的抗体”，通过从膜下部对例如血液进行展开，捕捉HSP47，并使捕捉到的HSP47与标记的“特异性识别HSP47的抗体”之间进行抗原抗体反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。采用与标记匹配的方法，可以检测HSP47。
[0106]用于实施免疫色谱法的2种“特异性识别HSP47的抗体”同样只要是表位不发生竞争的抗体之间的组合即可，可以是单克隆抗体之间的组合、多克隆抗体之间的组合、或单克隆抗体与多克隆抗体的组合。
[0107]在作为步骤(2)的检测方法选择FIA法的情况下，使用将上述EIA法中使用的“特异性识别HSP47的抗体”上结合的酶用荧光物质取代而得到的抗体，像上述方法那样进行夹心ELISA。然后，使用市售的测定仪器、荧光显微镜、共聚焦显微镜等检测荧光物质，从而检测 HSP47。作为荧光物质，优选可以利用 APC、PE、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、FITC、PerCP、Alexa(注册商标)Fluor、荧光素、罗丹明等化学物质。该化学物质可以采用本身公知的方法对抗体进行标记。
[0108]在作为步骤(2)的检测方法选择SPR法的情况下，在预先固相化有特异性识别HSP47的抗体的金属膜(传感器芯片)表面，使抗体与流至金属膜表面的血液中的HSP47相互作用，并以表面等离子体共振的经时变化的形式进行检测。在实施SPR法的情况下，固相化至作为传感器芯片的金属膜上的“特异性识别HSP47的抗体”可以是I种，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。此外，作为SPR的检测中利用的测定仪器，可以优选使用市售的测定仪器。
[0109]作为一个具体的例子，在适用EIA法的情况下，将从受试者采集的血液于室温振荡一定时间后，离心分离得到血清。然后，将该血清分注于固相化有任意“特异性识别HSP47的抗体”的微板，室温放置一定时间。洗涤平板除去未反应的抗原后，将生物素化的上述抗体溶液分注于平板，放置一定时间形成复合体。再对平板进行洗涤除去未反应的抗体后，将过氧化物酶标记抗生物素蛋白链菌素溶液分注于平板，室温下反应一定时间。将平板洗涤后，使之与TMB等发色底物溶液反应，进行复合体的检测。
[0110]作为其他具体例子，在适用免疫色谱法的情况下，用上述血清或经生理食盐水等稀释的血清浸润试验片进行展开。试验片中，长条形状的抗体固相化支持体的下端侧通过一端层叠有粒状标记物保持承载体、以及滤纸制成的液体试样吸收用承载体，另一方面，所述抗体固相化支持体的上端侧通过一端层叠有滤纸制成的吸水性承载体。上述抗体固相化支持体中，在硝酸纤维素片上固相化有与HSP47进行抗原抗体反应的“特异性识别HSP47的抗体”。固相化可以通过将上述抗体溶液涂布于硝酸纤维素片上并进行干燥来进行。固相化的抗体特异性识别展开的血清中的HSP47，能够捕捉HSP47与粒状标记的上述抗体的复合体。因此，如果将“特异性识别HSP47的抗体”线性地固相化于抗体固相化支持体上，该线就会因粒状标记而着色，从而能够判断该血液中存在HSP47。
[0111]在步骤(3)中，根据上述步骤(2)中检测的复合体的量计算出生物体试样中HSP47的量。
[0112]步骤(2)中检测的复合体的量(浓度)可以通过将荧光强度或吸光度等信号应用于另行制作的标准曲线来进行测定。受试者的生物体试样中的HSP47的浓度可以通过用从标准曲线求出的浓度乘以稀释倍率来进行定量。
[0113]标准曲线以将所述标准HSP47蛋白质标准品梯度稀释而得到的试样浓度作为横轴(纵轴)，以与标准HSP47蛋白质标准品中的HSP47结合的特异性识别HSP47的抗体的信号(以任意单位表示)作为纵轴(横轴)，描绘测定值以近似式来表示。标准曲线通过将两轴用对数表示，可以近似地表示为直线。
[0114]然后，对受试者来源的生物体试样中的HSP47的量与罹患急性肺损伤的可能性之间赋予相关性，基于该相关，判定受试者是否患有急性肺损伤。如后述的实施例所示，与健康正常者、慢性进行性间质性肺炎的患者相比较，急性肺损伤患者的生物体试样中的HSP47量高。此外，和认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病的患者相比，急性肺损伤患者的生物体试样中的HSP47量高。上述判定是基于这样的受试者来源的生物体试样中的HSP47量与罹患急性肺损伤的可能性之间的正相关来进行的。
[0115]例如，从健康正常者或慢性进行性间质性肺炎的患者(阴性对照)、以及急性肺损伤的患者(阳性对照)采集生物体试样(例如血清)，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与阳性对照以及阴性对照中的该量进行比较。或者，也可以预先制作特定生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤罹患率的相关图，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较。HSP47量的比较优选基于有无显著差异来进行。
