专利名称：一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法。
背景技术：
沙丁胺醇(Sal)是β兴奋剂类物质的一种，可促进畜禽生长。由于β兴奋剂类物质易在畜禽脏器中积聚残留，并可通过食物链进入人体，严重危害人类健康，欧盟、美国、中国等国家和地区都先后立法禁止在畜禽生产中使用β兴奋剂类物质作为饲料添加剂。沙丁胺醇的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。在各种检测方法中，ELISA检测法适合应用于大批样品的检测，该法具有快速、操作简单和一次检测样品量大等优点，而且可以直接用于饲料、尿液、血液样品进行检测，但假阳性过高。HPLC和GC/MS方法均需要昂贵的仪器、复杂的样品处理程序以及专门的操作技能，且比较费时，因此不适合用作大批样品的检测。目前，进行检测时，一般应用ELISA试剂盒进行筛检，再用其他方法对阳性样品进行确认，从而可确保检测结果的可靠性。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提出一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，可实现对动物源性样品中沙丁胺醇的快速、高效的检测。为了达到上述目 的，本发明提供的技术方案为—种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，包括如下内容在微间隙阵列电极上固定沙丁胺醇-牛血清白蛋白(以下简称SAL-BSA)，将动物源性样品与SAL单克隆抗体混合后加在微间隙阵列电极上，动物源性样品中的SAL与微间隙阵列电极上的SAL-BSA竞争SAL单克隆抗体；然后依次加入碱性磷酸酶标记的二抗和银沉积溶液；测定微间隙阵列电极的电导率，再根据微间隙阵列电极的电导率测定动物源性样品中SAL的浓度。所述方法具体包括如下步骤( I)标准工作曲线制作取等体积的浓度分别为O. lng/mL、0. 5ng/mL、1. 0ng/mL、5. 0ng/mL、25. Ong/mL、125. Ong/mL,250. Ong/mL的SAL标准品，将上述各SAL标准品分别与SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应O. 5 1. 5h，SAL标准品SAL单克隆抗体混合物中SAL标准品与SAL单克隆抗体的体积相等，加入的SAL与固定在微间隙阵列电极表面的SAL-BSA竞争SAL单克隆抗体，未反应的SAL单克隆抗体被固定在微间隙阵列电极上，形成BSA-SAL-单抗复合物；然后在微间隙阵列电极上加入与SAL标准品SAL单克隆抗体混合物等体积的稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应25 35min，酶标二抗被固定到电极上，形成BSA-SAL-单抗-二抗复合物；再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应10 20min，碱性磷酸酶(AP)催化抗坏血酸磷酸酯(AAP)水解生成的抗坏血酸，将Ag+还原成Ag单质，从而增大了微间隙阵列电极的电导率，洗净吹干后将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接(CHI760B型电化学工作站有三个电极，包括工作电极、对电极、参比电极，微间隙阵列电极只有正、负两端，因此在检测的过程中，需要将对电极和参比电极复合，然后与微间隙阵列电极的一端相连)；采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值，所述响应曲线的横坐标为电压，纵坐标为电流，电导值=电流/电压；根据不同浓度的SAL标准品对应的微间隙阵列电极的电导值获得标准工作曲线，所述标准工作曲线的横坐标为SAL的浓度，单位为ng/ml，纵坐标为l-S/X，S0为检测空白样品的电导值，S为检测含不同浓度SAL标准品的电导值；(2)检测动物源性样品中的SAL :取动物源性样品，将样品与其等体积的SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应O. 5 1. 5h ;然后在微间隙阵列电极上加入与样品SAL单克隆抗体混合物等体积的稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应O. 5 1. 5h ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应10 20min，洗净吹干；将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接；采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；再根据该电导值与标准工作曲线求得样品中SAL的浓度。其中，在制作标准工作曲线前对微间隙阵列电极进行预处理用无水乙醇清洗微间隙阵列电极；将微间隙阵列电极浸入IM的NaOH溶液中25 35min，然后用超纯水清洗该微间隙阵列电极，吹干；再将微间隙阵列电极浸入SAL-BSA溶液中，4°C过夜后用超纯水清洗微间隙阵列电极，吹干，于4°C保存。所述微间隙阵列电极由光刻印刷法制作。所述微间隙阵列电极为叉指式双电极，其正负电极均为两个梳形金电极，梳形金电极的梳齿宽为80 120 μ m，优选为100 μ m，梳齿间 隙为15 25 μ m，优选为20 μ m。与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)方法新颖，操作步骤简单，成本低廉，可实现对大批量样品进行同时检测；(2)灵敏度高，可实现浓度为O.1ng/mL的动物源中沙丁胺醇的检测，达到我国食品中沙丁胺醇的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中沙丁胺醇进行快速筛查和检测；(3)解决了金标快速检测卡只能定性或者半定量的问题，克服了色谱法成本高、操作复杂的难题，实现真正意义上的定量检测，数据真实可靠；在国内外首次将该技术应用于食品、环境等领域的检测，特别适用于食品安全检测机构和监管部门的检测。本发明适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性样品中的沙丁胺醇进行定量检测，可望成为食品样品中沙丁胺醇的筛查提供有效的技术手段。
