专利名称：Hplc-dad法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法。属于中药成分分析领域。
背景技术：
在现有技术中，苦碟子别名满天星，苦荬菜，主要分布于我国东北及内蒙古等地，为菊科植物抱莖苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的当年生干燥全草,性寒，味苦、辛，具有清热解毒、排脓止痛之功效[1]。苦碟子(碟脉灵)注射液是以苦碟子为原料提取精制而成的静脉注射液，具有活血化瘀，改善微循环的作用[2]。该注射液已上市多年，疗效确切。实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为核苷类、有机酸类和黄酮类成分。苦碟子注射液(曾用名:碟脉灵注射液)列入国家药品标准产品(国药准字Z20025450),由通化华夏药业有限责任公司生产。处方:抱莖苦荬菜IOOOg,制成1000ml。制法:取抱莖苦荬菜,加水煎煮二次,第一次I小时，第二次0.5小时,合并煎液，浓缩至每Iml相当于原生药0.5g,放冷至40°C以下，在搅拌下加10%氧化I丐乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中(使含醇量达80%)，力口50%硫酸溶液调节pH值至3 — 4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和PH值至7.0,滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每Iml相当于原生药4g，置-5°C以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1 — 0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置_5°C以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0 -
7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。性状:本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。含量测定:本品每IOml含总黄酮以无水芦丁(C27H3tlO16)计，不得少于4.0mg0含抱茎苦荬菜以腺苷(CltlH12N5O4)计，不得少于0.025mg。功能主治:活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见:胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。用法用量:静脉滴注，一次10 - 40ml，一日I次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250 - 500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。规格:每支装(I)10ml, (2) 20ml, (3) 40ml。实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为核苷类、有机酸类和黄酮类成分。核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，通过激活人体中的嘌呤受体发挥多种生理作用。如胞苷(cytidine)具有抗肿瘤和抗病毒等作用；尿苷(uridine)参与糖原合成，有助于提高细胞的耐缺氧能力，提高机体抗体水平，并可以阻断癌细胞和病毒的基因合成；鸟苷(guanosine)具有免疫调节的生理活性；特别是腺苷(adenosine)具有抗心肌缺血、抗凝血、抗炎、改善心脑血液循环、防止心率失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等作用，是苦碟子注射液质量控制的指标成分。因此，为了控制产品质量，对苦碟子注射液中的核苷类化合物建立快速、简便、准确的测定方法具有重要的实际意义。目前，核苷类化合物含量测定方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相-质谱法、毛细管电泳法等。紫外法与薄层法特异性较差，液-质与毛细管电泳法对仪器要求较高。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种采用HPLC-DAD技术建立同时测定10种核苷类化合物(5种核苷:尿苷、腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和5种碱基:尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)成分含量的分析方法，并应用该方法测定苦碟子注射液中主要核苷类化合物的含量，以期为注射液水溶性成分的进一步研究奠定基础，同时为其质量控制提供方法学参考依据。本发明的技术解决方案是=HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其步骤如下:
(O混合对照品溶液的配制:
分别精密称取胞嘧啶、尿嘧 啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷对照品适量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL'鸟嘌呤 20.00 μ g.mL'尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鸟苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合对照品溶液，超声溶解，摇匀，即得混合对照品储备液。(2)供试品溶液的配制:
取苦碟子注射液(药品成品)，采用0.45 ym微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测。(3)测定法:采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得。色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18 (2);检测波长:260 nm;流速:1 mL.mirT1 ;柱温:35 °C;进样量:10 μ L ;梯度洗脱条件:0-5min，体积分数为2%乙腈等度洗脱，5-9min线性增加至9%乙腈，9-15min线性增加至11%乙腈，15_25min线性增加至40%乙腈。上述步骤(3)测定法中包括线性关系测定；即分别精密吸取混合对照品储备液5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷分别为0.25 μ g.mr\0.60 μ g.mL'8.75 μ g.mL'10.00 μ g.mL \20.00 μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.00 μ g.mL \25.00 μ g.mL \5.00μ g.πιΓ\10.00 Ug -πιΓ1的混合溶液，依次加水稀释至刻度，得系列标准溶液，HPLC测定。上述步骤(3)测定法中包括精密度测定；即精密吸取混合标准品溶液:胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷的浓度分别为0.125,0.300、