[0116]于是，通过HSP47量的比较结果，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性相对低。此外，在采用本发明的方法(I)鉴别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎的情况下，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者不是慢性进行性间质性肺炎、而是患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者不是急性肺损伤、而是患有慢性进行性间质性肺炎的可能性高。
[0117]或者，也可以预先设定生物体试样中的HSP47量的截留值，通过将测定得到的HSP47量与该截留值进行比较来进行。例如，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量为所述截留值以上的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量低于截留值的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性低。此外，在使用本发明的方法(I)鉴别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎的情况下，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量为所述截留值以上的情况下，可以判定该受试者不是慢性进行性间质性肺炎、而是患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量低于截留值的情况下，可以判定该受试者不是急性肺损伤、而是患有慢性进行性间质性肺炎的可能性高。
[0118]“截留值”是在将该值作为标准来进行疾病、状态的判定的情况下，能够满足高的诊断灵敏度(真正类率)以及高的诊断特异性(真负类率)这两者的值。例如，可以将急性肺损伤患者显示出高阳性率、且健康正常人或慢性进行性间质性肺炎或其他呼吸器官疾病的患者显示出高阴性率的HSP47的量设定为截留值。例如，在作为生物体试样使用末梢血血清对受试者是否患有急性肺损伤进行判定的情况下，作为合适的截留值，可以列举出100?1500pg/ml之间的值，优选200?1300pg/ml之间的值，更优选300?1200pg/ml之间的值，更优选400?1000pg/ml之间的值，最优选500?900pg/ml之间的值。此外，在作为生物体试样使用末梢血血清来鉴别急性肺损伤和慢性进行性间质性肺炎的情况下，作为合适的截留值，可以列举出100?1500pg/ml之间的值,优选200?1300pg/ml之间的值,更优选300?1200pg/ml之间的值，更优选400?1000pg/ml之间的值，最优选500?900pg/ml之间的值。
[0119]另一方面，通过使用本发明的方法(I)，能够鉴别急性肺损伤和认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病。急性肺损伤的临床所见与上述疾病的临床所见类似，但认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病中不存在胶原合成亢进的原因，因而在生物体试样中HSP47的量不增大。
[0120]具体地，例如，从健康正常者或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病的患者(阴性对照)、以及急性肺损伤的患者(阳性对照)采集生物体试样(例如血清)，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47的量与阳性对照以及阴性对照的该量进行比较。或者，也可以预先制作特定的生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤罹患率的相关图，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较。HSP47量的比较优选基于显著差异的有无来进行。
[0121]于是，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者不是患有认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病，而是患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者不是患有急性肺损伤，而是患有认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病的可能性高。