图1是微间隙阵列电极结构示意图，黑色封闭区域为金线，图中数值单位为mm ；
图2为微间隙阵列电极中单个电极放大后的示意图，梳齿宽lOOum，梳齿间隙20um,电极孔径2. 9mm ；图3为SAL的响应曲线，横坐标为电压V，纵坐标为电流A，电导=电流/电压，单位西门子S ；图4为SAL的标准工作工作曲线图，横坐标为SAL的浓度(ng/ml，纵坐标为1_S/Stl，其中Stl为检测空白样品的电导，S为检测含不同浓度沙丁胺醇样品的电导，单位％。
具体实施例方式实施例1·一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，包括如下步骤( I)对微间隙阵列电极进行预处理用无水乙醇清洗微间隙阵列电极三次，每次Imin ;将微间隙阵列电极浸入IM的NaOH溶液中30min，然后用超纯水清洗该微间隙阵列电极三次，每次lmin，吹干；再将微间隙阵列电极浸入SAL-BSA溶液中，4°C过夜后用超纯水清洗微间隙阵列电极三次，吹干，于4°C保存；其中，所述微间隙阵列电极由光刻印刷法制作，所述微间隙阵列电极的正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉形成微间隙阵列电极，梳形金电极的梳齿宽为100 μ m，梳齿间隙为20 μ mo(2)标准工作曲线制作取浓度分别为O. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、5. 0ng/mL、25. Ong/mL、125. Ong/mL、250. Ong/mL的SAL标准品各50 μ L，将上述各SAL标准品分别与50 μ LSAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入ΙΟΟμ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应30min ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min，洗净吹干，将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接(CHI760B型电化学工作站有三个电极，包括工作电极、对电极、参比电极，微间隙阵列电极只有正、负两端，因此在检测的过程中，需要将对电极和参比电极复合，然后与微间隙阵列电极的一端相连);采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线(见图3)，并计算其电导值；根据不同浓度的SAL标准品对应的微间隙阵列电极的电导值获得标准工作曲线(见图4)；(2 )检测动物源性样品中的SAL 饲料样品饲料样品粉碎通过0.45mm孔径筛，取3g试样于50ml离心管中，加入25ml水,混勻后置于超声波水浴中超声30min,定性滤纸过滤或3000rpm离心5min,取上清液检测；取上述饲料样品50 μ L与50 μ L SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入100μ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应Ih ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min，洗净吹干；将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接；采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；再根据该电导值与标准工作曲线求得样品中SAL的浓度。七次测定并根据工作曲线计算得到样品中SAL浓度平均值为31. 2±1.1ng/mL，与七次液相色谱法结果30. 3±2. Ong/mL吻合。结果表明，该方法可以对动物源性样品中SAL进行定量检测。实施例2一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，包括如下步骤( I)对微间隙阵列电极进行预处理用无水乙醇清洗微间隙阵列电极三次，每次Imin ;将微间隙阵列电极浸入IM的NaOH溶液中30min，然后用超纯水清洗该微间隙阵列电极三次，每次lmin，吹干；再将微间隙阵列电极浸入SAL-BSA溶液中，4°C过夜后用超纯水清洗微间隙阵列电极三次，吹干，于4°C保存；其中，所述微间隙阵列电极由光刻印刷法制作，所述微间隙阵列电极的正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉形成微间隙阵列电极，梳形金电极的梳齿宽为100 μ m，梳齿间隙为20 μ mo(2)标准工作曲线制作取浓度分别为O. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、5. 