4.375,5.000、10.00,0.625,2.500、12.50,2.500,5.000 μ g.mL-1 的混合溶液，在色谱条件下，连续进样6次,记录峰面积。上述步骤(3)测定法中包括重复性实验；即取苦碟子注射液，平行实验6次，制成供试溶液，在色谱条件下，分别测定6次，计算每种对照品的色谱峰面积。上述步骤(3)测定法中包括稳定性实验；即取苦碟子注射液，室温放置，于0、2、4、
6、8、12 h进样,在色谱条件下,进样分析,记录峰面积。上述步骤(3)测定法中包括回收率实验；即精密量取苦碟子注射液5.0 mL,平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液5.0 mL,其中胞嘧啶0.14μ g.mL'尿嘧啶 0.27 μ g.mL—1、胞苷 3.10 μ g.mL'鸟嘌呤 4.60 μ g.mL—1、尿苷 6.00μ g.mL'胸腺嘧啶 1.20 μ g.mL'腺嘌呤 2.90 μ g.mL'鸟苷 7.2 μ g.mL'胸苷 1.60μ g.mL'腺苷5.00 μ g.mL-1摇勻,在色谱条件下,进样分析,记录峰面积,计算加样回收率。本发明的优点是:1、实验结果表明，核苷类成分在乙腈-水梯度洗脱系统的分离效果更好，且HPLC-DAD法操作简便，核苷类成分在适宜的色谱条件下可以获得理想的分离效果，在本发明选定的色谱条件下，苦碟子注射液中核苷类物质的色谱峰15min内既可完成分析，分离效果良好，该法测定快速、结果准确，稳定性良好，是一种测定苦碟子注射液中核苷类成分的可靠方法，可为苦碟子注射液品质评价体系提供实验依据。2、通过对18批苦碟子注射液中核苷类成分的分析，结果表明，该注射液中含有9种核苷，其中含量较高的有鸟苷、尿苷、腺苷、鸟嘌呤及胞苷等，不同批次注射液中各核苷含量具有一定的差异，但与临床疗效相关的腺苷批间差异较小。说明以核苷为指标的注射剂生产工艺较为稳定，也提示应对其他核苷类成分开展相关研究，以期对苦碟子注射液的质量及安全性进行更加全面的评价。3、本发明所建立同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分的分析方法简单、重复性好，准确可靠，可为苦碟子注射液质量控制提供依据。下面将结合附图、实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
图1是本发明混合对照品溶液HPLC谱图。图2是本发明供试品溶液HPLC谱图。
具体实施方式
实施例HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法:
I仪器与试药
1.1仪器
Waters-e2695-HPLC系统(包括四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，2998光电二极管阵列检测器PDA, Empower 2色谱工作站)，Sartorius ΒΤ12 型分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，KH 2200Β型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)
1.2试药
胞嘧啶对照品(批号:C94998BGF0，天津希恩思生化科技有限公司)；尿嘧啶对照品(批号:100469-200401，中国药品生物制品检定所)；胞苷对照品(批号:101056874，SIGMA公司)；鸟嘌呤对照品(批号:HCCTH-BG，上海化成工业发展有限公司)；尿苷对照品(批号:1001290893，SIGMA公司);胸腺嘧啶对照品(批号:T55620BGF0，天津希恩思生化科技有限公司);腺嘌呤对照品(批号:A73241BGF0，天津希恩思生化科技有限公司);鸟苷对照品(批号:G24210BGQ0，天津希恩思生化科技有限公司)；胸苷对照品(批号:T55590BGF0，天津希恩思生化科技有限公司)；腺苷对照品(批号:110879-200202，中国药品生物制品检定所)，所有对照品纯度经HPLC峰面积归一化法计算大于99%。苦碟子注射液(通化华夏药业有限责任公司提供，批号:120311T、120312T、120314Τ、120315Τ、120316Τ、120317Τ、129318Τ、120319Τ、120312、120532、120109、I10601、111011、120438、120625、120209、111105、111218)。乙腈(色谱纯，SIGMA 公司)，甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，超纯水，其他试剂均为分析纯。2方法与结果
2.1混合对照品溶液的配制
分别精密称取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷对照品适量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL'鸟嘌呤 20.00 μ g.mL'尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鸟苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合对照品溶液，超声溶解，摇匀，即得混合对照品储备液。2.2供试品溶液的配制
取苦碟子注射液，采用0.45 ym微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测。2.3色谱条件
色谱柱:Diamonsil C18 (2) (200 mmX4.6 mm, 5 μ m);检测波长:260 nm;流速:1mL.mirT1 ;柱温:35 V ;进样量:10 μ L ;梯度洗脱条件:0_5min，体积分数为2%乙腈等度洗脱，5-9min线性增加至9%乙腈，9_15min线性增加至11%乙腈，15_25min线性增加至40%乙腈。2.4专属性实验
在“2.3”项色谱条件下，胞嘧啶，尿嘧啶，胞苷，鸟嘌呤，尿苷，胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟苷，胸苷，腺苷的混合对照品溶液和苦碟子注射液供试品溶液的HPLC谱图见图1、2，混合对照品及苦碟子注射液供试品中10种核苷类成分达到基线分离。参见图1、2，I胞嘧啶，2尿嘧啶，3胞苷，4鸟嘌呤，5尿苷，6胸腺嘧啶，7腺嘌呤，8鸟苷，9胸苷，10腺苷。2.5线性关系考察