[0122]此外，本发明提供包含上述特异性识别HSP47的抗体的急性肺损伤的诊断试剂。该诊断试剂可以是急性肺损伤的诊断用试剂盒。若使用本发明的诊断试剂，可以在上述本发明的方法(I)中，通过采用免疫学方法对受试者来源的生物体试样中的HSP47进行定量，容易地判定受试者是否患有急性肺损伤，或者识别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病。
[0123]该抗体可以直接或间接用标记物质进行标记。作为标记物质，可以列举出，荧光物质(例如FITC、罗丹明)、放射性物质(例如14C、3H、125I)、酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶)、着色粒子(例如金属胶体粒子、着色胶乳)、生物素等。
[0124]该抗体可以以水溶液的状态使用，但优选结合于固相。作为该“固相”，可以列举出，平板(例如微孔板)、管、珠(例如塑料珠、磁珠)、色谱用承载体(例如Sepharose (商标))、膜(例如硝酸纤维素膜、PVDF膜)、凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)、金属膜(例如金月旲)等。
[0125]本发明的诊断试剂中除了包含特异性识别HSP47的抗体以外，还可以包含对生物体试样中的HSP47量进行定量时使用的试剂等，这些试剂等可以预先与特异性识别HSP47的抗体一起，也可以收纳在不同容器中。作为试剂等，可以列举出，处理液、用于稀释抗体的缓冲液、第二抗体、标记物质(例如荧光染料、酶)、反应容器、阳性对照(例如重组HSP47)、阴性对照、固相、记载有检查规程的说明书等。这些要素也可以视需要预先混合。
[0126]此外，胶原具有与HSP47特异性结合的性质，因而在其他方面中，本发明方法中的HSP47的定量可以替代“特异性识别HSP47的抗体”、或在其基础上使用“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”。
[0127]利用使用胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的方法(本发明的方法(2))对HSP47进行定量，例如包括以下的步骤:
[0128](I’ )使受试者来源的生物体试样和胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段相接触，形成生物体试样中的HSP47和胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的复合体的步骤；
[0129](2’ )对上述步骤(I)中形成的复合体进行检测的步骤；以及
[0130](3’)从上述步骤(2)中检测的复合体的量算出生物体试样中的HSP47量的步骤。
[0131]步骤(I’ )是使受试者来源的生物体试样和胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段接触、形成生物体试样中的HSP47和胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的复合体的步骤。
[0132]本发明的方法中使用的胶原是哺乳动物胶原。作为哺乳动物，可以列举出例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，兔等实验动物，猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等家畜，犬、猫等宠物，人、猴、食蟹猕猴、罗猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等，但不限于此。本发明的方法中使用的胶原优选是与受试者同一种哺乳动物的胶原。例如，在受试者为人的情况下，优选使用人胶原。
[0133]而且，在本说明书中，“人胶原”是指胶原的氨基酸序列具有与在人的天然表达的胶原的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0134]作为本发明的方法中使用的胶原，具有与HSP47特异性结合的性质即可，可以是任何类型的胶原。哺乳动物胶原包括type I?XXVII的27个类型。哺乳动物胶原优选type I?V,更优选type I。已知至少type I?V的哺乳动物胶原与HSP47 (Natsume T.etal.，J.Biol.Chem.，269，31224-31228，1994)结合。
[0135]胶原通常是包含3条多肽的3股螺旋(triple helix)。例如，type I胶原是含2条a I链(type I)和I条a 2链(type I)的3股螺旋。人type I胶原的a I链的典型氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，人type I胶原的a 2链的典型氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0136]“具有对HSP47的特异性结合性的胶原的部分片段”具有对HSP47的特异性结合性即可，还可以是胶原的任何区域的部分片段。具有对HSP47的特异性结合性的胶原的部分片段通常是含3条部分肽(在将构成胶原的3条多肽作为多肽A、B以及C的情况下，各部分肽分别为多肽A的片段、多肽B的片段以及多肽C的片段)的3股螺旋。[0137]“具有对HSP47的特异性结合性的胶原的部分片段”中所含的3条部分肽的大小通常是9个氨基酸以上、优选12个氨基酸以上、更优选15个氨基酸以上、更优选18个氨基酸以上。