0ng/mL、25. Ong/mL、125. Ong/mL、250. Ong/mL的SAL标 准品各50 μ L，将上述各SAL标准品分别与50 μ L SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入ΙΟΟμ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应30min ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min,洗净吹干,将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接(CHI760B型电化学工作站有三个电极，包括工作电极、对电极、参比电极，微间隙阵列电极只有正、负两端，因此在检测的过程中，需要将对电极和参比电极复合，然后与微间隙阵列电极的一端相连);采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线(见图3)，并计算其电导值；根据不同浓度的SAL标准品对应的微间隙阵列电极的电导值获得标准工作曲线(见图4)；(2 )检测动物源性样品中的SAL 尿液样品直接进行测试，如有浑浊则需过滤或3000rpm离心5min，取上清液检测；取上述尿液样品50 μ L与50 μ L SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入100μ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应Ih ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min，洗净吹干；将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接；采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；再根据该电导值与标准工作曲线求得样品中SAL的浓度。七次测定并根据工作曲线计算得到样品中SAL浓度平均值为11. 1±0. 6ng/mL，与七次液相色谱法结果10. 7±1. Ong/mL吻合。实施例3一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，包括如下步骤
(I)对微间隙阵列电极进行预处理用无水乙醇清洗微间隙阵列电极三次，每次Imin ;将微间隙阵列电极浸入IM的NaOH溶液中30min，然后用超纯水清洗该微间隙阵列电极三次，每次lmin，吹干；再将微间隙阵列电极浸入SAL-BSA溶液中，4°C过夜后用超纯水清洗微间隙阵列电极三次，吹干，于4°C保存；其中，所述微间隙阵列电极由光刻印刷法制作，所述微间隙阵列电极的正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉形成微间隙阵列电极，梳形金电极的梳齿宽为100 μ m，梳齿间隙为20 μ mo(2)标准工作曲线制作取浓度分别为O. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、5. 0ng/mL、25. Ong/mL、125. Ong/mL、250. Ong/mL的SAL标准品各50 μ L，将上述各SAL标准品分别与50 μ L SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入ΙΟΟμ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应30min ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min,洗净吹干,将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接(CHI760B型电化学工作站有三个电极，包括工作电极、对电极、参比电极，微间隙阵列电极只有正、负两端，因此在检测的过程中，需要将对电极和参比电极复合，然后与微间隙阵列电极的一端相连);采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线(见图3)，并计算其电导值；根据不同浓度的SAL标准品对应的微间隙阵列电极的电导值获得标准工作曲线(见图4)；(2 )检测动物源性样品中的SAL 动物组织样品称取IOg均质化的动物组织样本于50ml离心管中，加入20ml0.1MHCl溶液，超声提取15min，然后4000r/min离心lOmin，取上清液用IM NaOH调节pH值至10，加入20ml异丁醇萃取，取有机相水浴减压蒸干，用5ml PBS溶解；
取上述动物组织样品50 μ L与50 μ L SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应Ih ;然后在微间隙阵列电极上加入100μ L稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应Ih ;再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应15min，洗净吹干；将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接；采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；再根据该电导值与标准工作曲线求得样品中SAL的浓度。七次测定并根据工作曲线计算得到样品中SAL浓度平均值为8. 2±0. 5ng/mL,与七次液相色谱法结果8. 0±0. 9ng/mL吻合。