分别精密吸取混合对照品储备液(胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷分别为 0.50 μ g.ιιιΓ\ .20 μ g.mL'17.50 μ g.mL'20.00Ug* mL_1>40.00 μ g.mL_1>2.50 μ g.mL—1、10.00 μ g.mL'50.00 μ g.mL—1、10.00yg.mdOO μ g mr1的混合溶液)5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷分别为0.25 μ g mL—1、
0.60 μ g.mL \8.75 μ g.mL \ 10.0O μ g.mL \20.0O μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.0Oμ g.mL'25.0O μ g.mL_1>5.0O μ g.mL—1、10.0O μ g.mL—1 的混合溶液,依次加水稀释至刻度，得系列标准溶液，HPLC测定。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得出各个化合物的回归方程及相关系数， 结果见表I。结果表明，10种核苷类成分在线性范围内线性关系良好。表I 10种核苷类成分的回归方程、相关系数及线性范围
权利要求
1.一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤如下: (O混合对照品溶液的配制: 分别精密称取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷对照品适量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL-1、鸟嘌呤 20.00 yg iL-1、尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鸟苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合对照品溶液，超声溶解，摇匀，即得混合对照品储备液； (2)供试品溶液的配制: 取苦碟子注射液，采用0.45 μ m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测； (3)测定法:采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得； 色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18 (2);检测波长:260 nm ;流速:1 mL *min_1 ;柱温:35°C;进样量:10 μ L ;梯度洗脱条件:0-5min，2%乙腈等度洗脱，5_9min线性增加至9%乙腈，9-15min线性增加至11%乙腈，15_25min线性增加至40%乙腈。
2.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤(3)测定法中包括线性关系测定；即分别精密吸取混合对照品储备液5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷分别为0.25 yg*mr\0.60 μ g.mL'8.75 μ g.mL'10.00 μ g.mL \20.00 μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.00 μ g.mL \25.00 μ g.mL \5.00μ g.πιΓ\10.00 Ug -πιΓ1的混合溶液，依次加水稀释至刻度，得系列标准溶液，HPLC测定。
3.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤(3)测定法中包括精密度测定；即精密吸取混合标准品溶液:胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷的浓度分别为0.125、0.300,4.375,5.000、10.00,0.625,2.500、12.50,2.500,5.000 μ g.ml/1 的混合溶液，在色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积。
4.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤(3)测定法中包括重复性实验；即取苦碟子注射液，平行实验6次，制成供试溶液，在色谱条件下，分别测定6次，计算每种对照品的色谱峰面积。
5.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤(3)测定法中包括稳定性实验；即取苦碟子注射液，室温放置，于0、2、4、6、8、12 h进样,在色谱条件下,进样分析,记录峰面积。
6.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其特征在于步骤(3)测定法中包括回收率实验；即精密量取苦碟子注射液5.0 mL,平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液5.0 mL，其中胞嘧啶0.14μ g.mL'尿嘧啶 0.27 μ g.mL—1、胞苷 3.10 μ g.mL'鸟嘌呤 4.60 μ g.mL—1、尿苷 6.00μ g.mL'胸腺嘧啶 1.20 μ g.mL'腺嘌呤 2.90 μ g.mL'鸟苷 7.2 μ g.mL'胸苷 1.60μ g.mL'腺苷5.00 μ g.mL-1摇勻,在色谱条件下,进样分析,记录峰面积,计算加样回收率。
全文摘要
本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法。属于中药成分分析领域。其步骤如下(1)混合对照品溶液的配制。2)供试品溶液的配制。(3)测定法:采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得。色谱条件色谱柱DiamonsilC18(2)；检测波长260nm；流速1mL·min-1；柱温35℃；进样量10μL；梯度洗脱条件0-5min，体积分数为2%乙腈等度洗脱，5-9min线性增加至9%乙腈，9-15min线性增加至11%乙腈，15-25min线性增加至40%乙腈。本发明所建立同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分的分析方法简单、重复性好，准确可靠，可为苦碟子注射液质量控制提供依据。
文档编号G01N30/02GK103149301SQ20131007106
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者刘睿, 马思萌, 任晓亮, 李遇伯, 张艳军 申请人:通化华夏药业有限责任公司