[0138]“具有对HSP47的特异性结合性的胶原的部分片段”中所含的3条部分肽分别包含构成胶原的多肽中所含的Gly-Xaa-Yaa(式中，Xaa以及Yaa表示任意氨基酸)重复例如4次以上、优选5次以上、更优选6次以上。
[0139]为了确保对HSP47的特异性结合性，该部分片段优选在Yaa的部位包含精氨酸残基，其对于每 I 个片段至少包含 I 个(Koide, T.et al.，J.Biol.Chem.，281，3432-3438，2006)。
[0140]而且，为了确保对HSP47的特异性结合性，优选“胶原的对HSP47具有特异性结合性的部分片段”中所含的至少I个部分肽包含至少I个Yaa^-Gly-XaaH-Arg-Gly所表示的氨基酸序列(式中，Xaa—1为任意氨基酸(优选Pro)，Yaa_3为任意氨基酸(优选Thr、Pro、Ser、Hyp、Val、Ala、lie、Leu、Asn、Met、His、Phe 或 Tyr,更优选 Thr> Pro、Ser、Hyp、Val 或Ala,更优选Thr或Pro,最优选Thr)。在一类优选的实施方式中，Yaa3-Gly-Xaa4-Arg-Gly是 Thr-Gly-Pro-Arg-Gly (参照 Koide T.et al.，J.Biol.Chem.281，11177-11185，2006)。
[0141]在本说明书中，“任意氨基酸”包含Ala、Cys> Asp、Glu、Phe> Gly、His、lie、Lys>Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp> Tyr 以及 Hyp。
[0142]关于特异性结合HSP47的胶原或其部分片段、对于与HSP47的特异性结合而言重要的胶原中的氨基酸序列，在以参考的形式并入本说明书中的下述文献中有详细描述:Koide, T.et al.，J.Biol.Chem.277,6178-6182, 2002 ；Tasab, M.et al.，J.Biol.Chem.277，35007-35012,2002 ；Koide, T., et al.，J.Biol.Chem.281，3432-3438，2006 ;以及 Natsume，T.et al.，J.Biol.Chem.26.9，31224-31228，1994，本领域技术人员基于本说明书的记载以及这些文献等，能够容易地得到与HSP47特异性结合的胶原或其部分片段。
[0143]HSP47的定量中使用的、胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段除了胶原本身来源的氨基酸序列以外，还可以包含I或2个以上(例如I?500个、优选I?100个左右、更优选I?15个左右)的添加的氨基酸。关于这样的氨基酸添加，只要胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段能够特异性识别HSP47即是允许的。对被添加的氨基酸序列没有特殊限制，可以列举出例如，末端甲硫氨酸(first methionine)、半胱氨酸、用于使多肽的检测、纯化等变得容易的标签。作为标签，可以示例出，Flag标签、组氨酸标签、c-Myc标签、HA标签、AUl标签、GST标签、MBP标签、荧光蛋白质标签(例如GFP、YFP、RFP、CFP、BFP等)、免疫球蛋白Fe标签等。氨基酸序列添加的位置优选是多肽的N末端或C末端。
[0144]本发明中使用的胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段优选是经分离或纯化的。“分离或纯化”是指实施从天然状态将目的成分以外的成分除去的操作。经分离或纯化的胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的纯度(相对于总蛋白质重量的、胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的重量比例)通常是50%以上、优选70%以上、更优选90%以上、最优选95%以上(例如基本上100%)。
[0145]本发明的方法中使用的胶原或胶原与HSP47具有特异性结合性的部分片段的N末端以及C末端的氨基酸残基的氨基可以用保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1-6烷酰基等C1-6酰基等)保护。
[0146]所述胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段可以直接或间接用标记物质标记。作为标记物质，可以列举出，荧光物质(例如FITC、罗丹明)、放射性物质(例如14(:、咕、1251)、酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶)、着色粒子(例如金属胶体粒子、着色胶乳)、生物素等。