权利要求
1.一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述方法为在微间隙阵列电极上固定SAL-BSA，将动物源性样品与SAL单克隆抗体混合后加在微间隙阵列电极上，动物源性样品中的SAL与微间隙阵列电极上的SAL-BSA竞争SAL单克隆抗体；然后依次加入碱性磷酸酶标记的二抗和银沉积溶液；测定微间隙阵列电极的电导率，再根据微间隙阵列电极的电导率测定动物源性样品中SAL的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤(1)标准工作曲线制作a)取等体积的浓度分别为O. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、5. 0ng/mL、25. Ong/mL、 125. Ong/mL、250. Ong/mL的SAL标准品，将上述各SAL标准品分别与SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应O. 5 1. 5h，SAL标准品SAL单克隆抗体混合物中SAL 标准品与SAL单克隆抗体的体积相等；b)然后在微间隙阵列电极上加入与SAL标准品SAL单克隆抗体混合物等体积的稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应25 35min ；c)再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应10 20min，洗净吹干；d)将微间隙阵列电极一端与CHI760B型电化学工作站的工作电极连接，CHI760B型电化学工作站的对电极与CHI760B型电化学工作站的参比电极复合后再与微间隙阵列电极的另一端连接；e)采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录微间隙阵列电极电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值，所述响应曲线的横坐标为电压，纵坐标为电流，电导值= 电流/电压;f)根据不同浓度的SAL标准品对应的微间隙阵列电极的电导值获得标准工作曲线，所述标准工作曲线的横坐标为SAL的浓度，单位为ng/ml，纵坐标为1-S/、S0为检测空白样品的电导值，S为检测的含不同浓度SAL标准品的电导值；(2)检测动物源性样品中的SALa)取动物源性样品，将样品与其等体积的SAL单克隆抗体混合后加入到微间隙阵列电极上，37°C反应O. 5 1. 5h ;b)然后在微间隙阵列电极上加入与样品SAL单克隆抗体混合物等体积的稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗，37°C反应O. 5 1. 5h ;c)再在微间隙阵列电极上加入银增强溶液37°C避光反应10 20min，洗净吹干；d)按照步骤(I)同样的步骤将微间隙阵列电极与CHI760B型电化学工作站连接，并计算微间隙阵列电极的电导值；e)再根据该电导值与标准工作曲线比对，求得样品中SAL的浓度。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在制作标准工作曲线前对微间隙阵列电极进行预处理用无水乙醇清洗微间隙阵列电极；将微间隙阵列电极浸入IM的NaOH溶液中25 35min，然后用超纯水清洗该微间隙阵列电极，吹干；再将微间隙阵列电极浸入 SAL-BSA溶液中，4°C过夜后用超纯水清洗微间隙阵列电极，吹干，于4°C保存。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述微间隙阵列电极由常规光刻印刷法制作。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微间隙阵列电极为叉指式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，梳形金电极的梳齿宽为80 120 μ m，梳齿间隙为15 25 μ m。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梳形金电极的梳齿宽为100 μ m，梳齿间隙为20 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种基于微间隙阵列电极检测动物源性样品中沙丁胺醇的方法。该方法新颖，操作步骤简单，成本低廉，可实现对大批量样品进行同时检测；灵敏度高，可实现浓度为0.1ng/mL的动物源中沙丁胺醇的检测，达到我国食品中沙丁胺醇的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中沙丁胺醇进行快速筛查和检测；解决了金标快速检测卡只能定性或者半定量的问题，克服了色谱法成本高、操作复杂的难题，实现真正意义上的定量检测，数据真实可靠。本发明适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性样品中的沙丁胺醇进行定量检测，可望成为食品样品中沙丁胺醇的筛查提供有效的技术手段。
文档编号G01N27/04GK103048361SQ20131001187
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者刘佩, 付冠艳, 杨丽霞, 李乐, 刘彦哲, 彭新凯, 蒋健晖 申请人:长沙市食品质量安全监督检测中心, 湖南省食品安全生产工程技术研究中心