[0147]如果 是这样的胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段，则在本步骤中可以仅使用I种胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段，也可以使用2种以上。
[0148]在HSP47的定量中使用重组胶原的情况下，重组胶原可以采用例如以下的方法制作。将编码胶原亚基氨基酸序列的多核苷酸(例如，在人Typel胶原的情况下，为含SEQID NO:3以及SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列(GeneBank登录号:NM_000088.3以及NM_000089.3)的多核苷酸)组入合适的表达载体，将其插入合适的宿主并进行转化，使胶原亚基分子在宿主内汇合，可以从该转化体的培养上清得到作为目标的重组胶原。对于上述宿主细胞没有特殊限定，可以使用传统上用于基因工程方法的各种宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物或动物细胞等。
[0149]除了由上述转化体产生的重组蛋白质之外，胶原还可以是从产生其的天然细胞或其培养上清通过本身公知的蛋白质分离纯化技术分离或纯化的蛋白质。此外，还可以是化学合成或者利用无细胞翻译体系生物化学合成的蛋白质。
[0150]上述“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”也可以以水溶液的状态使用，但优选结合于固相。作为该“固相”，可以列举出，平板(例如微孔板)、管、珠(例如塑料珠、磁珠)、色谱用承载体(例如S^harose (商标))、膜(例如硝酸纤维素膜、PVDF膜)、凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)、金属膜(例如金膜)等。其中，优选使用平板、珠、膜以及金属膜，从操作的简便性来看，最优选平板。作为上述结合，可以列举出，共价键、离子键、物理吸附等，没有特殊限制，共价键和/或物理吸附能够获得充分的结合强度，因而优选。此外，对固相的结合，可以是直接结合于固相，也可以利用本身公知的物质间接地结合于固相。而且，为了抑制非特异性吸附、非特异性反应，一般使牛血清白蛋白(BSA)、牛乳蛋白等的磷酸缓冲溶液与固相接触，将未被抗体包覆的固相表面部分用所述BSA、牛乳蛋白等进行封闭。
[0151]本步骤中的“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”与受试者来源的生物体试样中所含的“HSP47”的接触，只要是能够在反应容器中通过将该生物体试样和胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段混合而使它们相互作用的方法即可，对于形态、顺序、具体方法等没有特殊限制。接触可以通过例如在固相化有“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”的平板上添加该生物体试样(的抽提液)来进行。
[0152]而且，对于保持该接触的时间没有特殊限制，只要是对于所述胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段与受试者来源的生物体试样中所含的HSP47结合、形成复合体而言的充分的时间即可，通常为数秒?十几小时，从快速判定是否为急性肺损伤的观点来看，优选I分钟?2小时，最优选2分钟?30分钟。此外，作为进行接触的温度条件，通常为4V?50°C，优选4°C?37°C，最优选15°C?30°C左右的室温。而且，进行反应的pH条件优选5.0?9.0，特别优选6.0?8.0的中性区域。
[0153]步骤(2’ )是通过对上述步骤(I’)中形成的复合体进行检测，判定上述生物体试样中是否存在HSP47的步骤。
[0154]上述检测可以通过检测复合体中所含的“HSP47”来进行。该检测可以利用酶免疫测定法(EIA法)、免疫色谱法、胶乳凝集法、放射免疫测定法(RIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)、冷光免疫测定法、表面等离子体共振测定法(SPR法)等。这其中，EIA法、免疫色谱法、FIA法以及SPR法从操作的容易性以及迅速性的观点来看是合适的。
[0155]在作为步骤(2’ )的检测方法选择EIA法的情况下，EIA法优选是ELISA法。
[0156]作为ELISA法的一种，可以适用利用了酶标记抗体的ELISA法。在该方法中，将例如血液中的HSP47用固相化的任意“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”进行捕捉，使捕捉到的HSP47与酶标记的“特异性识别HSP47的抗体”之间进行抗原抗体反应。从需要迅速测定的观点来看，该反应所需要的时间优选为I分钟?2小时，更优选2分钟?30分钟。然后通过对该酶进行检测，检测HSP47。酶标记抗体可以通过将酶与“特异性识别HSP47的抗体”采用本身公知的方法、例如戊二醛法、马来酰亚胺法等进行结合(标记)来制造。
[0157]而且，“特异性识别HSP47的抗体”的定义同上述。
[0158]作为酶标记抗体中的“酶”，可以示例出，过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、 半乳糖苷酶等。
[0159]作为酶的检测中使用的底物试剂，可以根据选择的标记酶适当选择。例如，作为酶，在使用过氧化物酶的情况下，可以使用邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(TMB)等；在选择碱性磷酸酶的情况下，可以使用对硝基酚磷酸盐(PNPP)等。此外，反应终止液、底物溶解液也可以根据所选择的酶适宜使用传统公知的那些，没有特殊限制。
[0160]作为一个具体的例子，在适用上述ELISA法的情况下，将从受试者采集的血液于室温振荡一定时间后，离心分离得到血清。然后，将该血清分注于固相化有任意“胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段”的微板，室温放置一定时间。洗涤平板除去未反应的抗体后，将用过氧化物酶等标记的特异性识别HSP47的抗体的溶液分注于平板，室温进行一定时间的反应。洗涤平板后，使之与TMB等发色底物溶液进行反应，进行复合体的检测。
[0161]在步骤(3’ )中，由上述步骤(2’ )中检测的复合体的量计算出生物体试样中的HSP47 量。
[0162]步骤(2’ )中检测的复合体的量(浓度)可以通过将荧光强度或吸光度等信号应用于另行制作的标准曲线来进行测定。受试者的生物体试样中的HSP47的浓度可以通过用从标准曲线求出的浓度乘以稀释倍率来进行定量。
[0163]标准曲线以将所述标准HSP47蛋白质标准品梯度稀释而得到的试样浓度作为横轴(纵轴)，以与标准HSP47蛋白质标准品中的HSP47结合的抗体的信号(以任意单位表示)作为纵轴(横轴)，描绘测定值以近似式来表示。标准曲线通过将两轴用对数表示，可以近似地成为直线。
[0164]然后，对受试者来源的生物体试样中的HSP47量与患有急性肺损伤的可能性之间赋予相关性，基于该相关，判定受试者是否患有急性肺损伤。如后述的实施例所示，与健康正常者、慢性进行性间质性肺炎的患者相比较，急性肺损伤患者的生物体试样中的HSP47量高。上述判定是基于这样的受试者来源的生物体试样中的HSP47量与患有急性肺损伤的可能性之间的正相关来进行的。
[0165]例如，从健康正常者或慢性进行性间质性肺炎的患者(阴性对照)、以及急性肺损伤的患者(阳性对照)采集生物体试样(例如血清)，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与阳性对照以及阴性对照中的该量进行比较。或者，也可以预先制作特定的生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤罹患率的相关图，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较。HSP47量的比较优选基于有无显著差异来进行。
[0166]于是，通过HSP47量的比较结果，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者患有急性肺损伤的可能性相对低。此外，在采用本发明的方法(2)鉴别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎的情况下，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者不是慢性进行性间质性肺炎、而是患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者不是急性肺损伤、而是患有慢性进行性间质性肺炎的可能性高。
[0167]另一个方面，通过使用本发明的方法(2)，能够鉴别急性肺损伤和认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病。急性肺损伤的临床所见与上述疾病的临床所见类似，但认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病中不存在胶原合成亢进的原因，因而在生物体试样中HSP47的量不增大。
[0168]具体地，例如，从健康正常者或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病的患者(阴性对照)、以及急性肺损伤的患者(阳性对照)采集生物体试样(例如血清)，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与阳性对照以及阴性对照的该量进行比较。或者，也可以预先制作特定的生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤罹患率的相关图，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较。HSP47量的比较优选基于显著差异的有无来进行。
[0169]于是，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者不是认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病，而是患有急性肺损伤的可能性相对高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者不是急性肺损伤，而是患有认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病的可能性高。
[0170]此外，本发明提供包含上述胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段的急性肺损伤的诊断试剂。该诊断试剂可以是急性肺损伤的诊断用试剂盒。若使用本发明的诊断试剂，可以在上述本发明的方法(2)中，通过采用免疫学方法对受试者来源的生物体试样中的HSP47进行定量，容易地判定受试者是否患有急性肺损伤，或者识别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎或认为与急性肺损伤具有共同的临床所见的上述疾病。
[0171]胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段可以以未与任何物质结合的水溶液的状态使用，但优选结合于固相。作为该“固相”，可以列举出，平板(例如微孔板)、管、珠(例如塑料珠、磁珠)、色谱用承载体(例如Sepharose (商标))、膜(例如硝酸纤维素膜、PVDF膜)、凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)、金属膜(例如金膜)等。
[0172]本发明的诊断试剂中除了包含胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段以外，还可以包含对生物体试样中的HSP47量进行定量时使用的试剂等，这些试剂等可以预先与胶原或胶原的与HSP47具有特异性结合性的部分片段一起，也可以收纳在不同容器中。作为试剂等，可以列举出处理液、用于稀释抗体的缓冲液、受试者来源的特异性识别HSP47的抗体、标记物质(例如荧光染料、酶)、反应容器、阳性对照(例如重组HSP47)、阴性对照、固相、记载有检查规程的说明书等。这些要素也可以视需要预先混合。
[0173](2)在满足急性肺损伤的临床定义前的超急性期将热休克蛋白47作为用于预测急性肺损伤发病的生物标记物使用
[0174]在本发明的其他实施方式中，在满足急性肺损伤的临床定义前的超急性期，通过对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量，可以预测急性肺损伤的发病。
[0175]在本实施方式中，“受试者”可以是未满足急性肺损伤的临床定义的受试者。作为该受试者，除了健康正常者之外，还可以列举出患有间质性肺炎的受试者、患有细菌性肺炎或吸入性肺炎等急性呼吸器疾病的受试者，但不限于此。该受试者可以是未显示急性肺损伤的临床所见的受试者。
[0176]上述受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47的定量可以像上述本发明的方法(I)以及本发明的方法(2)中的定量那样来进行。
[0177]对上述受试者来源的生物体试样中的HSP47量与急性肺损伤发病的可能性之间赋予相关性，基于该相关来判定受试者是否发生急性肺损伤。在上述受试者中，生物体试样中的HSP47量高，则急性肺损伤发病的可能性高。上述判定是基于这样的受试者来源的生物体试样中的HSP47量与急性肺损伤发病的可能性之间的正相关来进行的。
[0178]上述判定也可以通过例如，预先制作特定的生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤发病的可能性之间的相关图，并将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较来进行。
[0179]于是，根据HSP47量的比较结果，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对高的情况下，可以判定该受试者发生急性肺损伤的可能性高。相反地，在受试者来源的生物体试样中的HSP47量相对低的情况下，可以判定该受试者发生急性肺损伤的可能性低。
[0180]在间质性肺炎患者的随访中，在血清中HSP47上升的情况下，可以判断短时间引起急性加重、发生满足急性肺损伤的临床定义的急性进行性间质性肺炎的可能性高。间质性肺炎的急性加重在发病早期一般仅呈现感冒样症状，因而在许多案例中单纯地作为感冒处理，这期间重症化，最终致命。此外，即使在怀疑为间质性肺炎急性加重的情况下，只要重症化未达某种程度，就不会呈现出低氧血症、胸部X射线照片中的异常阴影，因而早期诊断难。但是，即使在间质性肺炎患者呈现甚轻微的症状的情况下，通过测定血清中的HSP47，在该值低的情况下能够判断为急性加重发病的可能性低，而在该值高的情况下能够判断为处于急性加重的超早期的可能性高。能够进行间质性肺炎患者的急性加重逐渐发病的超早期的诊断，此外即使在急性加重发病前也能够预测其发病。
[0181]此外，同样地，在细菌性肺炎、吸入性肺炎等急性呼吸器疾病中，通过测定血清中的HSP47，在该值低的情况下能够判断为重症化而发生急性肺损伤的可能性低，而在该值高的情况下，能够判断为处于逐渐重症化而发生急性肺损伤的超早期的可能性高。[0182](3)热休克蛋白47作为用于急性肺损伤的活动性把握、预后预测的生物标记物的使用
[0183]在本发明的其他实施方式中，通过对患有急性肺损伤的受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量，可以进行急性肺损伤的活动性把握、预后预测。
[0184]患有急性肺损伤的受试者的血清中的HSP47值与急性肺损伤的疾病活动性相关，因此通过测定血清中的HSP47，能够把握活动性、重症度，进行治疗效果判定、预后预测。
[0185]患有急性肺损伤的受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47的定量可以像上述本发明的方法(I)以及本发明的方法(2)中的定量那样来进行。
[0186]对患有急性肺损伤的受试者来源的生物体试样中的HSP47量与急性肺损伤的疾病活动性之间赋予相关性，基于该相关判定受试者中的急性肺损伤的活动性、重症度。该判定可以通过例如，预先制作特定的生物体试样(例如血清)中的HSP47量与急性肺损伤的疾病活动性的相关图，将从受试者采集的生物体试样中的HSP47量与该相关图进行比较来进行。
实施例
[0187]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限定。
[0188]受试者
[0189]作为对象的受试者是长崎大学医院的患者，其中有ALI (32例)、C0P(12例)、特发性 UIPd-UIP ；19 例)、特发性 NSIPd-NSIP ；16 例),CVD-UIP (11 例)XVD-NSIP (12 例)以及志愿的健康正常者(18例)。而且，ALI的病例中包括满足ALI的临床定义的急性进行性间质性肺炎。试验规程由伦理审查委员会(institutional review board)认可，由受试者获得了知情同意(informed consent)。更具体的临床背景如表I所示。表中，P/F比、A_aD02以及呼吸指数(Respiratory index)分别表示Pa02/Fi02 (mmHg)(动脉血氧分压除以吸入气氧分压)、肺泡气动脉血氧分压比较差(肺泡氧分压(PAO2)与动脉血氧分压(PaO2)的差)以及A-aD02/Pa02 (肺泡气动脉血氧分压比较差除以动脉血氧分压)，KL_6、SP_D、SP-A以及LDH显示出血清标记物的值。在将P/F比、A-aD02以及呼吸指数在ALI的患者与C0P、特发性ΠΡ、特发性NSIP、CVD-UIP、CVD-NSIP的患者之间分别进行比较的情况下，确认了统计学上的显著差异(p〈0.01)。
【权利要求】
1.一种用于判定受试者是否患有急性肺损伤的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其是辨别急性肺损伤与慢性进行性间质性肺炎的方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其是辨别急性肺损伤与主动脉夹层、急性心力衰竭、慢性心力衰竭急性加重、弥漫性肺泡出血、癌性淋巴管炎、复张性肺水肿、过量输液引起的肺水肿、神经源性肺水肿、肺结核或粟粒性结核的方法。
4.根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其中，生物体试样是血液、血清或血浆。
5.一种急性肺损伤的诊断试剂，其包含: 特异性识别热休克蛋白47的抗体，和/或 胶原或该胶原的与热休克蛋白47具有特异性结合性的部分片段。
6.一种用于判定受试者是否发生急性肺损伤的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
7.一种用于判定受试者的急性肺损伤的治疗效果或预测受试者的急性肺损伤的预后的方法，其包括对受试者来源的生物体试样中的热休克蛋白47进行定量。
【文档编号】G01N33/53GK103430026SQ201280014503
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年2月10日 优先权日:2011年2月10日
【发明者】角川智之, 横田伸一 申请人:国立大学法人长崎大学, 北海道公立大学法人札幌医科大学